基因工程 第五章 重組基因?qū)胧荏w細胞

1、第五章第五章 重組基因?qū)胧荏w細胞重組基因?qū)胧荏w細胞5.1 受體細胞受體細胞受體細胞受體細胞(receptor cell)又稱為宿主細胞或寄主細胞又稱為宿主細胞或寄主細胞(host cell)等，從實等，從實驗技術(shù)上講是能攝取外源驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的并使其穩(wěn)定維持的細胞；從實驗目的上講是有應用價值和理論研究細胞；從實驗目的上講是有應用價值和理論研究價值的細胞。價值的細胞。作為基因工程的宿主細胞必須具備以下特性：作為基因工程的宿主細胞必須具備以下特性：便于重組便于重組DNA分子的導入；分子的導入；能使重組能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中；分子穩(wěn)定存在于細胞中；便于重組

2、體的篩選；便于重組體的篩選；遺傳性穩(wěn)定高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長；遺傳性穩(wěn)定高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長；安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染；安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積累，或促進外源基有利于外源基因蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積累，或促進外源基因的高效分泌表達。因的高效分泌表達。在遺傳密碼的應用上無明顯偏倚性；在遺傳密碼的應用上無明顯偏倚性；具有較好的翻譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達；具有較好的翻譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達；在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應用價值。在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應用價值。基因

3、工程中常用的受體細胞類型：基因工程中常用的受體細胞類型：原核生物細胞原核生物細胞真核生物細胞真核生物細胞真菌細胞真菌細胞植物細胞植物細胞動物細胞動物細胞原核生物細胞原核生物細胞優(yōu)點：優(yōu)點：1.大部分原核生物細胞無纖維素組成的堅硬細胞壁，便于大部分原核生物細胞無纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源外源DNA的進入。的進入。2.沒有核膜，染色體沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，為外源沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，為外源DNA與裸露的染色體與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩。重組減少了麻煩。3.原核生物多為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，原核生物多為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)

4、簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。4.基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠體基基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。缺點：缺點：1.原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復性系統(tǒng)，原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復性系統(tǒng)，即使真核生物基因能得到表達，得到的多是無特異性空即使真核生物基因能得到表達，得到的多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。2.原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)

5、，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用?；蛄姿峄刃揎椬饔?。3.原核細胞內(nèi)源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表達產(chǎn)物原核細胞內(nèi)源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表達產(chǎn)物不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。至今被用作受體菌的原核生物有至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌枯草桿菌、藍細菌等。等。一、大腸桿菌受體細胞一、大腸桿菌受體細胞大腸桿菌屬大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為，它是目前為止研究得最為詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因

6、工程研究和應用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系工程研究和應用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。統(tǒng)。優(yōu)點：優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點：缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導致人體熱原反應。致人體熱原反應。二、枯草桿菌受體細胞二、枯草桿菌受體細胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌。優(yōu)點：優(yōu)點：1.枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將具有表枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將具有表達的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)

7、基中，大大簡化了蛋白表達產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，達產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性。天然的構(gòu)象和生物活性。2.枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌?；蚬こ叹?。3.枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)。4.枯草桿菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、枯草桿菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點。分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點

8、。應用：應用：已成功的用于表達人的已成功的用于表達人的干擾素、白細胞介素、干擾素、白細胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒VPI抗原等?？乖取Ｈ?、藍細菌（藍藻）三、藍細菌（藍藻）藍藻藍藻又稱又稱藍綠藻藍綠藻或或藍細菌藍細菌，它含有葉綠素，它含有葉綠素a(缺乏葉缺乏葉綠素綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)和藻膽素，具有光合系統(tǒng) (PS ) 和光合系統(tǒng)和光合系統(tǒng) (PS )、能進行光合作用，但它又、能進行光合作用，但它又具有細菌的特征，無具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，染色體裸露，是一種典細胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，染色體裸露，是一種典型的原

9、核生物。型的原核生物。藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點，具體表現(xiàn)在：點，具體表現(xiàn)在：基因組為原核型，除了裸露的染色體基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體外，不含葉綠體DNA和線粒體和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA的檢的檢測。測。細胞壁屬細胞壁屬G，主要由肽聚糖組成，便于外源，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。的轉(zhuǎn)化。營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機鹽、水和、無機鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。

10、適宜的溫度就能滿足生長需要。多種藍藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。多種藍藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。藍藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍藻無毒，早已用作食物或保健品，藍藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒在此基礎上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍藻，就可達到錦上添花的效果。藍藻，就可達到錦上添花的效果。真核生物細胞真核生物細胞一、真菌受體細胞一、真菌受體細胞真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控機制以及蛋白質(zhì)的真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控機制以及蛋白質(zhì)的加工與分

11、泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細胞表達高等動加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細胞表達高等動植物基因具有原核生物細胞無法比擬的優(yōu)點。植物基因具有原核生物細胞無法比擬的優(yōu)點。酵母菌細胞酵母菌細胞是單細胞真核微生物，外源真核基因最理想的表達系統(tǒng)。是單細胞真核微生物，外源真核基因最理想的表達系統(tǒng)。優(yōu)點：優(yōu)點：1.酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，其基因表達調(diào)控機酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，其基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作相對比較簡單。理比較清楚，遺傳操作相對比較簡單。2.具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。3.不含有特異性病毒，不產(chǎn)生

12、毒素。不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素。4.培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。5.能使外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和能使外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。加工。二、植物受體細胞二、植物受體細胞優(yōu)點：優(yōu)點：全能性，全能性，即一個分離的活細胞在合適的培即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。植株或品系。 缺點：缺點：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，

13、植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組不利于攝取重組DNA分子。分子?，F(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、現(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟作物和擬南芥等模式植物。馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟作物和擬南芥等模式植物。 三、動物受體細胞：三、動物受體細胞：優(yōu)點：優(yōu)點：1.能識別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪切和加工成熟的能識別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪切和加工成熟的mRNA。2.真核基因的表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產(chǎn)物具有較好真核基因的表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性，約為酵母細胞的的蛋白質(zhì)免疫原性，約為酵

14、母細胞的1620倍。倍。3.易被重組易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性。4.經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細胞可將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細胞可將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。成本低。缺點：缺點：組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，難度較大。組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，難度較大。目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟動物和鼠、目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟動物和鼠、猴等實驗動物，主要用途在于大規(guī)模表達生產(chǎn)天然狀態(tài)的復雜蛋白質(zhì)或猴等實驗動物，主要用途在于大規(guī)模表達生產(chǎn)天然狀態(tài)的復雜蛋白質(zhì)或動物疫苗、動物品種

15、的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。常用的動物受體細胞有小鼠常用的動物受體細胞有小鼠L細胞、細胞、Hele細胞、猴腎細胞和中國倉鼠卵細胞、猴腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞巢細胞(CHO)等。以動物細胞，尤其是哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)等。以動物細胞，尤其是哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點。點。 5.2.1 5.2.1 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNADNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉(zhuǎn)

16、化。程稱之為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由Griffith于于1928年在肺炎雙球年在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的。菌中發(fā)現(xiàn)的。 5.2 5.2 重組重組DNADNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細胞分子轉(zhuǎn)入原核生物細胞目目 錄錄細菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)細菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體是受體菌直接吸收來自供體菌的游離菌的游離DNADNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細胞中片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應遺傳性狀的過程。從而獲得供體菌的相應遺傳性狀的過程。以革蘭氏陽性細菌為例，細菌轉(zhuǎn)化的一種可以革蘭氏陽性細菌為例，細菌轉(zhuǎn)化的一種可能

17、機制包括如下基本步驟：能機制包括如下基本步驟：細菌感受態(tài)的形成。細菌感受態(tài)的形成。當轉(zhuǎn)化因子接近細菌細胞當轉(zhuǎn)化因子接近細菌細胞時受體細胞分泌一種小分子質(zhì)量的激活蛋白，又時受體細胞分泌一種小分子質(zhì)量的激活蛋白，又稱為感受因子，能誘導使細菌胞壁部分溶解，局部稱為感受因子，能誘導使細菌胞壁部分溶解，局部暴露出細胞膜上的暴露出細胞膜上的DNADNA結(jié)合蛋白和核酸酶等，此時結(jié)合蛋白和核酸酶等，此時細菌細胞處于感受態(tài)，極易接納周圍環(huán)境中轉(zhuǎn)化因細菌細胞處于感受態(tài)，極易接納周圍環(huán)境中轉(zhuǎn)化因子以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。子以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化因子的吸收。轉(zhuǎn)化因子的吸收。受體菌細胞膜上的受體菌細胞膜上的DNADNA結(jié)結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)

18、化因子的雙鏈合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNADNA結(jié)構(gòu)持異性結(jié)結(jié)構(gòu)持異性結(jié)合，然后激活鄰近的核酸酶，將雙鏈合，然后激活鄰近的核酸酶，將雙鏈DNADNA分子分子中的一條鏈逐步降解，同時將另一條鏈逐步中的一條鏈逐步降解，同時將另一條鏈逐步轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)。轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)。 整合復合物前體的形成。整合復合物前體的形成。進入受體細胞的單鏈進入受體細胞的單鏈DNADNA與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復合與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復合物前體，它能有效地保護單鏈物前體，它能有效地保護單鏈DNADNA免受各種胞內(nèi)核免受各種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導至受體菌染色體酸酶的降解，并將其引導至受體菌染色

19、體DNADNA處。處。 單鏈單鏈DNADNA轉(zhuǎn)化因子的整合。轉(zhuǎn)化因子的整合。整合復合物前體中的整合復合物前體中的單鏈單鏈DNADNA片段可以通過同源重組，置換受體細胞染片段可以通過同源重組，置換受體細胞染色體色體DNADNA的同源區(qū)域形成異源雜合雙鏈的同源區(qū)域形成異源雜合雙鏈DNADNA結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 轉(zhuǎn)化子的形成。轉(zhuǎn)化子的形成。受體菌染色體組進行復制，雜合受體菌染色體組進行復制，雜合區(qū)段亦隨之進行半保留復制，當細胞分裂后，該染區(qū)段亦隨之進行半保留復制，當細胞分裂后，該染色體發(fā)生分離，形成一個新的轉(zhuǎn)化子。色體發(fā)生分離，形成一個新的轉(zhuǎn)化子。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進大腸桿菌是一種

20、革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應用中，轉(zhuǎn)化受體菌細胞的正是在基因工程研究和應用中，轉(zhuǎn)化受體菌細胞的正是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNADNA分子，而非分子，而非來自供體菌的游離來自供體菌的游離DNADNA片段片段( (轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子) )。因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實驗中，很少采取自然轉(zhuǎn)化因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實驗中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法

21、受態(tài)細胞，然后進行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法之一是之一是CaCa2+2+誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。（1 1） CaCa2+2+誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法CaCa2+2+誘導誘導DNADNA對大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化的可能原因：對大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化的可能原因：在在00的的CaclCacl2 2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時CaclCacl2 2使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。受

22、態(tài)。CaCa2+2+能與加入的能與加入的DNADNA分子結(jié)合，形成抗分子結(jié)合，形成抗DNADNA酶酶(DNase(DNase) )的羥的羥基基- -磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。當當4242熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNADNA分子提供分子提供了進入細胞的通道。了進入細胞的通道。 該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細胞。對這種感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，每受態(tài)

23、細胞。對這種感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，每g g質(zhì)質(zhì)粒粒DNADNA可以獲得可以獲得5 510106 62 2l0l07 7個轉(zhuǎn)化茵落，完全可個轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要。以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要。 MgMg2+2+對對DNADNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用MgclMgcl2 2與與CaclCacl2 2共同處理大腸桿菌細胞，可以提高共同處理大腸桿菌細胞，可以提高DNADNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)(DMSO)和二硫蘇糖和二硫蘇糖醇醇(DDT)(DDT)等進一步處理細胞，能誘導高頻感受態(tài)細等進一步處理細

24、胞，能誘導高頻感受態(tài)細胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高10010010001000倍，且對大倍，且對大小質(zhì)粒分子均可進行有效的轉(zhuǎn)化。小質(zhì)粒分子均可進行有效的轉(zhuǎn)化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。很少采用。 DNADNA分子進入大腸桿菌受體細胞的機制分子進入大腸桿菌受體細胞的機制 一般認為只有一般認為只有雙鏈閉環(huán)或開環(huán)的質(zhì)粒雙鏈閉環(huán)或開環(huán)的質(zhì)粒DNADNA分子才能分子才能轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化，而，而線形線形DNADNA分子不能獲得轉(zhuǎn)化子分子不能獲得轉(zhuǎn)化子。因此，環(huán)。因此，環(huán)狀狀DNADNA分子中混雜線形分子中混雜線形DNADN

25、A分子，會影響環(huán)狀分子，會影響環(huán)狀DNADNA分分子的轉(zhuǎn)化效率。子的轉(zhuǎn)化效率。也有人認為吸附在受體細胞表面上的是雙鏈也有人認為吸附在受體細胞表面上的是雙鏈DNADNA，但卻以單鏈但卻以單鏈DNADNA進入細胞，這與革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)進入細胞，這與革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化過程相似?；^程相似。轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設以下幾種對照處理：子的出現(xiàn)，因此須設以下幾種對照處理： DNADNA對照處理。對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用轉(zhuǎn)化處理液中用0.2ml0.2ml無菌水代替無菌水代替0.2m10.2m1感感受態(tài)細胞，檢驗受態(tài)細胞，檢驗D

26、NADNA溶液是否染菌。溶液是否染菌。 感受態(tài)細胞對照處理。感受態(tài)細胞對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用轉(zhuǎn)化處理液中用0.1mlNTE0.1mlNTE緩沖液緩沖液代替代替0.1m1DNA0.1m1DNA溶液，檢驗感受態(tài)細胞是否染菌。溶液，檢驗感受態(tài)細胞是否染菌。 感受態(tài)細胞有效性對照處理。感受態(tài)細胞有效性對照處理。在在0.2ml0.2ml感受態(tài)細胞中加入感受態(tài)細胞中加入0.1ml0.1ml已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細胞的質(zhì)粒已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細胞的質(zhì)粒DNADNA。 （2 2）電穿孔轉(zhuǎn)化法）電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔

27、膜上進行電穿孔(electro poration(electro poration) )形成可逆的形成可逆的瞬間通道，從而促進外源瞬間通道，從而促進外源DNADNA的有效吸收。的有效吸收。 電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源源DNADNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每ugDNAugDNA可以得到可以得到10109 910101010轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子。研究表明，當電場強度和脈沖時間的組合方式導致研究表明，當電場強度和脈沖時間的組合方式導致50507070細菌死亡時，轉(zhuǎn)化水平達到最高。細菌死亡時，轉(zhuǎn)

28、化水平達到最高。 用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制備容易得多當細菌生長到對數(shù)中期后予以冷卻、備容易得多當細菌生長到對數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用的離子強度，并用1010甘油重懸細胞，使其細胞濃甘油重懸細胞，使其細胞濃度為度為3 3l0l01010個個m1m1。分裝，在干冰上速凍后置于。分裝，在干冰上速凍后置于7070貯存。這樣，每小份細胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，貯存。這樣，每小份細胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達有效期達6 6個月以上。個月以上。 電穿

29、孔轉(zhuǎn)化須在低溫下電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(0(04)4)進行，轉(zhuǎn)化效率要進行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約比在室溫下操作提高約100100倍。倍。 （3 3）三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌）三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌簡稱為簡稱為三親本雜交轉(zhuǎn)移法三親本雜交轉(zhuǎn)移法，是基于非接合型質(zhì)粒的，是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種遷移作用而建立的一種DNADNA轉(zhuǎn)化方式適用于那些難轉(zhuǎn)化方式適用于那些難以采用以采用CaCa2+2+誘導轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。誘導轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。 非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所須的全部基因，不能象接合

30、型質(zhì)粒那樣在宿主細胞須的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果在宿主細胞中存在另外一種溶間自我轉(zhuǎn)移。但如果在宿主細胞中存在另外一種溶合性的接合型質(zhì)粒（即合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒輔助質(zhì)粒），非接合型質(zhì)粒），非接合型質(zhì)粒通常也會被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的通常也會被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用遷移作用。 接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強，轉(zhuǎn)移過接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著宿主細胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難程中經(jīng)常伴隨著宿主細胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載

31、體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是以作為基因工程載體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒在非接合型質(zhì)粒或缺失了接合轉(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒的基礎上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒DNADNA分子也不能直接接進分子也不能直接接進行接合轉(zhuǎn)化而只能通過其遷移作用來完成。行接合轉(zhuǎn)化而只能通過其遷移作用來完成。首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體組質(zhì)粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作

32、用，將重組質(zhì)粒導入受體細胞。組質(zhì)粒導入受體細胞。整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3 3種有關的細菌菌株，種有關的細菌菌株，即即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNADNA的供的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此，因此稱稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。（4 4）轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素）轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率是指是指DNADNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率，分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率，有兩種表示方式：有兩種表示方式：一是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的一是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與

33、用于轉(zhuǎn)化處理的DNADNA分子數(shù)或質(zhì)量的比分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示；率表示；二是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細胞數(shù)的比率表二是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細胞數(shù)的比率表示。示。 用每單位質(zhì)量的用每單位質(zhì)量的DNADNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)來表示，分子獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)來表示，難以反映分子大小與轉(zhuǎn)化率之間的關系。難以反映分子大小與轉(zhuǎn)化率之間的關系。 以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細胞數(shù)為基數(shù)來計算以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細胞數(shù)為基數(shù)來計算轉(zhuǎn)化率，首先必須通過菌液轉(zhuǎn)化率，首先必須通過菌液ODOD值測定或細菌值測定或細菌計數(shù)，計算出用于制備感受態(tài)細胞的受體菌計數(shù)，計算出用于制備感受態(tài)細胞的受體菌總數(shù)。然后計算轉(zhuǎn)化子與

34、受體菌的比率?？倲?shù)。然后計算轉(zhuǎn)化子與受體菌的比率。 影響轉(zhuǎn)化率的因素影響轉(zhuǎn)化率的因素分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNADNA分子轉(zhuǎn)化率較高分子轉(zhuǎn)化率較高，分子質(zhì)量，分子質(zhì)量較大的重組質(zhì)粒較大的重組質(zhì)粒DNADNA分子轉(zhuǎn)化率較低，對于大于分子轉(zhuǎn)化率較低，對于大于30kb30kb的重的重組質(zhì)粒則很難進行轉(zhuǎn)化。組質(zhì)粒則很難進行轉(zhuǎn)化。 組成重組組成重組DNADNA分子的載體類型及其構(gòu)型分子的載體類型及其構(gòu)型。與受體細胞親和與受體細胞親和性性較強的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體，較強的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體，而處于而處于自然雙螺旋閉環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體自然雙螺旋閉

35、環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體比開環(huán)結(jié)構(gòu)成線性比開環(huán)結(jié)構(gòu)成線性結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體有更高的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體有更高的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)體外酶切、酶連操作體外酶切、酶連操作后的載體后的載體DNADNA或重組或重組DNADNA分子分子由于空間構(gòu)象難以恢復，轉(zhuǎn)化由于空間構(gòu)象難以恢復，轉(zhuǎn)化率一般要比具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。率一般要比具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。重組重組DNADNA分子的濃度和純度分子的濃度和純度。在。在10ng10ng100u1100u1以下的以下的DNADNA濃濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與DNADNA分子數(shù)成正比關系。分子數(shù)成正比關系。 同一重組質(zhì)粒同一重組質(zhì)粒DNADNA分

36、子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細胞，轉(zhuǎn)化分子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細胞，轉(zhuǎn)化率不同率不同受體細胞的選擇受體細胞的選擇對于重組對于重組DNADNA分子的轉(zhuǎn)化分子的轉(zhuǎn)化也是極為重要。也是極為重要。 前述三種轉(zhuǎn)化方法中，最佳轉(zhuǎn)化率以電穿孔法最高前述三種轉(zhuǎn)化方法中，最佳轉(zhuǎn)化率以電穿孔法最高（10108 810101010）；）；CaCa2+2+誘導轉(zhuǎn)化法居中（誘導轉(zhuǎn)化法居中（10107 710108 8）；而）；而三親本雜交轉(zhuǎn)移法最低（三親本雜交轉(zhuǎn)移法最低（10104 410105 5），但它適于前兩），但它適于前兩種方法難以轉(zhuǎn)化的受體菌。種方法難以轉(zhuǎn)化的受體菌。 在轉(zhuǎn)化操作方而，受體細胞的預處理或感受態(tài)細胞在轉(zhuǎn)化操作

37、方而，受體細胞的預處理或感受態(tài)細胞的制備對轉(zhuǎn)化率影響最大。的制備對轉(zhuǎn)化率影響最大。如如CaCa2+2+誘導大腸桿菌轉(zhuǎn)化法，菌齡、誘導大腸桿菌轉(zhuǎn)化法，菌齡、CaclCacl2 2處理時間、處理時間、感受態(tài)細胞的保存期以及熱激時間均是重要的影響感受態(tài)細胞的保存期以及熱激時間均是重要的影響因素。因素。電穿孔轉(zhuǎn)化法中，對受體細胞進行冰凍甘油預處理電穿孔轉(zhuǎn)化法中，對受體細胞進行冰凍甘油預處理后的轉(zhuǎn)化率，要比不經(jīng)此預處理的轉(zhuǎn)化率高后的轉(zhuǎn)化率，要比不經(jīng)此預處理的轉(zhuǎn)化率高1010100100倍。倍。 5.2.2 5.2.2 重組重組噬菌體噬菌體DNADNA分子轉(zhuǎn)導大腸桿菌分子轉(zhuǎn)導大腸桿菌 將重組將重組噬菌體噬

38、菌體DNADNA分子直接導入受體細胞中的過程，分子直接導入受體細胞中的過程，稱為稱為轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染。 將重組將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子導入大腸桿菌受體細胞的常分子導入大腸桿菌受體細胞的常規(guī)方法是規(guī)方法是轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)導操作。操作。轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)導(transduction)(transduction)是指通過是指通過噬菌體噬菌體( (病毒病毒) )顆粒顆粒感染宿主細胞的途徑把外源感染宿主細胞的途徑把外源DNADNA分子轉(zhuǎn)移到受體細分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。胞內(nèi)的過程。 具有感染能力的具有感染能力的噬菌體顆粒除含有噬菌體顆粒除含有噬菌體噬菌體DNADNA分分子外，還包括子外，還包括外被蛋白外被蛋白。以噬菌體

39、顆粒感染受體細胞，首先必須對重組以噬菌體顆粒感染受體細胞，首先必須對重組A A噬噬菌體菌體DNADNA分子進行分子進行體外包裝體外包裝 。體外包裝，體外包裝，是指在體外模擬是指在體外模擬噬菌體噬菌體DNADNA分子在受體分子在受體細胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應過程，將重組細胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應過程，將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子包裝為成熟的具有感染能力的分子包裝為成熟的具有感染能力的噬噬菌體顆粒的技術(shù)。菌體顆粒的技術(shù)。 基本原理，根據(jù)基本原理，根據(jù)噬菌體噬菌體DNADNA體內(nèi)包裝的途徑，分別體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失獲得缺失D D包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變株和缺失噬菌體突

40、變株和缺失E E包裝蛋包裝蛋白的白的噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包裝裝噬菌體噬菌體DNADNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失提取缺失D D蛋白的包裝物（含蛋白的包裝物（含E E蛋白蛋白) )和缺失和缺失E E蛋白的蛋白的包裝物包裝物( (含含D D蛋白蛋白) )，兩者混合后就能包裝，兩者混合后就能包裝噬菌體噬菌體DNADNA。 噬菌體噬菌體DNADNA體外包裝的主要過程體外包裝的主要過程制備包裝物制備包裝物。 首先，須培養(yǎng)兩種溶原菌首先，須培養(yǎng)兩種溶原菌 第二，誘導溶菌生長第二，誘導溶菌生長 第三，收集

41、和貯存包裝物。第三，收集和貯存包裝物。體外包裝體外包裝。制備制備噬菌體噬菌體DNADNA混合液混合液。第一次包裝。第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r，細胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物剛?cè)诨瘯r，細胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。包裝物可立即用于包裝。 第二次包裝第二次包裝。進行第二次包裝，可提高包裝效率。進行第二次包裝，可提高包裝效率2 25 5倍，倍，加入蛋白酶可降低包裝反應液的黏度，便于包裝反應的加入蛋白酶可降低包裝反應液的黏度，便于包裝反應的進行。進行。去除細胞屑。去除細胞屑。第二次包裝后，在反應液中加入第二次包裝后，在反應液中加入SMSM溶液和溶液和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌

42、體顆氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。粒。經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆?？梢愿腥具m當?shù)氖荏w菌經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆粒可以感染適當?shù)氖荏w菌細胞，并將重組細胞，并將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子高效導入細胞中。分子高效導入細胞中。在良好的體外包裝反應條件下，每在良好的體外包裝反應條件下，每g g野生型的野生型的噬菌體噬菌體DNADNA可形成可形成10108 810109 9的的pfupfu。對于重組的。對于重組的噬噬菌體菌體DNADNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達到但仍可達到10106 610107 7pfupfu，完全可以滿足構(gòu)

43、建真核基，完全可以滿足構(gòu)建真核基因組基因文庫的要求。因組基因文庫的要求。5.2.3 5.2.3 受體細胞的選擇受體細胞的選擇 野生型的大腸桿菌不是理想的受體細胞，野生型的大腸桿菌不是理想的受體細胞，因為自身因為自身具有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致具有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性。因此必須通過適當?shù)恼T變手段對野生型大腸病性。因此必須通過適當?shù)恼T變手段對野生型大腸桿菌進行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞桿菌進行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞的突變菌株。通常應從以下幾個方面加以考慮：的突變菌株。通常應從以下幾個方面加以考慮：限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)這是導致外

44、源重組這是導致外源重組DNADNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率低下的主要轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率低下的主要原因之一。原因之一。應選用應選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細胞限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細胞，以提高外源以提高外源DNADNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率。分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率。進一步進一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細胞既不，則受體菌細胞既不能修飾，也不能限制外源能修飾，也不能限制外源DNADNA分子，更便于重組分子，更便于重組DNADNA分子的多種基因操作。分子的多種基因操作。 重組系統(tǒng)重組系統(tǒng) 進入野生型細胞的外源進入野生型細胞的外源DNADNA分子能分子能自發(fā)自發(fā)地與染色體地與染

45、色體DNADNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應由發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應由recrec基因家族的編碼基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。產(chǎn)物所控制。RecARecA蛋白能促進蛋白能促進DNADNA分子之間的同源分子之間的同源聯(lián)會和聯(lián)會和DNADNA單鏈交換，單鏈交換，recArecA基因的突變使大腸桿菌基因的突變使大腸桿菌細胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至細胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至1010-6-6。recBrecB、recCrecC和和recDrecD基因的突變也可以降低遺傳重組基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率。的發(fā)生頻率。因此因此受體細胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳受體細胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型

46、表型，基因型為，基因型為recArecA- -、recBrecB- -或或recCrecC- -等，有些大腸等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。 易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細胞壁的可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細胞壁的通透性及細胞膜的特異吸附性，從而提高其通透性及細胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導形成感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導形成感受態(tài)細胞的菌株作為受體菌細胞細胞的菌株作為受體菌細胞有明顯的選擇性差異有明顯的選擇性差異遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使遺傳表型差異大，可便于

47、重組子的檢測。通常是使受體細胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標記互補的遺傳受體細胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標記互補的遺傳性狀。性狀。如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有AMPAMP抗性標記基因，則所選用的受體細胞應對這種抗生抗性標記基因，則所選用的受體細胞應對這種抗生素敏感。當重組素敏感。當重組DNADNA分子轉(zhuǎn)入受體細胞后，載體上分子轉(zhuǎn)入受體細胞后，載體上的標記基因賦予受體細胞抗生素的抗性特征，據(jù)此的標記基因賦予受體細胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子?？梢詤^(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。如果受體細胞具有與外源基因表達產(chǎn)物活性互補的如果受體細胞具有與外源

48、基因表達產(chǎn)物活性互補的遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達的轉(zhuǎn)化細遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達的轉(zhuǎn)化細胞。胞。 感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型從安全的角度上考慮，受體細胞不能具有感從安全的角度上考慮，受體細胞不能具有感染寄生性。染寄生性。 5.2.4 5.2.4 重組重組DNADNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞分子轉(zhuǎn)入真核細胞 5.2.4.15.2.4.1重組重組DNADNA分子導入植物細胞分子導入植物細胞（1 1）農(nóng)桿菌介導的）農(nóng)桿菌介導的TiTi質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌是一類土壤習居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感農(nóng)桿菌是一類土壤習居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，對絕大多數(shù)

49、單子葉植物無染雙子葉植物和裸子植物，對絕大多數(shù)單子葉植物無侵染能力。侵染能力。 具有趨化性的農(nóng)桿菌移向這類植物受傷細胞，并將其具有趨化性的農(nóng)桿菌移向這類植物受傷細胞，并將其TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA的轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)部。根據(jù)這一性質(zhì)，的轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)部。根據(jù)這一性質(zhì)，將待轉(zhuǎn)移的目的基因組入將待轉(zhuǎn)移的目的基因組入TiTi質(zhì)粒載體，通過農(nóng)桿菌介質(zhì)粒載體，通過農(nóng)桿菌介導進入植物細胞，與染色體導進入植物細胞，與染色體DNADNA整合，得以穩(wěn)定維持或整合，得以穩(wěn)定維持或表達。表達。 用于植物基因轉(zhuǎn)化操作的受體通常稱為用于植物基因轉(zhuǎn)化操作的受體通常稱為外植體外植體。選擇選擇適宜的外植體是成功進

50、行遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件適宜的外植體是成功進行遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件，而外，而外植體的選擇主要是依據(jù)受體細胞的轉(zhuǎn)化能力來決定的。植體的選擇主要是依據(jù)受體細胞的轉(zhuǎn)化能力來決定的。目前作為基因轉(zhuǎn)化的外植體材料非常廣泛，涉及到植目前作為基因轉(zhuǎn)化的外植體材料非常廣泛，涉及到植物的各個組織、器官和部位。物的各個組織、器官和部位。 選擇合適的轉(zhuǎn)化外植體選擇合適的轉(zhuǎn)化外植體優(yōu)先考慮葉片、子葉、胚軸等作為外植體材料。優(yōu)先考慮葉片、子葉、胚軸等作為外植體材料。要注意外植體的年齡，應選擇轉(zhuǎn)化能力較強的幼要注意外植體的年齡，應選擇轉(zhuǎn)化能力較強的幼期外植體，同時還要考慮其最佳感受態(tài)時期。期外植體，同時還要考慮其最佳感受態(tài)時期

51、。轉(zhuǎn)化外植體易于組織培養(yǎng)，并有較強的再生能力。轉(zhuǎn)化外植體易于組織培養(yǎng)，并有較強的再生能力。應考慮外植體中易被轉(zhuǎn)化的分生組織感受態(tài)細胞應考慮外植體中易被轉(zhuǎn)化的分生組織感受態(tài)細胞所在的部位及其數(shù)量。切割外植體時應盡可能地所在的部位及其數(shù)量。切割外植體時應盡可能地暴露分生組織細胞，增加農(nóng)桿茵與分生組織的接暴露分生組織細胞，增加農(nóng)桿茵與分生組織的接種面積。種面積。 農(nóng)桿菌接種操作農(nóng)桿菌接種操作 外植體的農(nóng)桿菌接種外植體的農(nóng)桿菌接種就是把農(nóng)桿菌接種到外植體的就是把農(nóng)桿菌接種到外植體的損傷切面。通常采用較低的菌液損傷切面。通常采用較低的菌液ODOD值和較短的浸泡值和較短的浸泡時間來進行外植體的接種。時間來

52、進行外植體的接種。 將接種農(nóng)桿菌后的外植體培養(yǎng)在誘導愈傷組織或不將接種農(nóng)桿菌后的外植體培養(yǎng)在誘導愈傷組織或不定芽固體分化培養(yǎng)基上，隨著外植體的細胞分裂和定芽固體分化培養(yǎng)基上，隨著外植體的細胞分裂和生長，農(nóng)桿菌在外植體切口面也進行著增殖生長，生長，農(nóng)桿菌在外植體切口面也進行著增殖生長，故該培養(yǎng)過程稱之為故該培養(yǎng)過程稱之為農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)。由于農(nóng)桿菌的附著侵染、由于農(nóng)桿菌的附著侵染、T-DNAT-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都是的轉(zhuǎn)移及整合都是在共培養(yǎng)時期內(nèi)完成，因此在共培養(yǎng)時期內(nèi)完成，因此共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握是整個轉(zhuǎn)化的關鍵環(huán)節(jié)是整個轉(zhuǎn)化的關鍵環(huán)節(jié)。其中共培

53、養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化率。其中共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化率有著很大影響，有著很大影響， 與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的外植體表面及淺層組織中常常與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的外植體表面及淺層組織中常常共生有大量農(nóng)桿菌，對外植體的正常生長會產(chǎn)生不共生有大量農(nóng)桿菌，對外植體的正常生長會產(chǎn)生不利影響，必須進行脫菌培養(yǎng)以殺死和抑制農(nóng)桿菌的利影響，必須進行脫菌培養(yǎng)以殺死和抑制農(nóng)桿菌的生長。生長。脫菌培養(yǎng)脫菌培養(yǎng)是指把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生是指把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)生長的過程。目前使用最多素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)生長的過程。目前使用最多的是頭孢霉素。的是頭孢霉素。最后，還須將外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，最后，

54、還須將外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，篩選出被轉(zhuǎn)化的細胞，經(jīng)再分化培養(yǎng)成再生植株。篩選出被轉(zhuǎn)化的細胞，經(jīng)再分化培養(yǎng)成再生植株。 針對不同的外植體以及不同的轉(zhuǎn)化目的而建針對不同的外植體以及不同的轉(zhuǎn)化目的而建立多種轉(zhuǎn)化方法，主要包括立多種轉(zhuǎn)化方法，主要包括葉盤轉(zhuǎn)化法、植葉盤轉(zhuǎn)化法、植株接種共轉(zhuǎn)化法、植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株接種共轉(zhuǎn)化法、植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法、植物懸浮細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體法、植物懸浮細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法等。等。整體植株接種轉(zhuǎn)化法：整體植株接種轉(zhuǎn)化法：人為地在整體植株人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)

55、桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植株體內(nèi)、表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植株體內(nèi)、使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植株體內(nèi)進使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植株體內(nèi)進行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。植株。原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法即取含重組即取含重組TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛再生出新細胞壁的原生質(zhì)體的農(nóng)桿菌同剛剛再生出新細胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌與植物細胞之作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌與植物細胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。用此方法已成功地間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。用此方法已成功地實現(xiàn)了植物細胞的體外轉(zhuǎn)化。實現(xiàn)了植物細胞的

56、體外轉(zhuǎn)化。 懸浮細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法懸浮細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法。此方法類似于原。此方法類似于原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，主要差別是首先建立生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，主要差別是首先建立懸浮細胞系。懸浮細胞系。 (2)DNA (2)DNA的直接轉(zhuǎn)移的直接轉(zhuǎn)移 DNADNA的直接轉(zhuǎn)移的直接轉(zhuǎn)移是指利用植物細胞的生物學特是指利用植物細胞的生物學特件、通過物理化學的方法將外源基因轉(zhuǎn)入受件、通過物理化學的方法將外源基因轉(zhuǎn)入受體植物細胞的技術(shù)。體植物細胞的技術(shù)。為克服農(nóng)桿菌介導法的宿主局限性，巳發(fā)展為克服農(nóng)桿菌介導法的宿主局限性，巳發(fā)展了電擊法了電擊法( (電穿孔法電穿孔法) )、基因槍法、基因槍法( (微彈轟擊微彈轟擊法法)

57、)、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導法，多聚物介導法、花粉管通導法等介導法，多聚物介導法、花粉管通導法等DNADNA直接轉(zhuǎn)移技術(shù)。直接轉(zhuǎn)移技術(shù)。 多聚物介導法多聚物介導法聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等是常、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等是常用的協(xié)助基因轉(zhuǎn)移的多聚物，尤以用的協(xié)助基因轉(zhuǎn)移的多聚物，尤以PEGPEG應用最廣。應用最廣。這些多聚物和二價陽離子這些多聚物和二價陽離子( (如如MgMg2+2+、CaCa2+2+、MnMn2+2+) )與與DNADNA混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆

58、粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)否噬作用而被吸收進入細胞內(nèi)。原生質(zhì)體的內(nèi)否噬作用而被吸收進入細胞內(nèi)。 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等都是、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等都是細胞融合劑。它們可以使細胞膜之間或使細胞融合劑。它們可以使細胞膜之間或使DNADNA與膜與膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連。還可以引形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連。還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，從而有起膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，從而有利于細胞膜間的融合和外源利于細胞膜間的融合和外源DNADNA進入原生質(zhì)體。進入原生質(zhì)體。本法中本法中線性線性DNADNA比環(huán)形比環(huán)形DNADNA有

59、更高的轉(zhuǎn)化效率，而單有更高的轉(zhuǎn)化效率，而單鏈鏈DNADNA又比雙鏈又比雙鏈DNADNA更為有效更為有效。這與質(zhì)粒。這與質(zhì)粒DNADNA分子對分子對大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化完全相反。大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化完全相反。 電穿孔轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法細胞膜的基本成分是磷脂雙分子層，在適當?shù)耐饧蛹毎さ幕境煞质橇字p分子層，在適當?shù)耐饧与妷鹤饔孟?，細胞膜有可能被擊穿，但不會導致細電壓作用下，細胞膜有可能被擊穿，但不會導致細胞致命的傷害，當移去外加電壓后，被擊穿的膜孔胞致命的傷害，當移去外加電壓后，被擊穿的膜孔可被修復。可被修復?激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法此方法是利用此方法是利用直徑很小，能量很高的激光微

60、束能引起細胞膜直徑很小，能量很高的激光微束能引起細胞膜可逆性穿孔可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用激光光源替代熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成用激光光源替代熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細胞周圍的外源膜穿孔，處于細胞周圍的外源DNADNA分子隨之進入細胞。分子隨之進入細胞。這種利用激光微束照射受體細胞實現(xiàn)外源這種利用激光微束照射受體細胞實現(xiàn)外源DNADNA直接導入、整直接導入、整合和表達的技術(shù)稱之為合和表達的技術(shù)稱之為激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法。激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點：操作簡便快捷；基因轉(zhuǎn)移效率