肝炎病毒核酸檢測及臨床診療最新進展

1、匯報人：Part 1 肝病PCR檢測國內(nèi)外需求及現(xiàn)狀Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案Part 3 肝病PCR檢測的發(fā)展趨勢Part 1 肝病PCR檢測國內(nèi)外需求及現(xiàn)狀Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案Part 3 肝病PCR檢測的發(fā)展趨勢l 2008年美國肝病協(xié)會CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治療終點，HBV DNA病毒載量盡可能小于或等于10 IU/ ml。l 歐洲肝病研究學(xué)會EASL2010年指南指出：將HBV DNA病毒載量盡可能控制在10-15 IU/ ml，能有效防止疾病的復(fù)發(fā)。l歐洲肝病研究學(xué)會EASL2011指南指出：丙肝患者治療的目標(biāo)需HCV RNA病毒載

2、量低于50 IU/ ml。（一）（一） 核苷核苷( (酸酸) )類似物治療慢性乙肝路線圖類似物治療慢性乙肝路線圖 治療第治療第12周周評估原發(fā)性治療失敗評估原發(fā)性治療失敗HBV-DNA水平較基線水平下降幅度水平較基線水平下降幅度1log/ml開始治療開始治療HBV-DNA基線水平監(jiān)測基線水平監(jiān)測病毒學(xué)完全應(yīng)答病毒學(xué)完全應(yīng)答HBV-DNA2000 IU/ml增加增加/更換有效的藥物治療更換有效的藥物治療監(jiān)測監(jiān)測HBV-DNA/6個月個月治療第治療第24周周評估抗病毒療效的早期預(yù)測因子評估抗病毒療效的早期預(yù)測因子60IU/ml如何檢測？* * 由美國坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心由美國坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Keeff

3、eKeeffe教授（專家組）提供教授（專家組）提供n國家SFDA技術(shù)審評中心“863”課題 HBV DNA定量試劑技術(shù)審評指導(dǎo)原則中指出：l HBV DNA建議最低檢測限應(yīng)30 IU/mL。l DNA提取純化方法不建議采用煮沸法進行DNA提取。內(nèi)標(biāo)全程參與！核酸上樣量20 ul！加熱煮加熱煮沸沸高速離高速離心心過柱吸過柱吸附附n 陳舊的技術(shù)n 繁瑣的過程國內(nèi)HBV DNA檢測方法多為煮沸法，試劑靈敏度均為500IU/ml或1000IU/ml。國內(nèi)大部分HCV RNA檢測方法多為柱提法，試劑靈敏度1000IU/ml。n 令人揪心的性能 五種乙型肝炎病毒核酸熒光定量檢測試劑盒的比較,中華傳染病雜志

4、，2009年 第3期吳星,黃維金, 周誠 ,莊輝 等(中國藥品生物制品檢定所,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部) 國家“十一五”科技重大專項 “乙型和丙型病毒性肝炎診斷及臨床監(jiān)測的研究” 魯鳳民教授 北京大學(xué)肝炎試劑研究中心n 專家呼吁：高精度，超敏感的核酸診斷試劑的開發(fā)是目前肝炎診療中的關(guān)鍵步驟！面對當(dāng)前肝病毒核酸檢測技術(shù)的現(xiàn)狀，我們真沒有辦法了嗎？Part 1 肝病PCR檢測國內(nèi)外需求及現(xiàn)狀Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案Part 3 肝病PCR檢測的發(fā)展趨勢臨床核酸提取技術(shù)的發(fā)展：臨床核酸提取技術(shù)的發(fā)展：煮沸法煮沸法酚氯仿法酚氯仿法旋轉(zhuǎn)離心柱法旋轉(zhuǎn)離心柱法玻璃粉吸附法玻璃粉吸附法二氧化硅吸附法二氧

5、化硅吸附法磁珠法磁珠法國內(nèi)主流方法國內(nèi)主流方法國際主流方法國際主流方法p 高精度高精度p 高品質(zhì)高品質(zhì)p 高科技高科技磁珠（電子顯微鏡）磁珠分離器p 磁珠法磁珠法-核酸診斷領(lǐng)域新方向。核酸診斷領(lǐng)域新方向。DNA磁珠與DNA的結(jié)合 -通過超順磁性顆粒富集通過超順磁性顆粒富集核酸，實現(xiàn)樣品高純度、高核酸，實現(xiàn)樣品高純度、高靈敏度的檢測。靈敏度的檢測。p 原理原理l磁珠法提取核酸效率高，純度高，特異性好。l采用最新一代的磁珠提取核酸技術(shù)，無需加熱、無需高速離心、靈敏度極高，能夠很好的滿足臨床診療的需求。l抗干擾能力強，能勝任高血脂、強溶血以及藥物治療標(biāo)本的檢測，是臨床疾病檢測的有力手段。l極易實現(xiàn)自

6、動化。 靈敏度可達靈敏度可達10IU/ml，是國產(chǎn)主流試劑的，是國產(chǎn)主流試劑的50-100倍；倍； 準(zhǔn)確定量線性范圍為準(zhǔn)確定量線性范圍為20IU/ml2.0109IU/ml 可檢測可檢測HBV A、B、C、D、E、F、G、H共共8個基因型。個基因型。 設(shè)置了監(jiān)控內(nèi)標(biāo)設(shè)置了監(jiān)控內(nèi)標(biāo)IC,有效避免假陰性。有效避免假陰性。 設(shè)置內(nèi)參比熒光設(shè)置內(nèi)參比熒光ROX，定量更準(zhǔn)確。，定量更準(zhǔn)確。u以湖南圣湘乙肝磁珠法為例u以湖南圣湘乙肝磁珠法為例* 9例定值在12 50 IU/ml之間圣湘磁珠法技術(shù)在靈敏度方面存在明顯優(yōu)勢，與進口試劑具有很好的一致圣湘磁珠法技術(shù)在靈敏度方面存在明顯優(yōu)勢，與進口試劑具有很好的一

7、致性，能夠很好的勝任臨床藥物療效的觀察和治療終點的確定。性，能夠很好的勝任臨床藥物療效的觀察和治療終點的確定。Sansure-HBV ：圣湘HBV磁珠法Roche-HBV ：羅氏 AmpliPrep-Cobas TaqMan HBV TestX-HBV：國內(nèi)一家上市公司的HBV產(chǎn)品（濃縮煮沸法）Part 1 肝病PCR檢測國內(nèi)外需求及現(xiàn)狀Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案Part 3 肝病PCR檢測的發(fā)展趨勢（2533+2883）15=？n簡單化的要求 一步法技術(shù)：最簡便的PCR技術(shù)一步操作即可實現(xiàn)核酸提取。 一步法技術(shù)優(yōu)勢：l快速，處理96個樣本僅需 30min。l成本低，僅需一套移液器即可實現(xiàn)病毒檢測。l操作步驟少，減少誤差發(fā)生率，提高準(zhǔn)確性。l極易掌握，對操作人員要求低，方便科室的人員安排。n準(zhǔn)確化的要求-內(nèi)標(biāo)監(jiān)測系統(tǒng)，假陰性的克星。 內(nèi)標(biāo)參與核酸提取與擴增，通過檢測內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測核酸提取和核酸擴增的有效性，試驗結(jié)果是否有效，避免PCR假陰性。FAM:525nmHEX:555nm目的基因目的基因內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo) 真陰性真陰性 HEX曲線曲線 FAM曲線曲線設(shè)置了參比熒光ROX，用于校正槍的誤