菌種的選育與保藏

1、第九節(jié)第九節(jié) 工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) 在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1) 經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2) 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。一、微生物菌種保藏一、微生物菌種保藏在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面

2、、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥 由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，因此，在具體選擇同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，因此，在具體選擇保藏方法時(shí)必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使保藏方法時(shí)必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。 對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。國際重要菌種保藏

3、機(jī)構(gòu)國際重要菌種保藏機(jī)構(gòu)中國菌種保藏單位中國菌種保藏單位二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) (1)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (2)冷凍干燥或真空干燥保藏； (3) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。菌種保藏方法菌種保藏方法 暫時(shí)保藏法暫時(shí)保藏法 斜面?zhèn)鞔ㄐ泵鎮(zhèn)鞔?穿刺法穿刺法 長期保藏法長期保藏法 液體石蠟法液體石蠟法 甘油管法甘油管法 砂管保藏法砂管保藏法 砂土管保藏法砂土管保藏法 濾紙片保藏法濾紙片保藏法 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 液氮冷凍法液氮冷凍法 2.12.1 冷凍保藏冷凍保藏 冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷

4、凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。冷凍保藏種類冷凍保藏種類 一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80)三、液氮冷凍保藏技術(shù) 普通冷凍保藏技術(shù)普通冷凍保藏技術(shù)(-20)(-20)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5-20的普通冰箱(-20)中?；蛘撸瑢⒕N培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶

5、口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力12年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。二、超低溫冷凍保藏技術(shù)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60(-60一一-80)-80)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： 1離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞； 2用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞； 3加入等體積的20甘油或10二甲亞砜； 4混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70超低溫冰箱中保藏。 如果待

6、保藏菌種生長在斜面上，則可用含10甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。三、液氮冷凍保藏技術(shù)三、液氮冷凍保藏技術(shù) (一)冷凍保護(hù)劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10、二甲亞砜5。所使用的甘油般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。 (二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶

7、。 (2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 2控速冷凍(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1/m

8、in，直到溫度達(dá)-50；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)或 氣相(-156)中保存。 如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。(三)復(fù)蘇 1從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速將安瓿置于37-40水浴中，并輕輕搖動以加速解；3用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml (約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。2.22.2 凍干保藏凍干保藏 冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為

9、有效的方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運(yùn)用動物血清等。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。培養(yǎng)物的凍干過程培養(yǎng)物的凍干過程冷凍真空干燥操作流程冷凍真空干燥操作流程安培瓶安培瓶配制保護(hù)劑配制保護(hù)劑滅菌滅菌菌種菌種培養(yǎng)培養(yǎng)制備菌懸液制備菌懸液分裝安培瓶分裝安培瓶洗凈烘干洗凈烘干裝標(biāo)簽裝標(biāo)簽加棉塞加棉塞預(yù)凍預(yù)凍真空干燥真空干燥測定水分測定水分熔封管口熔封管口檢查真空度檢查真空度包藏包藏( (三三) )凍干菌種的保藏與再生凍干菌種的保藏與再生1保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5下保藏。較低

10、的保藏溫度(-20-70)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿。(3)在安瓿中加入0.51ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。2.32.3傳代保藏傳代保藏將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法。可用于實(shí)驗(yàn)

11、室中若干菌種的保藏。此法最為簡單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。2.3 傳代培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)原理：保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于 厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C冰箱中存放，定期 進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放。 可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體 石蠟來進(jìn)一步延長保存期。操作方法 1、斜面保藏法 將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存24個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。 此法優(yōu)點(diǎn)

12、是操作簡單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。2、液體石蠟保藏法 將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。 將試管直立，置低溫或室溫下保存。 此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法 按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后用膠塞封嚴(yán)，置4冰箱存放。礦物油中浸沒保藏礦物油中浸沒保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有效?？捎糜诮z狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。浸沒保藏的操作

13、要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)170下滅菌1-2h的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)。因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測，一般保藏株23年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。2.4 載體法實(shí)驗(yàn)原理：使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。 常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。操作方法（砂土管保藏法） （1）河砂處理 取河砂若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去

14、鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。（）土壤處理 取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。 (3)砂土混合 處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10 x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2-3次)，最后烘干。2.42.4 基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞

15、生長非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長速度會加快。當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。不同菌種保藏方法比較不同菌種保藏方法比較2.5 2.5 微生物活力和穩(wěn)定性測定微生物活力和穩(wěn)定性測定 所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時(shí)定期檢測菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)際保藏過程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說，建議保藏菌

16、種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))應(yīng)在保藏后加以檢測和確定。 加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測，可以用來預(yù)測嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。 成功的菌種長期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括：在保藏6個(gè)月、1年或更長時(shí)間后存活百分率(或存活單位)、細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性，以及實(shí)驗(yàn)室中、中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。三、三、 菌種的衰退與復(fù)壯菌種的衰退與復(fù)壯 在生物進(jìn)化的歷史長河中，遺傳性的變異是絕對的，而它的穩(wěn)定性反而是相對的；退化性的變異是大量的

17、，而進(jìn)化性的變異卻是個(gè)別的。在自然情況下，個(gè)別的適應(yīng)性變異通過自然選擇就可保存和發(fā)展，最后成為進(jìn)化的方向；在人為條件下，人們也可以通過人工選擇法去有意識地篩選出個(gè)別的正變體用于生產(chǎn)實(shí)踐中。相反，如不自覺、認(rèn)真地去進(jìn)行人工選擇，大量的自發(fā)突變菌株就會趁機(jī)泛濫，最后導(dǎo)致菌種的衰退（degeneration）。 在長期接觸菌種的實(shí)際工作人員中，都有這樣的體會，即如果對菌種工作長期放任自流，不搞純化、復(fù)壯（rejuve-nation）和育種，則菌種就會對你進(jìn)行“懲罰”，反映到生產(chǎn)上就會出現(xiàn)持續(xù)的低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這說明菌種的生產(chǎn)性狀也是不進(jìn)則退的。菌種衰退的表現(xiàn)對產(chǎn)量性狀來說，菌種的負(fù)變就是衰退。其他原有

18、的典型性狀變得不典型時(shí)，也是衰退。最易覺察到的是菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變。生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力的下降?？共涣辑h(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫等）能力的減弱等。 菌種衰退的實(shí)質(zhì)菌種的衰退是發(fā)生在細(xì)胞群體中的一個(gè)由量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時(shí)，在一個(gè)大群體中僅個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)變，這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取有效措施，而一味移種傳代，則群體中這種負(fù)變個(gè)體的比例逐步增大，最后讓它們占了優(yōu)勢，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的衰退。所以，在開始時(shí)所謂“純”的菌株，實(shí)際上其中已包含著一定程度的不純因素；同樣，到了后來，整個(gè)菌種雖已“衰退”了，但也是不純的，即其中還有少數(shù)尚未衰退的個(gè)體

19、存在著。復(fù)壯的概念狹義的復(fù)壯僅是一種消極的措施，它指的是在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定生產(chǎn)性能等方法，從衰退的群體中找出少數(shù)尚未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的一種措施；而廣義的復(fù)壯則應(yīng)是一項(xiàng)積極的措施，即在菌種的生產(chǎn)性能尚未衰退前就經(jīng)常有意識地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以，這實(shí)際上是一種利用自發(fā)突變（正變）不斷從生產(chǎn)中進(jìn)行選種的工作。 二、菌種的衰退與復(fù)壯二、菌種的衰退與復(fù)壯1）從衰退的菌種群體中把少數(shù)個(gè)體再找出來，）從衰退的菌種群體中把少數(shù)個(gè)體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。重新獲得具有原有典型性狀的菌種。2）有意識

20、地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變的特性，在）有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種日常的菌種 維護(hù)工作中不斷篩選維護(hù)工作中不斷篩選“正變正變”個(gè)體。個(gè)體。大量群體中的自發(fā)突變菌種的復(fù)壯：a）純種分離；）純種分離；b）通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯；）通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯；菌種衰退的特點(diǎn)：實(shí)踐中關(guān)于防止菌種衰退和進(jìn)行復(fù)壯的經(jīng)驗(yàn) （一）衰退的防止 1控制傳代次數(shù) 2創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件。在實(shí)踐中，有人發(fā)現(xiàn)如創(chuàng)造一個(gè)適合原種的生長條件，就可在一定程度上防止菌種衰退。 如改變培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)溫度等。3利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代 。用滅過菌的棉團(tuán)進(jìn)行孢子接種，不同孢子的接種嘗試。4采用有效的菌種保藏方法

21、 ，有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種生產(chǎn)性狀的衰退 。（二）菌種的復(fù)壯 1純種分離 。通過純種分離，可把退化菌種的細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。 方法2通過宿主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯 。對于寄生性微生物的退化菌株，可通過接種至相應(yīng)的昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)的措施來提高它們的致病性。 3淘汰已衰退的個(gè)體 ，如低溫抗性篩選。工業(yè)發(fā)酵染菌的防治工業(yè)發(fā)酵染菌的防治第一節(jié)第一節(jié) 工業(yè)發(fā)酵染菌的危害工業(yè)發(fā)酵染菌的危害純種培養(yǎng)要求必須防止雜菌污染純種培養(yǎng)要求必須防止雜菌污染為防止染菌，采取了一系列措施：為防止染菌，采取了一系列措施： 密閉式發(fā)酵

22、罐、無菌空氣、無菌室、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌、無菌操作；密閉式發(fā)酵罐、無菌空氣、無菌室、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌、無菌操作；染菌無法徹底避免；據(jù)報(bào)道染菌無法徹底避免；據(jù)報(bào)道國外抗生素發(fā)酵染菌率為國外抗生素發(fā)酵染菌率為25%，國內(nèi)抗生素發(fā)酵、青霉素發(fā)酵的染，國內(nèi)抗生素發(fā)酵、青霉素發(fā)酵的染菌率為菌率為2，鏈霉素、紅霉素和四環(huán)素發(fā)酵染菌率為，鏈霉素、紅霉素和四環(huán)素發(fā)酵染菌率為5%，谷氨酸噬菌體，谷氨酸噬菌體感染率為感染率為12染菌影響產(chǎn)率、質(zhì)量、三廢治理都有很大的影響。染菌影響產(chǎn)率、質(zhì)量、三廢治理都有很大的影響。一、 染菌對各種發(fā)酵的影響：染菌對各種發(fā)酵的影響： 青霉素：產(chǎn)青霉素酶的雜菌青霉素：產(chǎn)青霉素酶的雜菌疫

23、苗：全部廢棄疫苗：全部廢棄檸檬酸：主要防止前期染菌檸檬酸：主要防止前期染菌谷氨酸：噬菌體危害大谷氨酸：噬菌體危害大肌苷、肌苷酸：易染菌肌苷、肌苷酸：易染菌二、染雜菌種類對發(fā)酵的影響二、染雜菌種類對發(fā)酵的影響 青霉素發(fā)酵污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌危害大，鏈霉素青霉素發(fā)酵污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌危害大，鏈霉素發(fā)酵污染細(xì)短桿菌和假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌危害大，發(fā)酵污染細(xì)短桿菌和假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌危害大，四環(huán)素怕污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌四環(huán)素怕污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌三、不同染菌時(shí)期對發(fā)酵的影響：三、不同染菌時(shí)期對發(fā)酵的影響：（1）種子培養(yǎng)期染菌：易染菌

24、、應(yīng)滅菌后除去，并對種子罐、管道進(jìn)）種子培養(yǎng)期染菌：易染菌、應(yīng)滅菌后除去，并對種子罐、管道進(jìn)行檢查和徹底滅菌。行檢查和徹底滅菌。（2）發(fā)酵前期染菌：易染菌、應(yīng)特別防止，可重新滅菌，補(bǔ)充營養(yǎng)，）發(fā)酵前期染菌：易染菌、應(yīng)特別防止，可重新滅菌，補(bǔ)充營養(yǎng)，重新接種發(fā)酵。重新接種發(fā)酵。（3）發(fā)酵中期染菌：）發(fā)酵中期染菌：發(fā)酵中期染菌，挽救處理困難，危害性大；發(fā)酵中期染菌，挽救處理困難，危害性大；抗生素發(fā)酵：抗生素發(fā)酵： 將另一罐發(fā)酵正常、單位高的發(fā)酵液的一部分輸入染菌罐中，以抑將另一罐發(fā)酵正常、單位高的發(fā)酵液的一部分輸入染菌罐中，以抑制雜菌繁殖，同時(shí)采取低通風(fēng)，低流加糖量等措施制雜菌繁殖，同時(shí)采取低通風(fēng)

25、，低流加糖量等措施檸檬酸發(fā)酵：檸檬酸發(fā)酵： 污染細(xì)菌：加大通風(fēng)量，加速產(chǎn)酸，降低污染細(xì)菌：加大通風(fēng)量，加速產(chǎn)酸，降低pH，抑制細(xì)菌生長；，抑制細(xì)菌生長； 污染酵母污染酵母 ：加：加0.025-0.035g/L硫酸銅；硫酸銅； 污染黃曲霉；加入另一罐將近成熟的醪液，使污染黃曲霉；加入另一罐將近成熟的醪液，使pH下降，黃曲霉下降，黃曲霉自溶自溶 污染青霉：青霉能在低污染青霉：青霉能在低pH環(huán)境下生長，可考慮提前放罐。環(huán)境下生長，可考慮提前放罐。（4）發(fā)酵后期染菌）發(fā)酵后期染菌 可考慮提前放罐。可考慮提前放罐。 四、染菌程度對發(fā)酵的影響四、染菌程度對發(fā)酵的影響 染菌程度越大，即進(jìn)入發(fā)酵罐的雜菌數(shù)目越

26、多，對發(fā)染菌程度越大，即進(jìn)入發(fā)酵罐的雜菌數(shù)目越多，對發(fā)酵的危害越大。酵的危害越大。染少量雜菌，有時(shí)可以容忍；染少量雜菌，有時(shí)可以容忍；前期和中期染菌，應(yīng)結(jié)合染菌程度綜合考慮。前期和中期染菌，應(yīng)結(jié)合染菌程度綜合考慮。 五、染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響五、染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響 菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘、發(fā)臭，過濾困難菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘、發(fā)臭，過濾困難一、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異常現(xiàn)象一、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象 1、種子培養(yǎng)異常、種子培養(yǎng)異常（1）菌體生長緩慢：原料質(zhì)量、菌體老化、供氧不足、溫度、酸堿）菌體生長緩慢：原料質(zhì)量、菌體老化、供氧不足、溫度、酸堿度，種子冷藏時(shí)間長或接種量過低。度，種

27、子冷藏時(shí)間長或接種量過低。（2）菌絲結(jié)團(tuán)：菌絲團(tuán)中央結(jié)實(shí)，內(nèi)部菌絲的營養(yǎng)吸收和呼吸受到）菌絲結(jié)團(tuán)：菌絲團(tuán)中央結(jié)實(shí)，內(nèi)部菌絲的營養(yǎng)吸收和呼吸受到影響，不能正常生長。原因多而且復(fù)雜。影響，不能正常生長。原因多而且復(fù)雜。（3）代謝不正常：接種物質(zhì)量和培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境查，接種量）代謝不正常：接種物質(zhì)量和培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境查，接種量小、雜菌污染等有關(guān)小、雜菌污染等有關(guān)第二節(jié) 染菌的檢查、分析和防治2、發(fā)酵異常、發(fā)酵異常（1）菌體生長差：種子質(zhì)量的影響；導(dǎo)致代謝緩慢。）菌體生長差：種子質(zhì)量的影響；導(dǎo)致代謝緩慢。（2）pH不正常：培養(yǎng)基質(zhì)量、滅菌效果、補(bǔ)糖等影響；不正常：培養(yǎng)基質(zhì)量、滅菌效果、補(bǔ)糖等影

28、響；是所有代謝反應(yīng)的綜合反映。是所有代謝反應(yīng)的綜合反映。（3）溶解氧異常）溶解氧異常 染菌：染好氧菌，染厭氧菌染菌：染好氧菌，染厭氧菌（4）泡沫過多）泡沫過多 泡沫的消長不符合規(guī)律；培養(yǎng)基滅菌時(shí)溫度過高或泡沫的消長不符合規(guī)律；培養(yǎng)基滅菌時(shí)溫度過高或時(shí)間過長，葡萄糖變成氨基糖會引起泡沫。時(shí)間過長，葡萄糖變成氨基糖會引起泡沫。（5）菌體濃度過高或過低）菌體濃度過高或過低 罐溫長時(shí)間偏高；溶氧不足；營養(yǎng)條件差；種子質(zhì)罐溫長時(shí)間偏高；溶氧不足；營養(yǎng)條件差；種子質(zhì)量差；菌體自溶。量差；菌體自溶。二、染菌的檢查與判斷二、染菌的檢查與判斷1、染菌的檢查、染菌的檢查（1）顯微鏡檢查法（最簡單、最直接、最經(jīng)常）

29、顯微鏡檢查法（最簡單、最直接、最經(jīng)常）（2）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法；）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法； 平板制好后，應(yīng)先保溫平板制好后，應(yīng)先保溫24小時(shí)，確定無菌小時(shí)，確定無菌（3）肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅變色）肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅變色pH6.8-8.4）2、以上、以上3種檢查法的不足種檢查法的不足 以上以上3種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯定未被染菌；定未被染菌； 原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大的染菌情況（大的染菌情況（1個(gè)個(gè)/ml）3、發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象來判斷染菌、發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象來判斷染菌（1）溶解氧水平異常顯示染菌（

30、谷氨酸）溶解氧水平異常顯示染菌（谷氨酸）（2）排氣中）排氣中CO2異常顯示染菌異常顯示染菌CO2的含量變化是有規(guī)律的；的含量變化是有規(guī)律的；染菌引起糖的消耗變化，染好氧性雜菌，染菌引起糖的消耗變化，染好氧性雜菌，糖耗加快，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌體，含量增加；染噬菌體，糖耗減慢，糖耗減慢， CO2含量減少。含量減少。三、發(fā)酵染菌率和染菌原因分析三、發(fā)酵染菌率和染菌原因分析（一）、發(fā)酵的染菌率（一）、發(fā)酵的染菌率發(fā)酵染菌批數(shù)發(fā)酵染菌批數(shù)總投料批數(shù)總投料批數(shù)總?cè)揪士側(cè)揪?100 染菌率與發(fā)酵的菌種、培養(yǎng)基、產(chǎn)品性染菌率與發(fā)酵的菌種、培養(yǎng)基、產(chǎn)品性質(zhì)、質(zhì)、發(fā)酵周期、生產(chǎn)環(huán)境條件設(shè)備和管

31、理技術(shù)發(fā)酵周期、生產(chǎn)環(huán)境條件設(shè)備和管理技術(shù)水平等有關(guān)。水平等有關(guān)。（二）、染菌原因分析（二）、染菌原因分析（1）染菌原因分析就是總結(jié)染菌的教訓(xùn)，防范于）染菌原因分析就是總結(jié)染菌的教訓(xùn)，防范于未然。未然。（2）主要染菌原因：種子帶菌，無菌空氣帶菌，）主要染菌原因：種子帶菌，無菌空氣帶菌，設(shè)備滲漏，滅菌不徹底，操作管理不當(dāng)。設(shè)備滲漏，滅菌不徹底，操作管理不當(dāng)。（3）染菌的雜菌種類分析：）染菌的雜菌種類分析： 雜菌是耐熱的芽孢桿菌（滅菌、死角）雜菌是耐熱的芽孢桿菌（滅菌、死角） 雜菌是不耐熱菌（種子帶菌、空氣帶菌，設(shè)備雜菌是不耐熱菌（種子帶菌、空氣帶菌，設(shè)備滲漏，管理操作等）滲漏，管理操作等） 雜菌

32、是真菌雜菌是真菌（4）染菌的規(guī)模分析）染菌的規(guī)模分析 大批量發(fā)酵罐染菌：種子、空氣；大批量發(fā)酵罐染菌：種子、空氣； 前期：種子帶菌，滅菌問題；前期：種子帶菌，滅菌問題； 中后期：空氣帶菌；中后期：空氣帶菌； 部分發(fā)酵罐染菌：部分發(fā)酵罐染菌： 個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏（5）染菌的時(shí)間分析）染菌的時(shí)間分析種子培養(yǎng)階段：種子，滅菌，操作；種子培養(yǎng)階段：種子，滅菌，操作；發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作；發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作；發(fā)酵后期：空氣，補(bǔ)料，設(shè)備滲漏，泡沫發(fā)酵后期：空氣，補(bǔ)料，設(shè)備滲漏，泡沫四、染菌途徑及預(yù)防四、染菌途徑及預(yù)防1、種子帶菌的防止、種子帶菌的防止（1

33、）培養(yǎng)基及用具滅菌要徹底，應(yīng)防止假壓；）培養(yǎng)基及用具滅菌要徹底，應(yīng)防止假壓；（2）菌種在轉(zhuǎn)接過程中受污染：操作不當(dāng)，管理不嚴(yán)；（緩沖間）菌種在轉(zhuǎn)接過程中受污染：操作不當(dāng)，管理不嚴(yán)；（緩沖間）（3）菌種在培養(yǎng)或保存過程中受污染）菌種在培養(yǎng)或保存過程中受污染（試管塞，查看的時(shí)候要注意）（試管塞，查看的時(shí)候要注意）2、無菌空氣帶菌及其防止：、無菌空氣帶菌及其防止： 流程設(shè)計(jì)，介質(zhì)滅菌流程設(shè)計(jì)，介質(zhì)滅菌3、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治（1）原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或混合不均勻，）原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或混合不均勻，易結(jié)塊，團(tuán)塊中包埋的活菌不易

34、殺滅；可升溫前攪拌和易結(jié)塊，團(tuán)塊中包埋的活菌不易殺滅；可升溫前攪拌和加淀粉酶。加淀粉酶。（2）實(shí)罐滅菌時(shí)未充分排除罐內(nèi)空氣：造成假壓，升）實(shí)罐滅菌時(shí)未充分排除罐內(nèi)空氣：造成假壓，升溫時(shí)，應(yīng)打開排氣等閥門放氣。溫時(shí)，應(yīng)打開排氣等閥門放氣。（3）連續(xù)滅菌時(shí)，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未達(dá)到滅）連續(xù)滅菌時(shí)，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未達(dá)到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底。菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底。（4）設(shè)備和管道存在）設(shè)備和管道存在“死角死角” 死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)定應(yīng)該到達(dá)的局部滅菌部位，從而不能達(dá)到徹底滅菌的定應(yīng)該到達(dá)的局部滅菌部位，從而不能達(dá)到徹底滅菌的要求。要求。常見的設(shè)備、管道常見的設(shè)備、管道“死角死角” 發(fā)酵罐的發(fā)酵罐的“死角死角”：不銹鋼襯里破裂造成死角，發(fā)酵罐：不銹鋼襯里破裂造成死角，發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢罐底膿皰狀積垢。管道安裝不當(dāng)形成的死角4、設(shè)備滲漏引起的染菌及其防止、設(shè)備滲漏引起的染菌及其防止 （1）發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門長期使用，由于腐蝕