2015版《中國藥典》微生物檢查法控制菌檢查法修訂解析

1、2015年版中國藥典微生物檢查法控制菌檢查法修訂解析一、主要變化1.收載方式USP352010版版中國藥典中國藥典 2015版版中國藥典中國藥典Microbiological Examination of Nonsterile Products:Microbial Enumeration Tests微生物限度檢查法非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法Microbiological Examination of Nonsterile Products:Tests for Specified Microorganisms微生物限度檢查法非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法Microbiological

2、 Examination of Nonsterile Products:微生物限度檢查法非無菌產(chǎn)品微生物限度標準一、主要變化 2.檢查項目2010版版中國藥典中國藥典2015版版中國藥典中國藥典大腸埃希菌（E.coli）大腸菌群（Coliform）Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria沙門菌（Salmonella）沙門菌（Salmonella）銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa）銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa）金黃色葡萄球菌（S.aureus）金黃色葡萄球菌（S.aureus）梭菌（Clostridia）梭菌（Clostridia）白色念珠菌（

3、C.albicans）白色念珠菌（C.albicans）一、主要變化 3、對替代方法的認可：本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。新增內容 4、結果判斷方式：在各控制菌項下，生化實驗和“應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗。”改為較少的生化實驗或“采用其它適宜的方法進一步鑒定?！陛^大變動二、通用要求 控制菌檢查法適用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。 當本法用于檢查非無菌制劑及原、輔料是否符合相應的微生物標準時，應按下列規(guī)定進行檢驗，包括樣品取樣量和結果判斷等。 本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必

4、須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。 供試液制備及實驗環(huán)境要求同非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法。 如果供試品具有抑菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認有效性及對微生物的無毒性。 供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用的中和劑或滅活劑的相容性。三、培養(yǎng)基適用性1、對照培養(yǎng)基 中國藥典2010年版借鑒歐美藥典，引入了培養(yǎng)基適用性檢查以保障微生物限度檢查結果的準確性和可靠性。但是，在藥典修訂過程中，對于歐美藥典中的“之前驗證過的培養(yǎng)基”的采納與否，存在很大爭議，主要集中在兩點： 一、我國藥品微生物實驗室小而分散，數(shù)以千計的企業(yè)

5、和基層藥檢所難以有效地進行參比培養(yǎng)基的驗證、評價工作； 二、在監(jiān)督檢查中，難以有效評估企業(yè)微生物實驗室對參比培養(yǎng)基的驗證情況。 經(jīng)過第九屆藥典委員會微生物專業(yè)委員會的反復討論，提出以統(tǒng)一的、經(jīng)過充分評價和驗證過的對照培養(yǎng)基替代需要由每個實驗室分散評價的“之前驗證過的培養(yǎng)基”。 三、培養(yǎng)基適用性1、對照培養(yǎng)基（1）培養(yǎng)基適用性檢查試驗可用于確定實驗室所使用培養(yǎng)基（包括購置的不同批號的成品培養(yǎng)基、不同批號的脫水培養(yǎng)基干粉、按處方使用不同批次的原材料自行配制培養(yǎng)基等）制備程序（包括水質控制、配制方法、滅菌程序等）、保存條件（溫度、濕度、時間及盛裝培養(yǎng)基的容器條件等）等是否滿足微生物限度檢查用要求。

6、上述影響培養(yǎng)基質量的關鍵點應通過培養(yǎng)基適用性檢查試驗確定，如果其中有任何一控制點發(fā)生變化應重新進行培養(yǎng)基適用性檢查。但是，影響培養(yǎng)基質量的關鍵控制點的變化應掌握在微生物實驗室質量控制的一般原則內，否則，無法通過培養(yǎng)基適用性檢查確定。三、培養(yǎng)基適用性1、對照培養(yǎng)基（2）當檢查結果出現(xiàn)異常或實驗室質量控制需要，也可通過培養(yǎng)基適用性檢查提供一定依據(jù)。在保證配制和滅菌過程無誤的條件下，對照培養(yǎng)基可以不經(jīng)適用性實驗檢查直接用于樣品檢查。（3）不同處方培養(yǎng)基的替代使用不能通過培養(yǎng)基適用性試驗簡單確定。不能使用經(jīng)過對照培養(yǎng)基進行適用性試驗檢查合格的其他培養(yǎng)基作為實驗室自用的“對照培養(yǎng)基”。（4）如果沒有特殊

7、規(guī)定，培養(yǎng)基配置采用蒸餾水或純化水均可，但應進行檢測控制，如蒸餾水pH應為57。三、培養(yǎng)基適用性1、對照培養(yǎng)基（5）盡量臨用現(xiàn)配，培養(yǎng)基滅菌后，盡快取出，切忌在高壓鍋內過夜存留，固體培養(yǎng)基滅菌或融化后，融化狀態(tài)放置不得超過8h；一般預制培養(yǎng)基可置潔凈環(huán)境225保存，但不應超過21d；固體瓊脂培養(yǎng)基熔化再使用應不超過1次。（6）干粉培養(yǎng)基或培養(yǎng)基原料變質再用；預制培養(yǎng)基儲存過程中發(fā)現(xiàn)渾濁、變色、長菌、嚴重脫水等變化應不再使用。三、培養(yǎng)基適用性2、工作菌種的制備3、菌懸液的獲得方式4、適用性檢查（1）控制菌檢查用培養(yǎng)基數(shù)量減少7個；（2）在増菌過程，使用無選擇性増菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，是因為藥品中的污染菌

8、受到加溫、冷凍、酸堿、高滲等加工過程的影響，會受到不同程度的損傷。如果將供試品直接使用選擇性増菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以使受傷的細菌得到修復，提高檢出率。三、培養(yǎng)基適用性4、適用性檢查控制菌檢查控制菌檢查培養(yǎng)基培養(yǎng)基特性特性試驗菌株試驗菌株耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌増菌肉湯促生長能力E.coli、P.aeruginosa抑制能力S. .aureus紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂促生長能力+指示特性E.coli、P.aeruginosa大腸埃希菌麥康凱肉湯促生長能力E.coli抑制能力S. .aureus麥康凱瓊脂促生長能力+指示特性E.coli沙門菌RVS増菌肉湯促生長能力S paratyphi B抑制能力S. .a

9、ureus木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂促生長能力+指示特性S paratyphi BE.coli銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂促生長能力P.aeruginosa抑制能力E.coli金黃色葡萄球菌甘露醇高鹽瓊脂促生長能力+指示特性S. .aureus抑制能力E.coli梭菌梭菌増菌培養(yǎng)基促生長能力Cl.sporogenes哥倫比亞瓊脂促生長能力Cl.sporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力C.albicans沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力+指示特性C.albicans三、培養(yǎng)基適用性4、適用性檢查（1）測試能力：促生長能力（+）；抑制能力（-）； 指示能力（“指示”） 1）瓊脂： 方法：

10、涂布，至少2皿。 比較菌落特征 是否生長 2）液體： 方法：直接接種 培養(yǎng)基是否渾濁 三、培養(yǎng)基適用性4、適用性檢查（2）要求： 1）菌株：根據(jù)表格要求接種 2）接種量：根據(jù)測試指標而定 “+”和“指示”：不大于100cfu “-”：不少于100cfu，也不能過多。 涂布：不少于0.1ml接種，也不能過多。 3）培養(yǎng)時間 “+”和“指示”：不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間。 “-”：不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時間。三、培養(yǎng)基適用性4、適用性檢查（3）根據(jù)每個控制菌檢查的培養(yǎng)基逐個說明，控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查的過程。（4）未注明培養(yǎng)溫度，則默認為3035培養(yǎng)（5）測試菌簡稱后標示，測試指標，分別以上述“

11、+”“-”和“指示”標示。（6）簡稱： 1）大腸埃希菌：大腸 2）金黃色葡萄球菌：金葡 3）銅綠假單胞菌：銅綠 4）乙型副傷寒沙門菌：沙門 5）白色念珠菌：白念 6）生孢梭菌：生孢四、方法適用性試驗 1、目的 微生物檢驗： 某種樣品樣品采用某種方法方法的到一個檢查結果 供試品影響 方法的有效性 2、方法驗證更名為方法適用性試驗 方法切實有效 滿足相應標準判斷的需要 3、樣品前處理四、方法適用性試驗 4、試驗菌中國藥典2010年版中國藥典2010年版修訂版控制菌檢查方法的驗證控制菌檢查方法的驗證驗證大腸菌群檢查方法時，采取大腸埃希菌為驗證菌株。方法適用性試驗方法適用性試驗試驗菌 確認耐膽鹽革蘭陰

12、性菌檢查方法時，采取大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。四、方法適用性試驗 5、方法中國藥典2010年版中國藥典2010年版修訂版驗證方法驗證方法：取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗菌接入増菌培養(yǎng)基中，依相應的控制菌檢查方法進行檢查。當采用薄膜過濾時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入増菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入増菌培養(yǎng)基中。適用性試驗適用性試驗：按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cuf的實驗菌接入規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或去除濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時間下

13、培養(yǎng)，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。四、方法適用性試驗 6、方法適用性試驗結果判斷中國藥典2010年版中國藥典2010年版修訂版結果判斷結果判斷：若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備方法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。 驗證試驗也可以與供試品的控制菌檢查同時進行。結果判斷結果判斷：過上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備方法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性（非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法中的“抗菌活性的去除

14、或滅活”）。 如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。五、供試品檢查 1、耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria） 取代2010年版大腸菌群（Coliform）檢查： 大腸菌群的定義是指在37生長時能發(fā)酵乳糖，24h內產(chǎn)酸產(chǎn)氣的格蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧的無芽孢桿菌。它不是分類學上的名稱。符合上述定義的菌除埃希菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。 五、供試品檢查 修訂版： 1:10 TSB供試液（2025 2h

15、） 腸道增菌肉湯 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂 （大腸、銅綠+/金葡-） （大腸、銅綠+且“指示”） 24-48h 18-24h 2010CHP: 取1:10供試液至乳糖膽鹽發(fā)酵管（大腸+/金葡-）18-24h MaC瓊脂（大腸+且“指示”）18-24h 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（大腸+且“指示”）24-48h五、供試品檢查 （1）供試液制備和預培養(yǎng)： 取供試品，用胰酪大豆胨肉湯做為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法” 制成1:10供試液，混勻，在2025培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應使供試品種的細菌充分恢復但不增殖（約2小時）。 （2）未檢出試驗： 除另有規(guī)定外，取相當于1g或1ml供試品的上述預培養(yǎng)物接種至腸道菌

16、増菌肉湯中，3035培養(yǎng)24-48h后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，3035培養(yǎng)18-24h。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽格蘭陰性菌。五、供試品檢查 （3）定量試驗： 取相當于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供試品的預培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至腸道菌増菌肉湯中，3035培養(yǎng)24-48h。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，3035培養(yǎng)18-24h。 （4）結果判斷： 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長，則對應培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結果，查表判斷1g或1ml供試品中含耐膽鹽革蘭陰性菌的最

17、大可能數(shù)。五、供試品檢查 “未檢出試驗”與“定量試驗”結論耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)各供試品量的檢查結果各供試品量的檢查結果每每1g1g（或（或1ml1ml）供試）供試品種可能的菌數(shù)（品種可能的菌數(shù)（N N）0.1g/ml0.1g/ml0.01g/ml0.01g/ml 0.001g/ml0.001g/ml+N103+-102 N 103+-10 N 102-N 10五、供試品檢查 2、大腸埃希菌 修訂版： 取1:10供試液至TSB（適宜體積）（18-24h） MaC肉湯 MaC瓊脂 （大腸+/金葡-） （大腸+且“指示”） 4244 24-48h 18-72h2010Chp 取1:10供試液至

18、膽鹽乳糖増菌液（大腸+/金葡-）18-24h MUG培養(yǎng)基（大腸+且“指示”）5h、24h MaC瓊脂（大腸+且“指示”）18-24h五、供試品檢查 （1）供試液制備和増菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)18-24h。（2010Chp中為膽鹽乳糖培養(yǎng)基） （2）選擇和分離培養(yǎng) 取上述預培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱肉湯中， 4244培養(yǎng)24-48h。取麥康凱肉湯培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)18-72h。（ 201

19、0Chp中為MUG培養(yǎng)基反應）五、供試品檢查 （3）結果判斷 若麥康凱瓊脂平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。五、供試品檢查 3、沙門菌 修訂版：10gTSB供試液（18-24h） RV肉湯 XLD瓊脂 （沙門+/金葡-） （沙門+/金葡-） 18-24h 18-48h 2010Chp：10g營養(yǎng)肉湯供試液（18-24h） TTB SS/MaC瓊脂 （沙門+/金葡-） （沙門+/金葡-） 18-24h 18-48h RV：氯化鎂孔雀綠沙門菌增菌肉湯 XLD：木糖賴氨酸

20、脫氧膽酸瓊脂 SS：沙門、志賀菌屬瓊脂 五、供試品檢查 （1）供試液制備和増菌培養(yǎng) 取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法學適用性試驗確定）的胰酪大豆胨肉湯中，混勻，3035培養(yǎng)18-24h。（2010Chp為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基） （2）選擇和分離培養(yǎng) 取上述預培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV増菌肉湯中，3035培養(yǎng)18-24h。取少量RV沙門菌増菌肉湯培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸瓊脂平板上，3035培養(yǎng)18-48h。（2010Chp中前者在為TTB培養(yǎng)基，后者為膽鹽硫乳瓊脂（或SS瓊脂）和麥康凱瓊脂（或EMB瓊脂）。 五、供試品檢查 （3）結果判斷: 若木糖賴氨酸脫氧

21、膽酸鹽瓊脂平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層有黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。 如果平板上沒有菌落生長，或所有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色，或斜面黃色、底層無黑色，判斷供試品未檢出沙門菌。五、供試品檢查 4、銅綠假單胞菌 修訂版：取1:10供試液至TSB（18-24h） 溴化十六烷基三甲銨瓊脂 （銅綠+/大腸-）18-72h 2010Chp：取1:10供試液至BL（銅綠+/金葡-）18-24h 溴化十六烷基三甲銨瓊脂 （銅綠+/大腸-）18-24h 綠膿菌素測定用培養(yǎng)基 （銅綠+且“

22、指示”）24h五、供試品檢查 （1）供試液之別和増菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)18-24h。（2010Chp中為膽鹽乳糖培養(yǎng)基） （2）選擇和分離培養(yǎng) 取上述預培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上，3035培養(yǎng)18-72h。（2010Chp中為18-24h）五、供試品檢查 （3）鑒定試驗 取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其它適宜方法進一步鑒定。 氧化酶試驗：將潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻璃棒取上述平板上生長

23、的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養(yǎng)物呈粉色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗呈陽性，否則為陰性。五、供試品檢查 （4）結果判定 若溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上有菌落生長，且氧化酶試驗呈陽性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或氧化酶試驗呈陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。五、供試品檢查 5、金黃色葡萄球菌 修訂版：取1:10供試液至TBS（18-24h） 甘露醇氯化鈉瓊脂 （金葡+且“指示”/大腸-） 18-72h 2010Chp：取1:10供試液至營養(yǎng)肉湯或亞碲酸鹽肉湯 亞碲酸鹽肉

24、湯（金葡+/大腸-）18-24h 48h 甘露醇氯化鈉瓊脂 （金葡+且“指示”/大腸-） 18-72h 抑制能力：大腸埃希菌接種量不大于103，接種量過大時 大腸埃希菌可生長。五、供試品檢查 （1）供試液制備和増菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)18-24h。（2010Chp中為亞碲酸鈉肉湯或）。 （2）選擇和分離培養(yǎng) 取上述預培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，3035培養(yǎng)18-72h。（取消了2010Chp中卵黃氯化鈉培養(yǎng)基）

25、五、供試品檢查 （3）結果判斷 若甘露醇氯化鈉瓊脂平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，驗證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。五、供試品檢查 6、梭菌 修訂版同2010版：取1:10供試液至梭菌増菌培養(yǎng)基 （生孢+） 48h 哥倫比亞瓊脂 （生孢+） 48-72h （1）供試液制備和熱處理 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液2份，其中1份置80 保溫10分鐘后迅速冷卻。五、供

26、試品檢查 （2）選擇和分離培養(yǎng) 將上述2份供試液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的梭菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件3035培養(yǎng)48h。取上述每一培養(yǎng)物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下3035培養(yǎng)48-72h。（2010Chp中為含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基） （3）過氧化氫酶試驗 取上述平板上生長的菌落，置干凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗呈陽性，否則為陰性。五、供試品檢查 （4）結果判斷 若哥倫比亞瓊脂平板上有帶或不帶芽孢的厭氧桿菌生長，且過氧化氫酶反應呈陰性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為梭菌；如果哥倫比亞瓊脂平板上沒有厭氧桿菌生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，或過氧化氫酶反應陽性，判供試品未檢出梭菌。五、供試品檢查 7、白色念珠菌 修訂版基本同2010Chp：取1:10供試液至SDB 修訂版：（白念+）3-5d 2010Chp：（白念+）48-72h 沙氏葡萄糖