紙色譜和平板電泳-(第五講)

1、紙層析分離技術(shù)紙層析分離技術(shù)Paper Paper ChromatographyChromatography 1目錄一 紙色譜法的基本理論二 幾種特殊類型的紙色譜法三 應(yīng)用舉例 2原理：原理：根據(jù)溶質(zhì)根據(jù)溶質(zhì)A A在流動(dòng)相與固定相（紙纖維中吸著在流動(dòng)相與固定相（紙纖維中吸著的水分）中的分配系數(shù)不同，流動(dòng)相因毛細(xì)現(xiàn)象沿的水分）中的分配系數(shù)不同，流動(dòng)相因毛細(xì)現(xiàn)象沿紙上升，紙上升，K KD D大的前進(jìn)慢，大的前進(jìn)慢，K KD D小的上升快，因而溶小的上升快，因而溶質(zhì)得到分離。質(zhì)得到分離。3DAAK 固固定定相相流流動(dòng)動(dòng)相相固定相固定相濾紙上的吸附水濾紙上的吸附水 ( (或用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二

2、醇處理或用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇處理) )流動(dòng)相流動(dòng)相溶劑溶劑 （乙醇、丙醇、丙酮及與水不相溶的溶劑）（乙醇、丙醇、丙酮及與水不相溶的溶劑）（但也有人認(rèn)為屬離子交換（但也有人認(rèn)為屬離子交換色譜和吸附色譜或三者皆有）色譜和吸附色譜或三者皆有）一一 . 基本原理基本原理4 紙色譜示意圖紙色譜示意圖 Rf 0.02，A、B可分離可分離.12f1f2fxRyxRyxRy 比移值比移值溶劑前沿溶劑前沿起始線起始線（原點(diǎn)）（原點(diǎn)）展開(kāi)劑展開(kāi)劑yx2x1層析缸層析缸層層析析紙紙與標(biāo)樣比較可定性鑒定與標(biāo)樣比較可定性鑒定氨基酸的氨基酸的R RF F值值展開(kāi)劑展開(kāi)劑正丁醇正丁醇+ +吡啶吡啶+ +水水 0.

3、200.20 0.29 0.60 0.29 0.60 0.200.20 0.33 0.24 0.33 0.24 1 : 1 : 1 1 : 1 : 1正丁醇正丁醇+ +醋酸醋酸+ +水水 0.230.23 0.230.23 0.70 0.28 0.22 0.11 0.70 0.28 0.22 0.11 12 : 3 : 5 12 : 3 : 55天天冬冬氨氨酸酸甘甘氨氨酸酸白白氨氨酸酸谷谷氨氨酸酸絲絲氨氨酸酸組組氨氨酸酸1. 展開(kāi)劑種類展開(kāi)劑種類二. 影響R Rf f的因素3. 溫度的影響62. 濾紙的性質(zhì)粘稠展開(kāi)劑粘稠展開(kāi)劑(正丁醇等正丁醇等) - 快速濾紙快速濾紙黏度小的展開(kāi)劑黏度小的展開(kāi)

4、劑(石油醚等石油醚等) -慢速濾紙慢速濾紙4 . 展開(kāi)方式上行上行 - 慢慢(常用常用)下行下行- 快快( 適用于比移值小的溶質(zhì)適用于比移值小的溶質(zhì))影響分配系數(shù)的變化，而且展開(kāi)劑組成也受溫度影響影響分配系數(shù)的變化，而且展開(kāi)劑組成也受溫度影響而有一定程度改變，但影響較小。一般不需要特別的而有一定程度改變，但影響較小。一般不需要特別的恒溫裝置恒溫裝置三三. . 紙色譜法的基本操作紙色譜法的基本操作 3.1 3.1 紙的準(zhǔn)備紙的準(zhǔn)備 3.2 3.2 點(diǎn)樣點(diǎn)樣 3.3 3.3 展開(kāi)展開(kāi) 3.4 3.4 顯色及定位顯色及定位 3.5 3.5 定量定量73.1 紙的準(zhǔn)備 一般紙色譜法使用的濾紙應(yīng)具備以下

5、條件：一般紙色譜法使用的濾紙應(yīng)具備以下條件：（1 1） 濾紙中應(yīng)不含有水或有機(jī)溶劑能溶解的雜質(zhì)。濾紙中應(yīng)不含有水或有機(jī)溶劑能溶解的雜質(zhì)。（2 2） 濾紙被溶劑浸潤(rùn)時(shí)，不應(yīng)有機(jī)械折痕和損傷。濾紙被溶劑浸潤(rùn)時(shí)，不應(yīng)有機(jī)械折痕和損傷。即應(yīng)具有一定的強(qiáng)度。即應(yīng)具有一定的強(qiáng)度。（3 3） 濾紙對(duì)溶劑的滲透速度應(yīng)適當(dāng)，滲透速度太濾紙對(duì)溶劑的滲透速度應(yīng)適當(dāng)，滲透速度太快時(shí)易引起斑點(diǎn)拖尾，影響分離效果，速度太慢時(shí)，快時(shí)易引起斑點(diǎn)拖尾，影響分離效果，速度太慢時(shí)，耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)。耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)。（4 4） 紙質(zhì)應(yīng)均一，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，紙質(zhì)應(yīng)均一，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，特別是定量實(shí)驗(yàn)中這點(diǎn)更是重要。特

6、別是定量實(shí)驗(yàn)中這點(diǎn)更是重要。8層析紙層析紙按需要剪裁成長(zhǎng)條形（或筒型）按需要剪裁成長(zhǎng)條形（或筒型）93.2 點(diǎn)樣點(diǎn)樣用微量注射器或玻用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于應(yīng)小于5mm。可并。可并排點(diǎn)多個(gè)試樣同時(shí)排點(diǎn)多個(gè)試樣同時(shí)展開(kāi)。展開(kāi)。3.3 3.3 展開(kāi)展開(kāi)10展開(kāi)時(shí)必須在密閉的容器中進(jìn)行。展開(kāi)時(shí)必須在密閉的容器中進(jìn)行。展開(kāi)劑不得浸泡到點(diǎn)樣線展開(kāi)劑不得浸泡到點(diǎn)樣線一元展開(kāi)一元展開(kāi)二元展開(kāi)（雙向展開(kāi)）二元展開(kāi)（雙向展開(kāi)）多段展開(kāi)多段展開(kāi)將濾紙浸于層析缸中的展開(kāi)劑中，使展開(kāi)將濾紙浸于層析缸中的展開(kāi)劑中，使展開(kāi)劑

7、通過(guò)濾紙的毛細(xì)作用上升（或下降），劑通過(guò)濾紙的毛細(xì)作用上升（或下降），實(shí)現(xiàn)試樣的分離實(shí)現(xiàn)試樣的分離11例：例：氨基酸混合液點(diǎn)在氨基酸混合液點(diǎn)在1515cm濾紙邊濾紙邊2cm處，風(fēng)干，處，風(fēng)干，展開(kāi)劑用展開(kāi)劑用CH3OH-H2O-吡啶（吡啶（20:5:1），當(dāng)溶劑移動(dòng)至，當(dāng)溶劑移動(dòng)至14cm處，取出風(fēng)干。處，取出風(fēng)干。（第一次展開(kāi)）第一次展開(kāi)） 將濾紙折成筒狀，將濾紙折成筒狀，使斑點(diǎn)處于下方，再用使斑點(diǎn)處于下方，再用叔丁醇叔丁醇- -甲基乙基酮甲基乙基酮- -H H2 2O-O-二乙胺二乙胺(10:10:5:1) (10:10:5:1) 展開(kāi)至展開(kāi)至14cm14cm，取出風(fēng)干。，取出風(fēng)干。( (

8、第二次展開(kāi)第二次展開(kāi)) )顯色：顯色：茚三酮茚三酮-4-4-乙乙-2-2-甲氮苯甲氮苯- -冰冰HAcHAc xx 第二次展開(kāi)第二次展開(kāi)雙向紙色譜法雙向紙色譜法第一次展開(kāi)第一次展開(kāi)3.4 顯色及定位 經(jīng)上述展開(kāi)至溶劑前沿到達(dá)紙的另一端時(shí)，經(jīng)上述展開(kāi)至溶劑前沿到達(dá)紙的另一端時(shí)，即可將紙取出，待溶劑揮干后用適宜方法確定即可將紙取出，待溶劑揮干后用適宜方法確定組分斑點(diǎn)的位置組分斑點(diǎn)的位置12有色物質(zhì)，展開(kāi)后即可直接觀有色物質(zhì)，展開(kāi)后即可直接觀察到各個(gè)色斑察到各個(gè)色斑紫外光照射下產(chǎn)生熒光，觀察紫外光照射下產(chǎn)生熒光，觀察熒光（例如生物堿）熒光（例如生物堿）噴以試劑使斑點(diǎn)顯色（顯色劑，噴以試劑使斑點(diǎn)顯色（

9、顯色劑，碘蒸氣熏或氨水熏等）碘蒸氣熏或氨水熏等）13顯色舉例顯色舉例1 1磺胺類藥物如磺胺噻唑和磺胺嘧啶混合物的分離和檢出，磺胺類藥物如磺胺噻唑和磺胺嘧啶混合物的分離和檢出，可用可用 1% 1% 的氨水作展開(kāi)劑，用的氨水作展開(kāi)劑，用對(duì)二甲胺基苯甲醛對(duì)二甲胺基苯甲醛（即（即 EhrlichEhrlich試劑）乙醇溶液作顯色劑。試劑）乙醇溶液作顯色劑。552 2氨基酸的分離和檢出，一般需用雙向?qū)游?。先用酚：水氨基酸的分離和檢出，一般需用雙向?qū)游?。先用酚：水? 7：3 3）作展開(kāi)劑進(jìn)行第一次展開(kāi)；再用丁醇：醋酸：水（）作展開(kāi)劑進(jìn)行第一次展開(kāi)；再用丁醇：醋酸：水（4 4：1 1：2 2）作展開(kāi)劑進(jìn)行

10、第二次展開(kāi)，可分離出近）作展開(kāi)劑進(jìn)行第二次展開(kāi)，可分離出近 20 20 種氨基酸種氨基酸。展開(kāi)后噴以。展開(kāi)后噴以茚三酮的丁醇溶液茚三酮的丁醇溶液，使之顯色。，使之顯色。113 3紙上層析法不但可用于分離各種常見(jiàn)無(wú)機(jī)離子，由于它紙上層析法不但可用于分離各種常見(jiàn)無(wú)機(jī)離子，由于它需用試樣量很少，因此在各種貴金屬和稀有元素的分離方面也需用試樣量很少，因此在各種貴金屬和稀有元素的分離方面也已得到了很好的應(yīng)用。例如金、鉑、鈀、銠離子的分離，可用已得到了很好的應(yīng)用。例如金、鉑、鈀、銠離子的分離，可用乙醚：丁醇：濃鹽酸（乙醚：丁醇：濃鹽酸（1 1：2 2：2.52.5）混合溶液作展開(kāi)劑，展開(kāi)）混合溶液作展開(kāi)劑

11、，展開(kāi)后噴以后噴以 SnClSnCl2 2溶液溶液、金、鉑、鈀立即出現(xiàn)色斑，銠則在稍溫?zé)?、金、鉑、鈀立即出現(xiàn)色斑，銠則在稍溫?zé)岷箫@色。銠、釕、鈀、鉑、銥、金離子的分離則可用后顯色。銠、釕、鈀、鉑、銥、金離子的分離則可用 N-NN-N二仲二仲辛基乙酰胺為固定相，辛基乙酰胺為固定相，5M HCl 5M HCl 溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行紙上反相層溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行紙上反相層析等。析等。3.5 定量 1.1.洗脫測(cè)定法洗脫測(cè)定法 操作步驟多，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，但洗脫法不需操作步驟多，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，但洗脫法不需要貴重儀器設(shè)備、測(cè)定結(jié)果有較好的準(zhǔn)確度。要貴重儀器設(shè)備、測(cè)定結(jié)果有較好的準(zhǔn)確度。14 紫外分光光度法、紫外分光光

12、度法、比色法及其它方法比色法及其它方法如極譜、庫(kù)侖滴定、如極譜、庫(kù)侖滴定、熒光測(cè)定等。熒光測(cè)定等。2 直接測(cè)定法 a a 目測(cè)法目測(cè)法 樣品經(jīng)分離后，直接觀察所得斑點(diǎn)的大小樣品經(jīng)分離后，直接觀察所得斑點(diǎn)的大小和顏色的深淺，并與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下展開(kāi)所得到的和顏色的深淺，并與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下展開(kāi)所得到的一系列已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)相比較，而近似地判斷一系列已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)相比較，而近似地判斷樣品中所測(cè)成分的含量。（誤差較大）樣品中所測(cè)成分的含量。（誤差較大） b b 測(cè)面積法測(cè)面積法 展開(kāi)后色譜上的斑點(diǎn)面積與化合物含量展開(kāi)后色譜上的斑點(diǎn)面積與化合物含量間存在一定關(guān)系，所以可以用測(cè)定斑點(diǎn)面

13、積的方法來(lái)測(cè)間存在一定關(guān)系，所以可以用測(cè)定斑點(diǎn)面積的方法來(lái)測(cè)定樣品含量。定樣品含量。 15C 儀器測(cè)定法 紙色譜中紙為半紙色譜中紙為半透明物體，故可以用透明物體，故可以用類似于分光光度計(jì)結(jié)類似于分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)的光密度計(jì)構(gòu)的光密度計(jì)（ densitometer densitometer ）掃描濾紙，測(cè)定透光掃描濾紙，測(cè)定透光強(qiáng)度的變化而定量。強(qiáng)度的變化而定量。16四. 應(yīng)用舉例 (一)分離和分光光度法測(cè)定氯原酸 (二)用色譜法測(cè)定巖石及礦物中金、銻 硒、砷、鉈（鉍） (三)貴金屬元素的反相紙色譜分離研究 17(一) 分離和分光光度法測(cè)定氯原酸1 1 搞要搞要 氯原酸是杜仲、金銀花等多種中氯原酸是

14、杜仲、金銀花等多種中草藥抗菌消炎的有效成份之一。氯原酸的測(cè)定草藥抗菌消炎的有效成份之一。氯原酸的測(cè)定有多種方法，本文用紙色譜法的分離條件和氯有多種方法，本文用紙色譜法的分離條件和氯原酸的配位效應(yīng)進(jìn)行顯色的有關(guān)參數(shù)，建立了原酸的配位效應(yīng)進(jìn)行顯色的有關(guān)參數(shù)，建立了測(cè)定氯原酸的可見(jiàn)分光光度法。方法具有儀器測(cè)定氯原酸的可見(jiàn)分光光度法。方法具有儀器簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、快速準(zhǔn)確、容易簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、快速準(zhǔn)確、容易普及等優(yōu)點(diǎn)。普及等優(yōu)點(diǎn)。18 2 實(shí)驗(yàn)部分a a 儀器和試劑儀器和試劑 色譜用濾紙（杭州新華紙業(yè)有限公色譜用濾紙（杭州新華紙業(yè)有限公司）司） 721721型分光光度計(jì)（上海分析儀器

15、三廠）型分光光度計(jì)（上海分析儀器三廠） KQKQ15001500型超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限型超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）等。公司）等。b b 樣品預(yù)處理和測(cè)量樣品預(yù)處理和測(cè)量 吸取吸取 5.0000g 5.0000g 干燥杜仲葉干燥杜仲葉粉末，加蒸餾水浸泡粉末，加蒸餾水浸泡 24h 24h ，超聲波振蕩處理，超聲波振蕩處理 3 3 次，次，每次每次 30min30min，合并濾液，定容于，合并濾液，定容于 100ml 100ml 容量瓶中。容量瓶中。吸取吸取 50ul 50ul 提取液，點(diǎn)樣于色譜濾紙上，用正丁醇提取液，點(diǎn)樣于色譜濾紙上，用正丁醇- -水水- -冰醋酸（冰醋酸

16、（4 4：2 2：1 1，V/VV/V）作展開(kāi)劑，按常規(guī)操）作展開(kāi)劑，按常規(guī)操作展開(kāi)，風(fēng)干濾紙，在作展開(kāi)，風(fēng)干濾紙，在 365nm 365nm 紫外分析儀上點(diǎn)劃紫外分析儀上點(diǎn)劃出淡藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，剪下，并剪成細(xì)條狀，收集于出淡藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，剪下，并剪成細(xì)條狀，收集于 20ml20ml具塞刻度試管中，加具塞刻度試管中，加 10ml 10ml 蒸餾水，超聲波蒸餾水，超聲波振蕩處理振蕩處理 15min 15min ，所得溶液測(cè)量吸光度，所得溶液測(cè)量吸光度A A。193 結(jié)果與討論：a)a) 顯色吸收光譜顯色吸收光譜 紫紅色絡(luò)合物的吸收光譜，最紫紅色絡(luò)合物的吸收光譜，最大吸大吸 收波長(zhǎng)為收波長(zhǎng)為 526

17、nm526nm。b)b) 顯色化合物的穩(wěn)定時(shí)間顯色化合物的穩(wěn)定時(shí)間 室溫加入乙醇，然后室溫加入乙醇，然后顯色，顯色， 顯色化合物的吸光度在顯色化合物的吸光度在 1.5h 1.5h 內(nèi)無(wú)變化內(nèi)無(wú)變化, ,完全能夠滿足測(cè)定的要求。完全能夠滿足測(cè)定的要求。c)c) 杜仲葉提取氯原酸的紙色譜分離杜仲葉提取氯原酸的紙色譜分離 對(duì)杜仲葉提對(duì)杜仲葉提取液取液 的紙色譜分離展開(kāi)劑進(jìn)行了不同組成和配比的紙色譜分離展開(kāi)劑進(jìn)行了不同組成和配比的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其中以正丁醇的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其中以正丁醇- -醋酸醋酸- -水（水（4 4：1 1：2 2，V/VV/V）分離效果最好，可使氯原酸與干擾物質(zhì)完全）分離效果最好，可使氯原

18、酸與干擾物質(zhì)完全分離。氯原酸的分離。氯原酸的R Rf f 值為值為 0.750.75。20(二)貴金屬元素的反相紙色譜分離研究 文獻(xiàn)研究了以不同濃度 P350 和P507 (含磷的萃取劑)為固定相，不同展開(kāi)體系為流動(dòng)相的Au、Rh、Ru、Pd等 6 種貴金屬離子的反相紙色譜行為，討論了溫度對(duì) Rf 值的影響，并獲得了某些多組分混合體系的良好分離。 儀器與試劑 ：2 24cm 、424cm 國(guó)產(chǎn)新華牌色層濾紙，將其在不同濃度的P350、P507苯溶液中浸漬 2min ，取出晾干，放入干燥器中備用。 121224cm 層析缸 色譜及顯色：按常規(guī)上行方法展開(kāi) 2-3 小時(shí)，溶劑前沿為 181cm，以

19、SnCl2 鹽酸溶液顯色。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同溫度下各種金屬離子的Rf 值，除Ag+、Au+外，隨溫度升高，各離子的Rf 值不同程度增加。 21 (三) 用紙色譜法測(cè)定巖石及礦物中金、銻、硒、砷、鉈（鉍） 有有文獻(xiàn)報(bào)道了用紙色譜法測(cè)定巖石及礦文獻(xiàn)報(bào)道了用紙色譜法測(cè)定巖石及礦物中物中銅、鉛、鋅十二種元素銅、鉛、鋅十二種元素的研究，并對(duì)其影的研究，并對(duì)其影響因素也作了探討。而響因素也作了探討。而金、銻、硒、砷、鉈金、銻、硒、砷、鉈（鉍）（鉍）在在 4mol/l4mol/l飽和正丁醇飽和正丁醇展開(kāi)劑中用紙色展開(kāi)劑中用紙色譜法進(jìn)行分離的文獻(xiàn)已有介紹，但利用此方法譜法進(jìn)行分離的文獻(xiàn)已有介紹，但利用此方法在巖

20、石及礦物中對(duì)它們進(jìn)行測(cè)定卻未見(jiàn)報(bào)道。在巖石及礦物中對(duì)它們進(jìn)行測(cè)定卻未見(jiàn)報(bào)道。本文在此基礎(chǔ)上，利用新華大張定性濾紙本文在此基礎(chǔ)上，利用新華大張定性濾紙（505060cm60cm）作載體展開(kāi)后，將譜帶分別剪下）作載體展開(kāi)后，將譜帶分別剪下進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，這種方法既簡(jiǎn)單，又進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，這種方法既簡(jiǎn)單，又快速，還能解決干擾問(wèn)題?？焖伲€能解決干擾問(wèn)題。22 (三) 用紙色譜法測(cè)定巖石及礦物中金、銻、硒、砷、鉈（鉍）層析劑：用 4mol/l4mol/l飽和飽和的正丁醇顯色劑：硫脲十碘化鉀混合顯色劑操作：樣品用王水消化后，吸取0.02ml點(diǎn)樣，展開(kāi)，顯色。譜帶剪下，溶解，測(cè)定。23馬國(guó)中，

21、色譜，馬國(guó)中，色譜，1988年第年第6卷第卷第4期，期，251-2522022-4-1124電泳技術(shù)電泳技術(shù)Electrophoresis 一、概述一、概述二、電泳分類二、電泳分類三、凝膠電泳三、凝膠電泳1 概述概述 在電場(chǎng)作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象 蛋白質(zhì)研究方面：用于蛋白質(zhì)分離、純化、分析、小量制備，分子量、等電點(diǎn)的測(cè)定 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其側(cè)鏈可解離基團(tuán)的種類和數(shù)量、分子質(zhì)量、空間三維結(jié)構(gòu)都有所不同，所以： 等電點(diǎn)（pI）不同 同一pH條件，所帶電荷種類、數(shù)量不同 大小、形狀不同 蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度常常用遷移率來(lái)表示 定義：蛋白質(zhì)分子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的

22、泳動(dòng)速度 m = = V=遷移速度； E=電場(chǎng)強(qiáng)度； =介質(zhì)粘度在同一介質(zhì)中電泳，m只與蛋白分子自身大小和形狀（r）、所帶電荷數(shù)量（Q）相關(guān)利用蛋白質(zhì)混合物中各蛋白的遷移率不同（蛋白性質(zhì)差異造成），而達(dá)到分離的效果VE 6r_Q1.3 遷移率遷移率（MOBILITY, M）6種蛋白質(zhì)混合物的電泳結(jié)果圖1.4.遷移率及其影響因素 內(nèi)在因素 外在因素 1.4.1 影響遷移率的內(nèi)在因素所帶靜電荷的多少所帶靜電荷的多少遷移率與表面電荷成正比。大小和形狀大小和形狀直徑小而接近于球形，則在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度快。DNADNA構(gòu)象構(gòu)象一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開(kāi)環(huán)。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的構(gòu)象的構(gòu)象1.4

23、.2 影響遷移率的外界因素電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度 溶液的溶液的pHpH值值 溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度 溫度的影響溫度的影響 支持物的影響支持物的影響 電滲電滲電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度是指單位長(zhǎng)度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)速度起著十分重要的作用。當(dāng)電壓在500V以下，電場(chǎng)強(qiáng)度在 2-10v/cm 時(shí)為常壓電泳。電壓在 500V 以上，電場(chǎng)強(qiáng)度在20-200V/cm 時(shí)為高壓電泳。一般，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動(dòng)速度越快。溶液的溶液的P PH H值值 溶液的pH決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。溶液的pH離pl越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時(shí)

24、，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇合適的pH值緩沖液。溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度電泳液中的離子增加會(huì)使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會(huì)吸引相反符號(hào)的離子聚集在其周圍，相成一個(gè)與運(yùn)動(dòng)粒子符號(hào)相反的離子氛（ionic atmosphere），它使該離子向相反的方向運(yùn)動(dòng)，從而降低了該粒子的遷移率。溫度的影響溫度的影響電泳過(guò)程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，電泳過(guò)程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對(duì)電泳有很大的影響。熱對(duì)電泳有很大的影響。溫度每升高溫度每升高1，遷移率約增加，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應(yīng)對(duì)電泳的影響，。為降低熱效應(yīng)對(duì)電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置

25、中安裝冷卻散熱裝置支持物的影響支持物的影響 對(duì)支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否則電對(duì)支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否則電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及掃場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及掃描圖譜無(wú)法重復(fù)。描圖譜無(wú)法重復(fù)。電滲電滲 電場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相電場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲（對(duì)移動(dòng)稱為電滲（electro-osmosis）。）。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附帶有可解離的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對(duì)帶負(fù)電或正電。應(yīng)盡

26、可能選擇低電對(duì)帶負(fù)電或正電。應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響滲作用的支持物以減少電滲的影響。二、電泳的分類二、電泳的分類Tise-leas式微量電泳式微量電泳顯微電泳顯微電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳等速電泳等速電泳密度梯度電泳密度梯度電泳電泳 自由電泳自由電泳（無(wú)支持體）（無(wú)支持體） 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳（有支持體）（有支持體）濾紙電泳濾紙電泳（常壓及高壓）薄層電泳薄層電泳（薄膜及薄板）凝膠電泳凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）凝膠電泳：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持物的電泳。特點(diǎn)：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點(diǎn)在凝 膠的孔中泳動(dòng)。2.電泳操作方法

27、簡(jiǎn)便，電泳速度快3.分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰。4.適用于生化，免疫等定性定量測(cè)定 三、凝膠電泳三、凝膠電泳1 1 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù)，可用于分離，鑒定和純化DNA或RNA片段。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下，有不同的遷移率，所以可通過(guò)電泳使其分離。 1.2 1.2 瓊脂糖簡(jiǎn)介瓊脂糖簡(jiǎn)介天然瓊脂（天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（糖（agarose，約占，約占80%）及瓊脂膠（）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性組成。瓊脂糖是由

28、半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。泳。聚丙烯酰胺凝膠 單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(A

29、P)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。2.2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過(guò)改變單體及

30、交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。按凝膠裝置分為盤狀電泳（圖按凝膠裝置分為盤狀電泳（圖1 1）及板狀）及板狀電泳（圖電泳（圖2 2）盤狀電泳通常是盤狀電泳通常是不連續(xù)系統(tǒng)，不連續(xù)系統(tǒng)，利用緩沖液利用緩沖液離子成分、離子成分、pHpH、凝膠孔徑進(jìn)行電泳，帶電、凝膠孔徑進(jìn)行電泳，帶電顆粒電泳時(shí)具有顆粒電泳時(shí)具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳分類聚丙烯酰胺凝膠電泳分類圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)(1)樣品

31、膠PH6.7 (2)濃縮膠PH6.7 (3)分離膠PH8.9 (4)電極緩沖液PH8.3圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3 凝膠模示意圖1.導(dǎo)線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡(jiǎn)稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)。因此可以利用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1.安裝夾心式垂直板電泳槽 (1)裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。(2)將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。(4)將下貯槽的銷孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽。(5)豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應(yīng)避免有氣泡。3. 制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng)、短玻璃板間的