同濟(jì)考博-分子生物學(xué)真題-答案(共17頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)2001年分子生物學(xué)（博士）一、英漢互譯下列名詞，并加以解釋(30分)1、transposable element 轉(zhuǎn)座子：基因組中可移動(dòng)的DNA分子，在真核生物的基因和基因組進(jìn)化中起著重要的作用。2、restriction enzyme 能夠特異性識(shí)別dsDNA序列，并且能夠在識(shí)別位點(diǎn)及其周圍切斷DNA的核酸內(nèi)切酶3、derepression 去阻扼：阻遏蛋白從啟動(dòng)子，操縱子區(qū)脫離，解除抑制。染色質(zhì)去阻扼后出現(xiàn)的開放構(gòu)象，能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。例如，乳糖操縱子中，乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，改變阻遏蛋白的構(gòu)象，使之不再與操縱基因結(jié)合，RNA-pol II就與啟動(dòng)子結(jié)合

2、，開始轉(zhuǎn)錄翻譯出三種酶，乳糖就是阻遏蛋白與操縱子分離的誘導(dǎo)物。4、gene therapy 基因治療：是以改變?nèi)说倪z傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療，用一定方法(病毒載體，非病毒載體)將正常人野生型基因或有治療作用的基因?qū)牖颊甙屑?xì)胞內(nèi)，從而置換或者矯正致病基因的一種治療方法。5、calmodulin 鈣調(diào)蛋白：鈣調(diào)蛋白是真核生物細(xì)胞胞質(zhì)溶膠蛋白，由148個(gè)氨基酸組成單條多肽，16.7kDa。一種能與鈣離子可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)。鈣離子被稱為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，其濃度變化可調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，這種調(diào)節(jié)作用主要是通過鈣調(diào)蛋白而實(shí)現(xiàn)的。6、操縱子 ：指包含結(jié)構(gòu)基因、操縱基因以及啟動(dòng)基因的一些相 操縱子鄰基因組成的D

3、NA片段，其中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受到操縱基因的調(diào)控。主要見于原核生物，但在真核生物中也存在。7、反式作用因子： 一些細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)可以與順式作用原件和RNA-pol相互作用，來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Cis-acting element: 真核基因非編碼區(qū)中能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子。8、基因組 一個(gè)細(xì)胞，或生物體內(nèi)的全部基因，全部遺傳信息。9、原癌基因 細(xì)胞癌基因，正常情況下靜止或極少表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖有重要作用。一旦激活可以導(dǎo)致細(xì)胞惡變，誘發(fā)腫瘤的基因。激活方式有：點(diǎn)突變、獲得啟動(dòng)子、基因擴(kuò)增、染色體易位或重排。10、多克隆位點(diǎn)：載體中有多個(gè)限制性內(nèi)切

4、酶的識(shí)別位點(diǎn)，能夠插入多個(gè)外源基因并且能否復(fù)制的位點(diǎn)。二、試述反式作用因子的結(jié)構(gòu)特征及作用方式(20分)Trans-acting factor是一類細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)因子，能夠與順式作用元件和RNA-pol相互作用，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。一般含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：（1） Helix-turn-helix 含有3個(gè)helix，其中helix3與DNA識(shí)別結(jié)合，helix1和helix2與其它蛋白質(zhì)結(jié)合。（2）Zenic finger鋅指結(jié)構(gòu)：由相對(duì)保守的一段氨基酸序列和鋅離子結(jié)合，形成相對(duì)獨(dú)立的功能域，像一根手指插入DNA的大溝。兩種類型的DNA結(jié)合蛋白有這樣的模序，

5、一是鋅指蛋白，另一個(gè)是甾體受體。（3）Leucine Zipper：亮氨酸拉鏈，兩個(gè)蛋白質(zhì)之間相互作用，共同建立一個(gè)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。是一種富含亮氨酸的蛋白質(zhì)形成的二聚體motif。這種motif可以識(shí)別特殊的DNA序列。兩個(gè)亮氨酸拉鏈區(qū)的反式作用因子依靠疏水力量相互結(jié)合，N-端有堿性氨基酸構(gòu)成的a-helix能夠與DNA結(jié)合。Eg: AP1與SV40增強(qiáng)子的結(jié)合（4）helix-loop-helix: 兼性a-helix具有疏水面和親水面，兩個(gè)具有這種的motif反式因子可以形成dimer。僅靠helix的N-端有一段富含堿性氨基酸的序列可以與DNA結(jié)合。HLH以同二聚體或者異二聚體作用于順式作用

6、元件。（5）同源異形結(jié)構(gòu)域homeodomain, 同源異性盒是一種編碼60aa的序列，長(zhǎng)180bp，幾乎存在于所有真核生物中。轉(zhuǎn)錄激活域：與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的結(jié)構(gòu)成分。常見的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域有富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域，富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域及酸性螺旋結(jié)構(gòu)域。三、試述2型限制酶的功能與特性(20分) 型酶相對(duì)來說最簡(jiǎn)單，它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割 DNA ，產(chǎn)生帶 3'- 羥基和 5'- 磷酸基團(tuán)的 DNA 產(chǎn)物，需 Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需 SAM 。識(shí)別序列主要為 4-6bp ，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列

7、，切割位置因酶而異，有些是隔開的。 有特異識(shí)別和切割的序列部位 DNA分子上兩個(gè)單鏈斷裂的部位通常不是直接相對(duì)的 斷裂所形成的DNA片段常具有堿基互補(bǔ)的單鏈尾巴（粘性末端） 內(nèi)切酶的切割和修飾功能由兩個(gè)不同的酶催化所完成，即內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開的四、試述影響原核基因轉(zhuǎn)錄的因素(20分)原核基因表達(dá)調(diào)控與真核存在很多共同之處，但因原核生物沒有細(xì)胞核和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其基因組結(jié)構(gòu)要比真核生物簡(jiǎn)單，基因表達(dá)的調(diào)控因此而比較簡(jiǎn)單。雖然原核基因的表達(dá)也受轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄終止、翻譯調(diào)控及RNA、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等多級(jí)調(diào)控，但其表達(dá)開、關(guān)的關(guān)鍵機(jī)制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始。其特點(diǎn)包括以下3方面：（1）因子決定

8、RNA聚合酶的識(shí)別特異性：原核生物只有一種RNA聚合酶，核心酶催化轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)， 亞基識(shí)別特異啟動(dòng)序列，即不同的 因子協(xié)助啟動(dòng)不同基因的轉(zhuǎn)錄。（2）操縱子模型的普遍性：除個(gè)別基因外，原核生物絕大數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地連續(xù)排列在染色體上，共同組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位即操縱子，如乳糖操縱子等。一個(gè)操縱子含一個(gè)啟動(dòng)序列及數(shù)個(gè)編碼基因。在同一個(gè)啟動(dòng)序列控制下，轉(zhuǎn)錄出多順反子mRNA。（3）阻遏蛋白與阻遏機(jī)制的普遍性：在很多原核操縱子系統(tǒng)，特異的阻遏蛋白是控制啟動(dòng)序列活性的重要因素。當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合或解離時(shí)，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄被阻遏或去阻遏。原核生物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄和翻譯同時(shí)進(jìn)行。五、試述病毒核酸的結(jié)構(gòu)

9、特點(diǎn)(10分) （1）病毒內(nèi)的核酸結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，其遺傳物質(zhì)可以是DNA或者RNA，也有阮粒病毒以蛋白質(zhì)作為遺傳物質(zhì)，成熟的病毒內(nèi)只有一種遺傳物質(zhì)，要么是DNA，要么是RNA。（2）病毒基因可以連續(xù)也可以中斷，很少有重復(fù)序列。病毒基因組大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的，其編碼區(qū)大于901%。非編碼區(qū)較少。非編碼區(qū)通常是基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)（3）有重疊基因存在，使得較小的基因片段可以攜帶較多的遺傳信息。（4）病毒基因組是單倍體，功能相關(guān)的蛋白質(zhì)基因常常叢集于基因組的一個(gè)或者多個(gè)特定部位，形成一個(gè)功能單元或者轉(zhuǎn)錄單元。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院2002年攻讀博士學(xué)位研究生入學(xué)考試試題考試科目：分子生物學(xué)（基礎(chǔ)課）科

10、目代碼：811一名詞解釋并寫出對(duì)應(yīng)的英文名詞（共10小題，每小題5分，共50分）1.克隆載體 2.表達(dá)載體 3.假基因 4.微衛(wèi)星序列 5.回文結(jié)構(gòu) 6.啟動(dòng)子7.癌基因 8.多克隆位點(diǎn) 9.增強(qiáng)子 10. 開放閱讀框架1.克隆載體：為“攜帶”感興趣的外源DNA、實(shí)現(xiàn)外源DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。一般為質(zhì)?；蛘呤删w。2.表達(dá)載體：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的克隆載體3. 假基因：多基因家族中，某些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因叫假基因?？梢宰鳛檗D(zhuǎn)座子的一部分。4. 微衛(wèi)星序列：真核基因中2-6bp的短串聯(lián)重復(fù)序列，數(shù)目非常多

11、，分散于基因組中。衛(wèi)星DNA構(gòu)成著絲粒，端粒，Y染色體異染色質(zhì)區(qū)?？梢宰鳛榈诙z傳標(biāo)記，用于連鎖分析，親子鑒定，個(gè)體識(shí)別。5. 回文結(jié)構(gòu)：兩個(gè)序列相同的DNA單鏈反向堿基互補(bǔ)，串聯(lián)重復(fù)，又叫反向重復(fù)序列，是限制性內(nèi)切酶II的識(shí)別位點(diǎn)，也是轉(zhuǎn)錄終止的識(shí)別區(qū)。可以構(gòu)成十字狀結(jié)構(gòu)。雙鏈DNA中含有的二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列稱為反向重復(fù)序列，也稱為回文結(jié)構(gòu)。6.啟動(dòng)子：真核基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，能夠與RNA聚合酶結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段特異性核苷酸序列。7. 癌基因：能夠?qū)е录?xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，分為病毒癌基因和細(xì)胞癌基因。8.多克隆位點(diǎn)：有個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，可以讓多個(gè)外源基因插入的載體位點(diǎn)

12、。二問答題（共3小題，每小題10分，共30分）1.若要獲得IL-2的基因工程產(chǎn)品，你應(yīng)該怎么做？基因工程是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作，又叫分子克隆，DNA重組技術(shù)。1. 在GENBANK中檢索IL-2的mRNA序列；在genecard里檢索IL-2高表達(dá)的組織；同時(shí)檢索一下有關(guān)文獻(xiàn)；2. 如果考慮使用原核表達(dá)系統(tǒng)（通常是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)），將IL-2的成熟肽的基因序列找出（呵呵，我沒有檢索，不清楚是否有信號(hào)肽）進(jìn)行分析；3. 根據(jù)表達(dá)載體，設(shè)計(jì)含有合適酶切位點(diǎn)的、對(duì)應(yīng)成熟肽編碼區(qū)的引物；4.

13、 提取IL-2高表達(dá)的組織的mRNA，RT-PCR，T載體克隆或直接酶切克隆至表達(dá)載體中、測(cè)序。2.真核細(xì)胞中基因表達(dá)的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是指什么？根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特征可以分為哪些類型？它們和DNA相互識(shí)別的原理是什么？特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是指是除基本轉(zhuǎn)錄因子之外，與轉(zhuǎn)錄核心區(qū)以外的順式作用元件相結(jié)合，影響基因轉(zhuǎn)錄的因子，分為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。與GGGCGG結(jié)合的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子叫Sp1。與CCAAT結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子叫CBF。大多數(shù)類固醇激素與受體結(jié)合之后，構(gòu)成特異性轉(zhuǎn)錄因子，與順式作用元件結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄。也有轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制因子，可以覆蓋轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，覆蓋轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。還有HSP。與

14、DNA的識(shí)別模式有：(1)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋，helix3識(shí)別結(jié)合DNA，helix1,helix2結(jié)合其它蛋白質(zhì)因子。(2)Zenic finger與DNA大溝相結(jié)合，可以與RNA-pol3及其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用。(3)亮氨酸拉鏈： N-末端由堿性氨基酸構(gòu)成的a-helix可以與DNA相結(jié)合. (4)helix-loop-helix 兼性a-helix具有疏水側(cè)面和親水側(cè)面，兩個(gè)具有這種motif的反式因子可以形成dimer。緊靠helix N-末端的堿性氨基酸組成的序列可以結(jié)合DNA。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)都有特定的空間構(gòu)型和帶電性質(zhì)?？梢院徒Y(jié)構(gòu)和電荷量相匹配的DNA結(jié)合。3.簡(jiǎn)述細(xì)胞內(nèi)癌基

15、因激活的方式？(1) 點(diǎn)突變：基因中單個(gè)堿基替換，引起表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列改變。例如，結(jié)腸癌中常有k-ras基因的點(diǎn)突變。(2) 插入啟動(dòng)子：多見于癌癥的起始階段。某些病毒(ALV)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)含有啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞之后，插入到原癌基因周圍或內(nèi)部，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，活化。例如ALV的LTR插入到c-myc周圍，可以使其表達(dá)水平提高20-76倍。(3)基因擴(kuò)增：見于癌癥進(jìn)展期。癌基因不斷復(fù)制，拷貝數(shù)增多。在染色質(zhì)中有淺染區(qū)，均質(zhì)染色質(zhì)。其不斷復(fù)制擴(kuò)增，可以脫離染色體，形成雙微體。例如，在小細(xì)胞肺癌中，c-myc擴(kuò)增，膠質(zhì)瘤中ERBB1擴(kuò)增，神經(jīng)纖維瘤中，n-myc擴(kuò)增。(4) 染色

16、體易位和重排：染色體易位時(shí)，如果斷裂點(diǎn)發(fā)生在原癌基因周圍，可以改變癌基因的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，使之激活。例如，在Burkitt淋巴瘤中，有t(8;14),(q24;q32)易位。慢性粒細(xì)胞白血病中有BCL/ABL融合基因，使絡(luò)氨酸蛋白激酶激活，不受生長(zhǎng)因子/受體的調(diào)控，使c-ABL活化，導(dǎo)致CML。三選答題（任選2小題，每小題10分，共20分）1.簡(jiǎn)述基因治療中轉(zhuǎn)移外源基因至體內(nèi)的非病毒和病毒途徑的主要原理 非病毒途徑有(1)直接注射法：將含有裸DNA的溶液直接對(duì)患者肌肉注射，DNA轉(zhuǎn)入肌組織，并向全身表達(dá)目的基因的產(chǎn)物?？梢猿掷m(xù)幾個(gè)月到1年多。但是，轉(zhuǎn)入效率很低。僅限于肌肉組織。(2)電穿孔

17、法：在高壓電脈沖作用下，使細(xì)胞膜打孔，讓外源DNA迅速導(dǎo)入宿主細(xì)胞。主要與電壓和脈沖時(shí)間有關(guān)。(3) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移法：用磷脂雙分子層包裹目的基因，與細(xì)胞膜有類似的結(jié)構(gòu)，通過內(nèi)吞作用，進(jìn)入細(xì)胞，可以防止細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解目的基因。(4)陽(yáng)離子多聚體：陽(yáng)離子聚胺與陰離子DNA形成復(fù)合物，與細(xì)胞表面帶負(fù)電的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。沒有細(xì)胞特異性，沒有靶向性，基因轉(zhuǎn)移效率低。(5) 同源重組法：外源基因?qū)Ｒ坏恼系绞荏w細(xì)胞的特定部位，基因修正。 病毒途徑：病毒載體的要求：可以有效地進(jìn)入靶細(xì)胞，具有可插入治療基因的較大空間和篩選標(biāo)記，具有控制治療基因表達(dá)的順式作用元件。(1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒：反轉(zhuǎn)錄病

18、毒雖是RNA病毒，但有，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。具有穿透細(xì)胞的能力，可使近100%的受體細(xì)胞被感染，轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高。無嚴(yán)格的組織特異性，隨機(jī)整合的病毒可長(zhǎng)期存留，對(duì)細(xì)胞無害。這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細(xì)胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細(xì)胞，如。由于病毒自身含有病毒癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險(xiǎn)性。人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細(xì)胞的功能，試圖避免上述缺點(diǎn)。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒（defective virus）。這樣的中的反轉(zhuǎn)錄酶可將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，有助于該DNA順利進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組

19、，而該病毒則死亡。(2) 介導(dǎo)載體（DNA viral mediated vector）：DNA病毒包括、SV40、牛乳頭瘤病毒、等，一般認(rèn)為這類病毒難于改造成缺陷型病毒。牛乳頭瘤病毒重組后，可不插入染色體中引起插入突變，又可在宿主外獨(dú)立復(fù)制，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。設(shè)計(jì)了一個(gè)新的腺病癥，它是用一個(gè)化學(xué)連接器即賴氨酸鏈（lysine chain）將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運(yùn)輸器，通過一個(gè)表面抗體而進(jìn)入，使宿主基因與治療基因共同表達(dá)。這個(gè)新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA復(fù)合體（adeno virus-polylysine DNA-complex）?；蛑委煹幕境绦颍阂?治療的獲得(二)的選

20、擇(三)靶細(xì)胞的選擇(四)基因轉(zhuǎn)移方法(五)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定(六)回輸體內(nèi)2.請(qǐng)你評(píng)價(jià)一下人類基因組計(jì)劃（HGMP）完成的意義(1)對(duì)人類疾病基因研究的貢獻(xiàn)人類疾病相關(guān)的基因是人類基因組中結(jié)構(gòu)和功能完整性至關(guān)重要的信息。對(duì)于單基因病，采用“定位克隆”和“定位候選克隆”的全新思路，導(dǎo)致了亨廷頓氏舞蹈癥、遺傳性結(jié)腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎(chǔ)。對(duì)于心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經(jīng)精神類疾?。ɡ夏晷园V呆、精神分裂癥）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點(diǎn)。健康相關(guān)研究是HGP的重要組成部分，1997年相繼提出：“腫瘤基因組解剖計(jì)

21、劃”“環(huán)境基因組學(xué)計(jì)劃”。(2)對(duì)醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn):基因診斷、基因治療和基于基因組知識(shí)的治療、基于基因組信息的疾病預(yù)防、疾病易感基因的識(shí)別、風(fēng)險(xiǎn)人群生活方式、環(huán)境因子的干預(yù)對(duì)生物技術(shù)的貢獻(xiàn) 胚胎細(xì)胞克隆羊多利基因工程藥物分泌蛋白（多肽激素，生長(zhǎng)因子，趨化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受體。診斷和研究試劑產(chǎn)業(yè)基因和抗體試劑盒、診斷和研究用生物芯片、疾病和篩藥模型。對(duì)細(xì)胞、胚胎、組織工程的推動(dòng)胚胎和成年期干細(xì)胞、克隆技術(shù)、器官再造。(3)對(duì)制藥工業(yè)的貢獻(xiàn)篩選藥物的靶點(diǎn)：與組合化學(xué)和天然化合物分離技術(shù)結(jié)合，建立高通量的受體、酶結(jié)合試驗(yàn)以知識(shí)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)：基因蛋白產(chǎn)物的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析、預(yù)測(cè)、模擬藥物作用“

22、口袋”。個(gè)體化的藥物治療：藥物基因組學(xué)。(4)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的重要影響生物產(chǎn)業(yè)與信息產(chǎn)業(yè)是一個(gè)國(guó)家的兩大經(jīng)濟(jì)支柱；發(fā)現(xiàn)新功能基因的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益；轉(zhuǎn)基因食品；轉(zhuǎn)基因藥物（如減肥藥，增高藥）(5)對(duì)生物進(jìn)化研究的影響生物的進(jìn)化史，都刻寫在各基因組的“天書”上；草履蟲是人的親戚13億年；人是由300400萬(wàn)年前的一種猴子進(jìn)化來的；人類第一次“走出非洲”200萬(wàn)年的古猿；人類的“夏娃”來自于非洲，距今20萬(wàn)年第二次“走出非洲”？(6)帶來的負(fù)面作用侏羅紀(jì)公園不只是科幻故事；種族選擇性滅絕性生物武器；基因?qū)＠麘?zhàn)；基因資源的掠奪戰(zhàn)；基因與個(gè)人隱私。3.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中所涉及的引物有哪幾種，各有什么用途和特點(diǎn)

23、？1）純粹的用于擴(kuò)增目的基因片段的引物，這種引物一般都是成對(duì)出現(xiàn)。2）用于基因測(cè)序用的引物，一般如果所測(cè)的片段長(zhǎng)度短的話（小于800bp），可以用一條，當(dāng)然兩條正反通測(cè)也可以。3）用于篩選的引物，比如平時(shí)常見的SSP，RFLP等引物，這種引物也是成對(duì)出現(xiàn)的，但主要用于基因多態(tài)性篩選的，針對(duì)單位點(diǎn)多態(tài)性來說。4.簡(jiǎn)述34種PCR衍生技術(shù)及其應(yīng)用(1) Anchored PCR:用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA 3末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用：擴(kuò)增未知或全知序列，如未知cDNA的制備，低豐度cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。(2) 不對(duì)稱PCR：兩種引物濃度比例相

24、差較大的PCR技術(shù)。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度，常用50-100：1的比例。最初10-15個(gè)循環(huán)主要產(chǎn)物是dsDNA，但是，低濃度引物被耗盡之后，高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA。應(yīng)用：制備ssDNA片段，用于序列分析或者核酸雜交的探針。(3) RT-PCR 當(dāng)擴(kuò)增模板為RNA時(shí)，需要先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能擴(kuò)增。RT-PCR應(yīng)用非常廣泛，無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)都經(jīng)常用。(4) 修飾引物PCR 為達(dá)到某些特殊的應(yīng)用目的，如定向克隆，定點(diǎn)突變，體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物5端加上酶切位點(diǎn)，突變序列，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，序列分析結(jié)合位點(diǎn)等。ASO-PCR, SSCP

25、-PCR,real-time PCR, Taqman-PCR,同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)2003年分子生物學(xué)（博士）811一名詞解釋并寫出對(duì)應(yīng)的英文名詞（共10小題，每小題5分，共50分）1.克隆載體 2.表達(dá)載體 3.斷裂基因 4.雙脫氧核苷酸（簡(jiǎn)單）5.多克隆位點(diǎn)6.啟動(dòng)子 7.癌基因 8.核糖體結(jié)合位點(diǎn)（簡(jiǎn)單） 9.增強(qiáng)子 10.開放閱讀框架1.克隆載體：為“攜帶”感興趣的外源DNA、實(shí)現(xiàn)外源DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。一般為質(zhì)?；蛘呤删w。2.表達(dá)載體：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的克隆載體3. 斷裂基因：真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非

26、編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。4. 雙脫氧核苷酸: 3-雙脫氧核糖通過糖苷鍵連接而成的化合物，主要用于Sanger法測(cè)序。雙脫氧核苷酸終止子是指在脫氧核苷酸的3號(hào)碳上面連接的一個(gè)可逆阻斷的熒光基團(tuán)，使之無法直接與下一個(gè)脫氧核苷酸生成磷酸二酯鍵，DNA鏈暫時(shí)被終止。8. 核糖體結(jié)合位點(diǎn)是mRNA上的特異性序列，核糖體可以識(shí)別并結(jié)合這一序列來啟動(dòng)翻譯過程。在原核生物中該序列稱為SD序列，在真核生物中則稱為Kozak序列10.開放閱讀框open reading frame，ORF 是結(jié)構(gòu)基因的正常核苷酸序列，從起始

27、密碼子到終止密碼子的閱讀框可編碼完整的多肽鏈，其間不存在使翻譯中斷的終止密碼子二問答題（共3小題，每小題10分，共30分）1.什么是分子克隆技術(shù)？它的主要步驟是什么？在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再?gòu)暮Y選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。2.真核細(xì)胞和原核細(xì)胞基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的特點(diǎn)。原核細(xì)胞： 1.轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控：(1) 因子與啟動(dòng)子的作用模式 原核細(xì)胞的RNA-pol只有一種，組成成

28、分為2bb 因子與啟動(dòng)子結(jié)合。在原核生物分化發(fā)育過程中，不同基因有序表達(dá)也是不同因子在不同時(shí)間產(chǎn)生并發(fā)揮作用引起的。(2) 轉(zhuǎn)錄起始的負(fù)調(diào)控 最典型的是乳糖操縱子的調(diào)節(jié)(3) 轉(zhuǎn)錄起始的正調(diào)控 典型例子是阿拉伯糖操縱子，ara C基因產(chǎn)物Ara C起著關(guān)鍵作用，當(dāng)環(huán)境中有阿拉伯糖時(shí)，Ara C形成dimer與I1、I2結(jié)合，激活BAD基因轉(zhuǎn)錄。(4) 轉(zhuǎn)錄起始的復(fù)合調(diào)控 葡萄糖代謝產(chǎn)物的分解阻遏負(fù)調(diào)控和CAP-cAMP復(fù)合物的正調(diào)控。2. 轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控：(1) 依賴于因子的轉(zhuǎn)錄終止，色氨酸操縱子中有衰減子(2) 不依賴于因子的轉(zhuǎn)錄終止，識(shí)別發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄停止。真核細(xì)胞：1.轉(zhuǎn)錄前調(diào)控：(1)

29、染色體結(jié)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響： 疏松的染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活躍(2)DNA的修飾：真核基因CpG island中的C通常被甲基化，阻礙某些基因轉(zhuǎn)錄。2. 順式作用元件：真核基因非編碼區(qū)中調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子。3.反式作用因子：一類細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)因子，可以與RNA-pol和順式作用元件相互作用，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。(1)基本轉(zhuǎn)錄因子：在真核基因啟動(dòng)子上，參與組裝轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的蛋白質(zhì)因子。TFII有6種。(2)特異性轉(zhuǎn)錄因子：結(jié)合在核心轉(zhuǎn)錄原件以外的其它上游順式作用元件的蛋白質(zhì)因子，通過DNA-蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，可以對(duì)環(huán)境變化迅速作出反應(yīng)。與GGGCGG box結(jié)合的激活

30、蛋白稱為SP1;與CCAAT box結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子稱為CBF。SP1和CBF都能夠與特異性的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。多種類固醇激素也是特異轉(zhuǎn)錄因子，與相應(yīng)受體結(jié)合后，作用于激素應(yīng)答序列，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。此外，在真核基因中也存在轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以覆蓋轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，或者覆蓋轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄。2. 反式作用因子與DNA相互作用的模式：helix-turn-helix, Zenic finger, leucine zipper, helix-loop-helix.3. 就你所知RNA研究領(lǐng)域中，理論和技術(shù)方面的進(jìn)展有哪些。RNA具有生物功能多樣性，在遺傳信息的翻譯中起決定作用，m

31、RNA有信使和模板的作用，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA可以轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和信息交換，rRNA有裝配和催化作用。1992年Holler等證明轉(zhuǎn)肽反應(yīng)有核糖體大亞基催化。核酶的發(fā)現(xiàn)RNA具有催化功能和持家功能。RNA編輯：RNA編碼序列的改變稱為RNA編輯。hnRNA snRNA戴帽加尾防止降解。反義RNA：與mRNA序列互補(bǔ)的一段RNA，可以沉默mRNA的翻譯。(1). RNA剪切是真核生物基因表達(dá)過程中一個(gè)非常重要的機(jī)制，經(jīng)過RNA的剪切、連接以后即可產(chǎn)生具有編碼信息功能的mRNA。RNA剪切機(jī)制在生物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中至關(guān)重要。RNA剪切就是將基因組中轉(zhuǎn)錄出來的RNA前體中的內(nèi)含子剪切出去，然后再在相應(yīng)酶的作用下將

32、剪切后的RNA重新連接起來. RNA的剪切位置主要依賴于剪切位點(diǎn)的判定，剪切位點(diǎn)一般都具有其專屬特定的序列。麻省理工學(xué)院的研究人員開發(fā)出一種新的計(jì)算方法來預(yù)測(cè)遺傳材料中的哪些序列轉(zhuǎn)錄為RNA時(shí)會(huì)象電影剪接室中被剪掉的膠片一樣被剪切掉，哪些會(huì)最終幸運(yùn)地成為生命的藍(lán)圖。(2) RNA測(cè)序分析中的最新進(jìn)展使用一種叫做RNA-seq的技術(shù)，最新的高通量DNA測(cè)序技術(shù)現(xiàn)在能夠被大規(guī)模地應(yīng)用于捕獲一個(gè)細(xì)胞中整套的mRNA轉(zhuǎn)錄本。盡管RNA-seq才僅僅兩歲，但是它已經(jīng)迅速蔓延到基因組學(xué)領(lǐng)域，并且它現(xiàn)在正在被用于分析從細(xì)菌到靈長(zhǎng)類生物的轉(zhuǎn)錄組。測(cè)序的深度允許研究者定量基因表達(dá)水平，以在真核生物物種中發(fā)現(xiàn)選擇

33、性異構(gòu)體，甚至描述細(xì)菌基因組的操縱子結(jié)構(gòu)(3) RNA干擾技術(shù)研究新進(jìn)展RNA干擾( RNA interfer ence, RNAi)是由雙鏈 RNA 介導(dǎo)的序列特異的基因沉默現(xiàn)象, 它在轉(zhuǎn)錄水平、 轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá),具有高效性和高特異性的特點(diǎn)。小干擾 RNA ( small interfer ing RNA 或 shor t inter fering RNA, siRNA) 是 RNAi作用中的效應(yīng)分子,作為引導(dǎo)序列, 按照堿基互補(bǔ)原則識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄出的信使 RNA( mRNA) , 并引導(dǎo)沉默復(fù)合物( RNAinduced silencing complex , RIS

34、C) 復(fù)合體結(jié)合mRNA。隨后 siRNA 與 mRNA 在復(fù)合體中換位, 核酸酶 Dicer 將 mRNA 切割成 21 23 核苷酸的片段, 從而可以破壞特定目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA, 使其功能沉默。應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，腫瘤治療，白血病治療，抗病毒。4. 簡(jiǎn)述PCR技術(shù)中引物設(shè)計(jì)的要點(diǎn)。首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（1）原則：用于PCR反應(yīng)的引物需要有兩條被擴(kuò)增目的基因的兩端，并分別與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)；引物長(zhǎng)度一般以18-25個(gè)核苷酸為宜；兩條引物之間（尤其在3端）的序列不能有互補(bǔ)，

35、以免形成引物二聚體；引物的堿基組成應(yīng)平衡，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積。PCR擴(kuò)增中得退火溫度是根據(jù)引物的Tm值決定的，兩條引物的Tm值不能差別太大；根據(jù)需要，可以在合成引物時(shí)于其5端加修飾成分。1、長(zhǎng)度：1530bp，其有效長(zhǎng)度Ln=2(G十C)十(A十T)一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產(chǎn)物的特異性。2、G十c含量：應(yīng)在45%一55%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去510度。引物長(zhǎng)度小于20時(shí)，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。3、堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿

36、基。尤其是不應(yīng)在其3端出現(xiàn)超過3個(gè)的連續(xù)G或C，否則會(huì)使引物在G十C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。4、引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。5、引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)2003年分子生物學(xué)（專業(yè)）（博士） 考試科目：分子生物學(xué)（專業(yè)課）科目代碼：949一、將下列名詞譯成英文并解釋（20分）1、基因組2、操縱子3、反式作用因子4、癌基因5、鋅指結(jié)構(gòu)6、聚合酶鏈反應(yīng)一種在體外擴(kuò)增DNA片段的重要技術(shù)。當(dāng)存在模板DNA、底物、上下游引物和耐熱的DNA聚合酶時(shí)，經(jīng)過多次“變性-復(fù)性-延伸反應(yīng)”的循環(huán)過程，

37、模板DNA可擴(kuò)增至幾百萬(wàn)倍。7、限制酶8、多克隆位點(diǎn)9、基因治療10、質(zhì)粒二、試述真核基因組結(jié)構(gòu)的基本特點(diǎn)。（20分）1.真核生物基因組DNA與結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因的基因組是雙份的（即雙倍體,diploid），即有兩份同源的基因組。2.真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。一個(gè)結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個(gè)mRNA分子和一條多肽鏈。3.存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達(dá)百萬(wàn)次以上。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。5.大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的。6.基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于的基因組，具有許多復(fù)制起點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長(zhǎng)度較小。原核生物基因組特點(diǎn)1. 基因組多數(shù)由環(huán)狀

38、雙鏈DNA分子組成2.具有類核結(jié)構(gòu)3.操縱子結(jié)構(gòu)(operon):功能上相關(guān)的幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因往往串聯(lián)排列在一起,受上游共同的調(diào)控區(qū)和下游轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所構(gòu)成的基因表達(dá)單位.轉(zhuǎn)錄時(shí),幾個(gè)基因轉(zhuǎn)錄在一條mRNA鏈上,再分別翻譯成各自不同的蛋白質(zhì).4.結(jié)構(gòu)基因中無內(nèi)含子,與真核細(xì)胞的主要區(qū)別.編碼區(qū)基因占基因組比例約50%左右,存在間隔區(qū).5.DNA絕大部分用于編碼蛋白質(zhì),結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝,6.結(jié)構(gòu)基因中無重疊現(xiàn)象(一段DNA序列編碼幾種蛋白質(zhì)多肽鏈)7.基因組中存在重復(fù)序列8.基因組中存在可移動(dòng)的DNA序列,如轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒等三、試述重組DNA的基本過程。（20分）DNA重組（DNA recombin

39、ation）指分子內(nèi)或分子間發(fā)生的的重新共價(jià)組合過程。包括同源重組、特異位點(diǎn)重組和轉(zhuǎn)座重組等類型，廣泛存在于各類生物。體外通過人工DNA重組可獲得重組體DNA，是基因工程中的.四、真核生物基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上是如何調(diào)控的？（20分）五、試述基因治療研究的主要內(nèi)容或策略。（20分）基因治療（gene therapy）是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。包括體細(xì)胞治療和生殖細(xì)胞治療。一般程序：1.治療基因的選擇：正?；虼嬷虏』?，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有正常功

40、能的蛋白質(zhì)。2. 治療基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)： 非病毒導(dǎo)入和病毒導(dǎo)入3. 靶細(xì)胞的選擇：一般為體細(xì)胞，病變細(xì)胞或者正常免疫細(xì)胞。禁用生殖細(xì)胞。成功的有造血干細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞，肝細(xì)胞，肌細(xì)胞。策略有基因矯正，基因置換，基因增補(bǔ)，基因沉默基因治療的策略(一)基因矯正 糾正致病基因中的異常堿基，而正常部分予以保留。(二)基因置換 指用正常基因通過同源重組技術(shù)，原位替換致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA 完全恢復(fù)正常狀態(tài)。(三)基因增補(bǔ) 把正?；?qū)塍w細(xì)胞，通過基因的非定點(diǎn)整合使其表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增強(qiáng)，但致病基因本身并未除去(四)基因失活 將特定的（、)和核酶導(dǎo)入細(xì)胞，在轉(zhuǎn)

41、錄和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)，而實(shí)現(xiàn)治療的目的。(五)“自殺基因” 在某些病毒或細(xì)菌中的某基因可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細(xì)胞毒或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞本身殺死，此種基因稱為“自殺基因”。(六)免疫基因治療 免疫基因治療是把產(chǎn)生抗病毒或免疫力的對(duì)應(yīng)與抗原決定族基因?qū)霗C(jī)體細(xì)胞，以達(dá)到治療目的。如(cytokine)和表達(dá)等。(七)耐藥基因治療 耐藥基因治療是在腫瘤治療時(shí)，為提高機(jī)體耐受的能力，把產(chǎn)生抗藥物的基因?qū)肴梭w細(xì)胞，以使機(jī)體耐受更大的化療。如向骨髓干細(xì)胞導(dǎo)入多藥中的mdr-1。同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)2004年分子生物學(xué)（博士）一、名詞解釋 2.5分×20個(gè)，中英文各10

42、假基因，包裝細(xì)胞，等包裝細(xì)胞（pakaging cell）：包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env所編碼的蛋白，為載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時(shí)，該包裝細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA，一句話，包裝細(xì)胞本身不能產(chǎn)生任何形式的病毒顆粒。二、簡(jiǎn)答題（10分題）1.如何得到IL-2的基因工程產(chǎn)物2.癌基因在信號(hào)傳導(dǎo)中的分類1.表達(dá)生長(zhǎng)因子樣物質(zhì)：某些癌基因可以編碼生長(zhǎng)因子樣的活性物質(zhì)，例如，sis癌基因的表達(dá)產(chǎn)物與PDGF鏈高度同源，int-2癌基因蛋白與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)相似。此類癌基因激活可使生長(zhǎng)因子樣物質(zhì)生成增多，以自

43、分泌或旁分泌方式刺激細(xì)胞增殖。在人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤和纖維肉瘤中均可見sis基因異常表達(dá)。2.表達(dá)生長(zhǎng)因子受體類蛋白 某些癌基因可以表達(dá)生長(zhǎng)因子受體的類似物，通過模擬生長(zhǎng)因子的功能受體起到促增殖的作用。例如，erb-B癌基因編碼的變異型EGF受體，缺乏與配體結(jié)合的膜外區(qū)，但在沒有EGF存在的條件下，就可持續(xù)激活下游的增殖信號(hào)。在人乳腺癌、肺癌、胰腺癌和卵巢腫瘤中已發(fā)現(xiàn)EGF受體的過度表達(dá)；在卵巢腫瘤亦可見PDGF受體高表達(dá)，且這些受體的表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。 3.表達(dá)蛋白激酶類 某些癌基因可通過編碼非受體TPK或絲/蘇氨酸激酶類影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。例如，src癌基因產(chǎn)物具有較高的TPK活

44、性，在某些腫瘤中其表達(dá)增加，可催化下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的酪氨酸磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。此外，還使糖酵解酶磷酸化，糖酵解酶活性增加，糖酵解增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞的代謝特點(diǎn)之一。mos、raf癌基因編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶類產(chǎn)物，其可促進(jìn)MAPK磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)核內(nèi)癌基因表達(dá)。 4.表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子類 ras癌基因編碼的21kD小分子G蛋白R(shí)as，可在Sos催化下通過與GTP結(jié)合而激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。在30%的人腫瘤組織已發(fā)現(xiàn)有不同性質(zhì)的ras基因突變，其中突變率較高的是甘氨酸12、甘氨酸13或谷氨酰胺61為其他氨基酸殘基所取代。變異的Ras與GDP解離速率增加或GTP酶活性降低，均可導(dǎo)致Ras持續(xù)活化，促

45、增殖信號(hào)增強(qiáng)而發(fā)生腫瘤。例如，人膀胱癌細(xì)胞ras基因編碼序列第35位核苷酸由正常G突變?yōu)镃，相應(yīng)的Ras蛋白甘氨酸12突變?yōu)槔i氨酸，使其處于持續(xù)激活狀態(tài)。 5.表達(dá)核內(nèi)蛋白類 某些癌基因如myc、fos、jun的表達(dá)產(chǎn)物位于核內(nèi)，能與DNA結(jié)合，具有直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子樣作用。過度表達(dá)的癌基因可引起腫瘤發(fā)生，如高表達(dá)的jun蛋白與fos蛋白與DNA上的AP-1位點(diǎn)結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。綜上所述，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展具有多方面的影響，其發(fā)生原因是多種多樣的，基因突變、細(xì)菌毒素、細(xì)胞因子、自身抗體和應(yīng)激等均可以造成細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的原發(fā)性損傷，或可引起它們的繼發(fā)性改變

46、。3.原核基因組與真核基因組的區(qū)別1、真核生物基因組指一個(gè)物種的單倍體染色體組(1n)所含有的一整套基因。還包括葉綠體、線粒體的基因組。 原核生物一般只有一個(gè)環(huán)狀的DNA分子，其上所含有的基因?yàn)橐粋€(gè)基因組。2、原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序（unique-sequences），DNA僅有少量的重復(fù)順序和基因。真核生物基因組存在大量的非編碼序列。包括：.內(nèi)含子和外顯子、.基因家族和假基因、重復(fù)DNA序列。真核生物的基因組的重復(fù)順序不但大量，而且存在復(fù)雜譜系。3、原核生物的細(xì)胞中除了主染色體以外，還含有各種質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子。質(zhì)粒常為雙鏈環(huán)狀DNA，可獨(dú)立復(fù)制，有的既可以游離于細(xì)胞

47、質(zhì)中，也可以整合到染色體上。轉(zhuǎn)座因子一般都是整合在基因組中。真核生物除了核染色體以外，還存在細(xì)胞器DNA，如線粒體和葉綠體的DNA，為雙鏈環(huán)狀，可自主復(fù)制。有的真核細(xì)胞中也存在質(zhì)粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA位于細(xì)胞的中央，稱為類核（nucleoid）。真核生物有細(xì)胞核，DNA序列壓縮為染色體存在于細(xì)胞核中。5、真核基因組都是由DNA序列組成，原核基因組還有可能由RNA組成，如RNA病毒。三、選做題（10分題）1.PCR基本原理，主要特點(diǎn)，及兩個(gè)衍生的PCR技術(shù)原理一種在體外擴(kuò)增DNA片段的重要技術(shù)。當(dāng)存在模板DNA、底物、上下游引物和耐熱的DNA聚合酶時(shí)，經(jīng)過多次“變性-復(fù)性-延伸反

48、應(yīng)”的循環(huán)過程，模板DNA可擴(kuò)增至幾百萬(wàn)倍。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；2.基因治療的策略或主要內(nèi)容，并舉例說明?；境绦?(一)治療性基因的獲得(二)基因載體的選擇(三)靶細(xì)胞的選擇(四)基因轉(zhuǎn)移方法(五)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定(六)回輸體內(nèi)利用DNA重組技術(shù)修復(fù)患者體內(nèi)有缺陷的基因，恢復(fù)細(xì)胞的正常功能，達(dá)到治療的目的。(一)基因矯正 糾正致病基因中的異常堿基，而正常部分予以保留。鐮刀狀貧血，糾正點(diǎn)突變(二)基因置換 指用正常基因通過同源重組技術(shù)，原

49、位替換致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA 完全恢復(fù)正常狀態(tài)。目前還不夠理想。(三)基因增補(bǔ) 把正?；?qū)塍w細(xì)胞，通過基因的非定點(diǎn)整合使其表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增強(qiáng)，但致病基因本身并未除去。免疫缺陷病?？贵w，細(xì)胞因子的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，激活免疫應(yīng)答，提高機(jī)體免疫力。(四)基因失活 將特定的（、)和核酶導(dǎo)入細(xì)胞，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)，而實(shí)現(xiàn)治療的目的。抗腫瘤。(五)“自殺基因” 在某些病毒或細(xì)菌中的某基因可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細(xì)胞毒或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞本身殺死，此種基因稱為“自殺基因”。Fas/Fas/L(六)免疫基因治療 免疫基因治療是

50、把產(chǎn)生抗病毒或免疫力的對(duì)應(yīng)與抗原決定族基因?qū)霗C(jī)體細(xì)胞，以達(dá)到治療目的。如(cytokine)和表達(dá)等。(七)耐藥基因治療 耐藥基因治療是在腫瘤治療時(shí)，為提高機(jī)體耐受的能力，把產(chǎn)生抗藥物的基因?qū)肴梭w細(xì)胞，以使機(jī)體耐受更大的化療。如向骨髓干細(xì)胞導(dǎo)入多藥中的mdr-1。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定條件下接受刺激信號(hào)并受基因調(diào)控的一種自主性、程序性死亡過程。可以發(fā)生在生理和病理?xiàng)l件下。關(guān)于細(xì)胞凋亡的機(jī)制，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要有以下幾條通路：死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，Anoiki介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。另外，這幾條通路后期的共同途徑是胱天

51、蛋白酶家族激活。1  凋亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途經(jīng) (外部途徑)1.1 受體Fas為代表介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 該途徑由死亡受體Fas為代表介導(dǎo)啟動(dòng)，死亡信號(hào)誘導(dǎo)復(fù)合體（deathinducing signal complex，DISC）的形成是級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟1.2 腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis facter receptor ，TNFR）為代表介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 。該途徑由死亡受體TNFR為代表介導(dǎo)啟動(dòng)。腫瘤壞死因子受體(TNFRs) 是具有代表性的最大的死亡受體家族，胞內(nèi)區(qū)都具有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)所必需的一段高度同源性的氨基酸序列，即DD。TNF主要是由感染而活化的

52、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，通過其細(xì)胞表面受體TNFR和TNFR介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。下游caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體裂解。1.3  TRAIL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路  目前已發(fā)現(xiàn)了兩類TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis induced ligand，TRAIL)受體。含有死亡結(jié)構(gòu)域2. 線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在細(xì)胞凋亡過程中cyt c的釋放是線粒體外膜通透性增高的結(jié)果。JNKP38和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）的動(dòng)態(tài)平衡決定了細(xì)胞的存活與凋亡。前者主要促

53、細(xì)胞凋亡，后者主要促細(xì)胞存活。3. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑 鈣離子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中起主要作用包括雙向凝膠電泳、等電聚焦、生物質(zhì)譜分析及非凝膠技術(shù)。雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。由于雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究，蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用，細(xì)胞分化凋亡研究，致病機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究，療效監(jiān)測(cè)，新藥開發(fā)，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研制等許多方面。近年來經(jīng)過多方面改進(jìn)

54、已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價(jià)值的核心方法。等電聚焦等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。等電聚焦凝膠電泳依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點(diǎn)進(jìn)行分離，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場(chǎng)中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場(chǎng)中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其靜電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。生物質(zhì)譜生物質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)

55、研究中最重要的鑒定技術(shù)，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比（M/E）的差異來分離并確定分子量。對(duì)于經(jīng)過雙向電泳分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對(duì)這些肽段用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定與分析。目前常用的質(zhì)譜包括兩種：基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質(zhì)譜（ESI- MS）。飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI 的電離方式是 Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體，當(dāng)用激光（337nm的氮激光）照射晶體時(shí)，基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附

56、，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。它從固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測(cè)定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽質(zhì)量指紋圖譜，非?？焖伲看畏治鲋恍?5min），靈敏（達(dá)到fmol水平），可以精確測(cè)量肽段質(zhì)量，但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）ESI- MS是利用高電場(chǎng)使質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫(kù)侖力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復(fù)使最終的液滴非常細(xì)小呈噴霧狀，這時(shí)液滴表面的電場(chǎng)非常強(qiáng)大，

57、使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。ESI-MS從液相中產(chǎn)生離子，一般說來，肽段的混合物經(jīng)過液相色譜分離后，經(jīng)過偶聯(lián)的與在線連接的離子阱質(zhì)譜分析，給出肽片段的精確的氨基酸序列,但是 分析時(shí)間一般較長(zhǎng)。目前，許多實(shí)驗(yàn)室兩種質(zhì)譜方法連用，獲得有意義的蛋白質(zhì)的肽段序列，設(shè)計(jì)探針或引物來獲得有意義的基因。隨著蛋白質(zhì)組研究的深入，又有多種新型質(zhì)譜儀出現(xiàn)，主要是在上述質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)與重新組合克隆載體（Cloning Vector）：通常采用從病毒、質(zhì)?；蚋叩壬锛?xì)胞中獲取的DNA作為克隆載體，在載體上插入合適大小的外源DNA片段，并注意不能破壞載體的自我復(fù)制性質(zhì)。將重組后的

58、載體引入到宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中大量繁殖。常見的載體有質(zhì)粒，噬菌粒，酵母人工染色體。 對(duì)載體的要求：能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，而且最好要有較高的自主復(fù)制能力。 容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高越好。 容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。 容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來， 這才便于重組操作。 有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞、或攜帶著外來的核酸序列進(jìn)入宿主細(xì)胞都能容易被辨認(rèn)和分離出來。這才介于克隆操作真核載體：能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入真核細(xì)胞中復(fù)制的載體。原核表達(dá)一般周期短，但蛋白的活性不能確定。真核表達(dá)經(jīng)過糖基化，磷酸化，和目的蛋白相似性高，周期要長(zhǎng)，往往有的還有養(yǎng)細(xì)胞，主要是因?yàn)樵撕驼婧吮磉_(dá)系統(tǒng)所需的表達(dá)元件不同。比如說