細胞生物學實驗課-3-細胞傳代與凍存

1、細胞生物學實驗 張 偉 實驗三、細胞的傳代培養(yǎng)與凍存實驗三、細胞的傳代培養(yǎng)與凍存細胞生物學實驗 張 偉l1. 1.細胞培養(yǎng)中為什么細胞培養(yǎng)中為什么NaHCONaHCO3 3？l2.2.細胞培養(yǎng)中為什么添加血清？細胞培養(yǎng)中為什么添加血清？l3.3.消化液胰酶的濃度是多少？消化液胰酶的濃度是多少？細胞生物學實驗 張 偉一、實驗原理一、實驗原理（一）傳代培養(yǎng)（一）傳代培養(yǎng) 1. 1.傳代培養(yǎng)的概念傳代培養(yǎng)的概念 當原代培養(yǎng)細胞或已成為細胞系的細當原代培養(yǎng)細胞或已成為細胞系的細胞，增殖達到一定密度后，將培養(yǎng)的細胞胞，增殖達到一定密度后，將培養(yǎng)的細胞從一個容器以適當比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾從一個容器以適當比

2、率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)或繼代個容器中擴大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)。細胞生物學實驗 張 偉2. 2. 細胞傳代的意義與目的細胞傳代的意義與目的 防止細胞增殖過度、營養(yǎng)枯竭、酸中毒防止細胞增殖過度、營養(yǎng)枯竭、酸中毒 維持細胞種的維持細胞種的延續(xù)延續(xù)。 利用培養(yǎng)細胞利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗進行各種實驗。細胞生物學實驗 張 偉n傳代中的傳代中的 “代代”與細胞世代中的與細胞世代中的 “代代”不同不同n傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細胞的數(shù)量和細胞增殖速度有關(guān)。種細胞的數(shù)量和細胞增殖速度有關(guān)。 3. 3. 需要注意的兩個問題需要

3、注意的兩個問題細胞生物學實驗 張 偉（二）培養(yǎng)細胞的種類二）培養(yǎng)細胞的種類貼壁細胞貼壁細胞：附著在一個固相支持物表面才附著在一個固相支持物表面才能生長的細胞。如大部分的上皮來源的細能生長的細胞。如大部分的上皮來源的細胞。單層細胞，接觸抑制。胞。單層細胞，接觸抑制。半貼壁細胞半貼壁細胞：呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但不牢。呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但不牢。懸浮細胞懸浮細胞：不需附著在固相支持物表面，不需附著在固相支持物表面，懸浮即可生長的細胞。如血細胞等。懸浮即可生長的細胞。如血細胞等。細胞生物學實驗 張 偉 貼壁細胞貼壁細胞細胞生物學實驗 張 偉細胞生物學實驗 張 偉 懸浮型細胞。懸浮型細胞。細胞生物學實驗 張

4、 偉 半貼壁細胞半貼壁細胞細胞生物學實驗 張 偉 （三）細胞貼壁過程（三）細胞貼壁過程細胞生物學實驗 張 偉（四）細胞傳代后的四個生長階段四）細胞傳代后的四個生長階段n潛伏期：細胞無分裂，6-24小時。n指數(shù)生長期：細胞增殖最旺盛時期，分裂相細胞的比例（分裂指數(shù)）。n停滯期：細胞數(shù)量達到飽和，細胞停止增殖，但仍有代謝活動。平臺期。n衰退期：自然衰退和耗竭衰退。細胞生物學實驗 張 偉培養(yǎng)細胞一代生長過程細胞生物學實驗 張 偉（五）（五） 何時傳代與如何傳代？何時傳代與如何傳代？1. 肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度培養(yǎng)物顏色及混濁度細胞生物學實驗 張 偉2. 2. 倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)倒置顯微鏡

5、觀察細胞生長狀態(tài)細胞生物學實驗 張 偉 貼壁生長細胞傳代n棄掉培養(yǎng)液，加0.51mL的胰酶涮洗一下培養(yǎng)瓶，去殘留的舊培養(yǎng)液，解除血清對胰酶的抑制作用。 n每瓶細胞加入1mL胰酶, 蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞突起收回變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶去掉。注意勿使細胞提早脫壁落入消化液中。n加入5ml的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，制成細胞懸液計數(shù)然后分裝到新培養(yǎng)瓶中(1x105/ml ，5mL/小瓶） 。蓋上瓶蓋, 適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。細胞生物學實驗 張 偉 細胞消化的最佳程度細胞消化的最佳程度

6、細胞生物學實驗 張 偉懸浮細胞傳代步驟n可將細胞培養(yǎng)懸液進行離心去除舊培養(yǎng)液上清，加入新鮮培養(yǎng)液，然后分裝到各瓶中。細胞生物學實驗 張 偉( (六六) )細胞凍存細胞凍存細胞生物學實驗 張 偉 冷凍保護劑的種類及作用機制冷凍保護劑的種類及作用機制n常用滲透性冷凍保護劑主要包括常用滲透性冷凍保護劑主要包括甘油、甘油、DMSODMSO、乙、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。等。nDMSODMSO：對細胞無毒性，分子量小，溶解度好，能：對細胞無毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入細胞，降低冰點，提高細胞膜對水的通透迅速透入細胞，降低冰點，提高細胞膜對水的通透性，延緩凍結(jié)過程，

7、能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)之前透性，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)之前透出細胞外，在胞外形成冰晶，提高細胞內(nèi)的電解質(zhì)出細胞外，在胞外形成冰晶，提高細胞內(nèi)的電解質(zhì)濃度，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞凍傷。濃度，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞凍傷。常用濃度為常用濃度為5%-10%5%-10%，細胞在液氮中凍存，細胞在液氮中凍存1-21-2年，存年，存活率可達活率可達80%-90%80%-90%。DMSODMSO液需預先用培養(yǎng)液配液需預先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細胞好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細胞 細胞生物學實驗 張 偉二、實驗?zāi)康?掌握無菌操作技術(shù)。 掌握傳代細胞的培養(yǎng)的方法與步驟

8、。 掌握培養(yǎng)細胞的消化方法。 了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生長狀況。細胞生物學實驗 張 偉三、實驗材料及設(shè)備三、實驗材料及設(shè)備 1. 1. 細胞細胞 人宮頸癌人宮頸癌HeLa HeLa 細胞細胞 人胃癌人胃癌BGC-823BGC-823細胞細胞 中國倉鼠卵巢中國倉鼠卵巢CHOCHO細胞細胞2. 2. 試劑試劑 DMEMDMEM培養(yǎng)基、胰酶、血清、培養(yǎng)基、胰酶、血清、DMSODMSO、抗生素、抗生素 3. 3. 儀器儀器 超凈工作臺、超凈工作臺、COCO2 2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.4.其它用品：其它用品： 培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，培養(yǎng)瓶，

9、試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，7575酒精棉球，酒精燈酒精棉球，酒精燈 細胞生物學實驗 張 偉四、實驗步驟四、實驗步驟1. .準備準備：超凈工作臺紫外線處理：超凈工作臺紫外線處理3030分鐘分鐘, , 用肥皂洗手用肥皂洗手, , 穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2. 2. 倒置顯微鏡下倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置將培養(yǎng)用液置3737C C預預熱。熱。3 3關(guān)閉超凈臺紫外燈關(guān)閉超凈臺紫外燈, , 打開可見光燈開關(guān)打開可見光燈開關(guān), ,打開抽風打開

10、抽風機清潔空氣，除去臭氧。用機清潔空氣，除去臭氧。用75%75%酒精擦雙手消毒酒精擦雙手消毒 。 4.4.正確擺放超凈臺內(nèi)的實驗用品正確擺放超凈臺內(nèi)的實驗用品：酒精燈、酒精棉：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸等。點燃酒精燈，準備好實驗試筒（頭）、廢液缸等。點燃酒精燈，準備好實驗試劑：劑：DMEMDMEM培養(yǎng)基（其中血清含量培養(yǎng)基（其中血清含量10%10%）、）、 血清、血清、胰酶等。胰酶等。細胞生物學實驗 張 偉細胞生物學實驗 張 偉5.點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸點燃酒精燈；取出無菌試管，巴

11、士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。管內(nèi)。6.6.將培養(yǎng)液瓶（將培養(yǎng)液瓶（90mL) 90mL) 過酒精燈火焰后斜置于酒精燈過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。旁的架子上。7. 7. 打開血清打開血清瓶（瓶（10.5mL) 10.5mL) ，瓶口，瓶口過酒精燈火焰后斜置過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。于酒精燈旁的架子上。8. 8. 無菌吸取無菌吸取10mL10mL血清血清加入加入到到培養(yǎng)液（培養(yǎng)液（90mL)90mL)中，用中，用微量移液器加入雙抗微量移液器加入雙抗200200L L輕輕混勻，配置完全輕輕混勻，配

12、置完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。9. 9. 在在血清中血清中（剩余（剩余0.5mL0.5mL) ) 加入加入4mL4mL完全培養(yǎng)基輕輕完全培養(yǎng)基輕輕混勻，加入混勻，加入0.5mL0.5mL DMSO DMSO（凍存保護劑），輕輕混（凍存保護劑），輕輕混勻即為凍存液勻即為凍存液 。細胞生物學實驗 張 偉細胞生物學實驗 張 偉10.細胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消細胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對于小口的培養(yǎng)瓶可采用毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法傾倒方法, ,對于培養(yǎng)皿對于培養(yǎng)皿, ,必須用吸管吸出）必須用吸管吸出）11.11.加一滴管胰酶輕輕

13、漂洗一下細胞加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細胞，棄胰酶，再，棄胰酶，再加加入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細胞量為準入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細胞量為準) )，轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個細胞層，蓋好瓶蓋。培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個細胞層，蓋好瓶蓋。12.12.顯微鏡下觀察細胞的消化狀態(tài)，顯微鏡下觀察細胞的消化狀態(tài)，待細胞大部分收待細胞大部分收縮、突起、變圓，細胞邊界清晰時，即可立起或翻縮、突起、變圓，細胞邊界清晰時，即可立起或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺內(nèi)靠近火焰處棄胰酶，在超凈臺內(nèi)靠近火焰處棄胰酶. .細胞生物學實驗 張 偉13. 加兩滴管（約加兩滴管（約1.8-2mL1.8-2mL）

14、凍存液既凍存液既全面吹打細胞全面吹打細胞瓶瓶壁壁, ,吹打均勻，細胞濃度宜大，吹打均勻，細胞濃度宜大，3 310106 6個個/mL/mL左右。左右。14.14.將細胞懸液吸至凍存管中將細胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并，擰好蓋，封好膠布，并標記好細胞種類，凍存時間標記好細胞種類，凍存時間，保存條件以及凍存者，保存條件以及凍存者姓名等（懸浮細胞凍存將細胞離心后再加凍存液）姓名等（懸浮細胞凍存將細胞離心后再加凍存液）15.15.在培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)瓶( (殘余少量細胞）中加入殘余少量細胞）中加入5mL5mL完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基及，及，蓋好瓶蓋（擰緊后并旋回半圈）。做好記錄，倒置蓋好瓶蓋（擰緊后

15、并旋回半圈）。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，放入相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，放入CO2CO2培養(yǎng)箱培培養(yǎng)箱培養(yǎng)。養(yǎng)。16.16.凍存管在凍存管在4 4度存放度存放30min30min，轉(zhuǎn)放到，轉(zhuǎn)放到2020度度 1.51.52h2h，再轉(zhuǎn)到再轉(zhuǎn)到7070度度4 412h12h后即可轉(zhuǎn)移到后即可轉(zhuǎn)移到液氮液氮內(nèi)，注意做內(nèi)，注意做好凍存記錄好凍存記錄。細胞生物學實驗 張 偉把握好傳代時機，80-90%匯合度階段最好，過早細胞產(chǎn)量少，過晚細胞健康狀態(tài)不佳消化時間要適度，過短細胞不易脫落，過長細胞可脫落流失。消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反應(yīng)快，所需消化時間短，掌握不好，細胞易流失。不同細胞對消化反應(yīng)