專題3植物的組織培養(yǎng)技術(shù)

1、菊花的組織培養(yǎng)菊花的組織培養(yǎng)外植體外植體細(xì)胞排列疏松而無細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞狀態(tài)的薄壁細(xì)胞原理：植物細(xì)胞有全能性原理：植物細(xì)胞有全能性微生物培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)基以有機(jī)以有機(jī)營養(yǎng)為主。營養(yǎng)為主。MS培養(yǎng)培養(yǎng)基基則需提供大量無機(jī)則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)（無機(jī)鹽），同營養(yǎng)（無機(jī)鹽），同時還加入植物激素時還加入植物激素提供碳源，同時能夠維持細(xì)胞的滲透壓生根、生芽制備制備MS固固體培養(yǎng)基體培養(yǎng)基外植體消毒外植體消毒接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)栽培栽培實驗具體操作過程實驗具體操作過程移栽移栽實驗具體操作過程實驗具體操作過程（一）制備（一）制備MS固體

2、培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基包括20多種多種營養(yǎng)成分，實驗營養(yǎng)成分，實驗室一般使用室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備。制備。1 1、配置各種母液、配置各種母液無機(jī)物中大量元素濃縮無機(jī)物中大量元素濃縮1010倍，微量元素濃倍，微量元素濃縮縮100100倍，常溫保存倍，常溫保存激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一般可按一般可按1mg/ml1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量的濃縮倍數(shù)，計算用量實驗具體操

3、作過程實驗具體操作過程2 2、配置培養(yǎng)基、配置培養(yǎng)基定容定容調(diào)調(diào)PHPH培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝 實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程3 3、滅菌、滅菌 分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓高壓蒸汽滅菌蒸汽滅菌。注意：注意：溫度為溫度為121時，維持時，維持15-20分鐘。若滅菌時分鐘。若滅菌時間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。某些生長調(diào)節(jié)劑如赤霉素等以及某些維生素某些生長調(diào)節(jié)劑如赤霉素等以及某些維生素遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，

4、而需要進(jìn)行而需要進(jìn)行過濾滅菌過濾滅菌。 實驗具體操作過程實驗具體操作過程1 1、選材：、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝（二）外植體消毒（二）外植體消毒考慮的因素考慮的因素 說說 明明外植體的年齡外植體的年齡選擇選擇幼嫩的組織或器官幼嫩的組織或器官作為外植體作為外植體外植體的大小外植體的大小選擇選擇大小適中大小適中的作為外植體的作為外植體外植體所在部位外植體所在部位 選擇選擇芽尖、根尖或幼嫩的莖芽尖、根尖或幼嫩的莖作為外植體作為外植體外植體外觀形態(tài)外植體外觀形態(tài) 選擇選擇表面相對光滑易消毒表面相對光滑易消毒的作為外植體的作為外植體2 2、表面消毒、表面消毒流水沖洗流水

5、沖洗菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min20min左右左右 酒精處理酒精處理無菌水沖洗無菌水沖洗用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為為7070的酒精中搖動的酒精中搖動2 23 3次，持續(xù)次，持續(xù)6 67s7s，立即將外，立即將外植體取出，在無菌水中清洗植體取出，在無菌水中清洗 氯化汞（升汞）氯化汞（升汞）無菌水沖洗無菌水沖洗取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為量

6、分?jǐn)?shù)為0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在無，取出后在無菌水中至少清洗菌水中至少清洗3 3次，漂凈次，漂凈消毒液消毒液實驗具體操作過程實驗具體操作過程流水沖洗流水沖洗實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程（三）接種（三）接種1 1、接種室消毒、接種室消毒 污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和孢子，污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用接種室消毒是至關(guān)重要的。用7070的酒精的酒精噴噴霧使空氣消毒，酒精擦洗工作臺并用紫外線霧使空氣消毒，酒精擦洗工作臺并用紫外線照射照射2020分鐘。分鐘。2 2、無菌操作要求、無菌操作

7、要求 操作要在操作要在酒精燈火焰旁酒精燈火焰旁完成，每次使完成，每次使用器械后，都需要用用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌火焰灼燒滅菌，接種，接種后立即蓋好瓶蓋。后立即蓋好瓶蓋。實驗具體操作過程實驗具體操作過程 插入時應(yīng)注意方向，插入時應(yīng)注意方向，不要倒插不要倒插，莖段、莖，莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分。尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分。3 3、材料的切取和接種、材料的切取和接種實驗具體操作過程實驗具體操作過程進(jìn)行外植體的接種進(jìn)行外植體的接種 接種前用體積分?jǐn)?shù)為接種前用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精將工的酒精將工作臺擦拭一遍，打開紫外燈照射作臺擦拭一遍，打開紫外燈照射20分鐘。分鐘。工作臺

8、消毒后，首先點燃酒精燈。工作臺消毒后，首先點燃酒精燈。酒精搖動酒精搖動傾倒酒精傾倒酒精無菌水沖洗無菌水沖洗升汞消毒升汞消毒傾倒升汞傾倒升汞無菌水沖洗無菌水沖洗特別提醒：特別提醒：接種過程必須始終在酒精燈旁進(jìn)接種過程必須始終在酒精燈旁進(jìn)行，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅行，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動。菌，操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動。特別提醒：特別提醒：每瓶內(nèi)接種材料不宜過多（建議每瓶內(nèi)接種材料不宜過多（建議4-5個），彼此之間留出一定空間，從而避個），彼此之間留出一定空間，從而避免互相污染。免互相污染。思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對

9、照實思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實驗嗎？驗嗎？ 每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培設(shè)置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。染。實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程（四）培養(yǎng)（四）培養(yǎng)無菌箱中培養(yǎng)，定期消毒，保持適宜的溫度，無菌箱中培養(yǎng)，定期消毒，保持適宜的溫度，光照光照接種后的錐形瓶放在培接種后的錐形瓶放在培 養(yǎng)箱

10、或培養(yǎng)室中培養(yǎng)。養(yǎng)箱或培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：18-22， 每日光照每日光照12小時小時。實驗結(jié)果實驗結(jié)果5-7天，外植體膨脹、生長，顏色變淺，天，外植體膨脹、生長，顏色變淺，若出現(xiàn)染菌，及時轉(zhuǎn)瓶。若出現(xiàn)染菌，及時轉(zhuǎn)瓶。實驗結(jié)果實驗結(jié)果2-3周，愈傷組織開始形成。周，愈傷組織開始形成。染菌染菌5-75-7天后天后染菌染菌1-21-2周后周后實驗結(jié)果實驗結(jié)果3-5周之后，誘導(dǎo)出的新葉片和芽。周之后，誘導(dǎo)出的新葉片和芽。實驗具體操作過程實驗具體操作過程（五）移栽（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日瓶的封

11、口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日1 1、打開封口膜、打開封口膜2 2、清洗轉(zhuǎn)移、清洗轉(zhuǎn)移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間生活一段時間實驗具體操作過程實驗具體操作過程珍珠巖：珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強(qiáng)、透性固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強(qiáng)、透性 好，適合栽培。好，適合栽培。蛭石蛭石是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會膨是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。其晶體結(jié)構(gòu)為單斜晶系，從外形

12、上它看上去像云母。其晶體結(jié)構(gòu)為單斜晶系，從外形上它看上去像云母。蛭石是一定的花崗巖水合時產(chǎn)生的。它一般與石棉同蛭石是一定的花崗巖水合時產(chǎn)生的。它一般與石棉同時產(chǎn)生。由于蛭石有離子交換的能力，它對土壤的營時產(chǎn)生。由于蛭石有離子交換的能力，它對土壤的營養(yǎng)有極大的作用。養(yǎng)有極大的作用。 蛭石的化學(xué)式為（蛭石的化學(xué)式為（Mg，Ca）0.7（Mg，F(xiàn)e，Al）6.0（Al，Si）8.0（OH4.8H2O）。）。實驗具體操作過程實驗具體操作過程（六）栽培（六）栽培幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花況，適時澆水、施肥，直至開花幼苗的移栽和

13、栽培幼苗的移栽和栽培無菌條件如何保證？無菌條件如何保證？需要保證無菌需要保證無菌條件步驟條件步驟關(guān)鍵操作關(guān)鍵操作培養(yǎng)基及實驗培養(yǎng)基及實驗器材的滅菌器材的滅菌高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌滅菌干燥后直接拿到無菌操作臺中滅菌干燥后直接拿到無菌操作臺中外植體的消毒外植體的消毒酒精、酒精、升升汞汞、無菌水徹底清洗無菌水徹底清洗接種的接種的無菌操作無菌操作始終在酒精燈旁進(jìn)行始終在酒精燈旁進(jìn)行每次使用器械后，都需要浸泡在每次使用器械后，都需要浸泡在95%的酒精中的酒精中每次使用器械前，都需要用火焰灼燒滅菌每次使用器械前，都需要用火焰灼燒滅菌操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動每瓶

14、內(nèi)接種材料不宜過多每瓶內(nèi)接種材料不宜過多培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱中的培中的培養(yǎng)養(yǎng)觀察時不打開封口膜觀察時不打開封口膜手持錐形瓶錐形瓶觀察時正握手持錐形瓶錐形瓶觀察時正握發(fā)現(xiàn)染菌外植體，及時轉(zhuǎn)瓶，打開封口膜前先發(fā)現(xiàn)染菌外植體，及時轉(zhuǎn)瓶，打開封口膜前先高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌三、課題延伸三、課題延伸1 1、一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物，也、一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物，也容易進(jìn)行組織培養(yǎng)容易進(jìn)行組織培養(yǎng)2 2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季總結(jié)植物組織培養(yǎng)過程總結(jié)植物組織培養(yǎng)過程: :離離體體組組織織或或細(xì)細(xì)胞胞植植物物體體脫分化脫分化細(xì)胞分細(xì)胞分裂素裂素生長素生長

15、素愈愈傷傷組組織織芽芽根根細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂素素 生長素生長素細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂素素 生長素生長素再分化再分化課題課題2 2 月季的花藥培養(yǎng)月季的花藥培養(yǎng)知識回顧知識回顧 單倍體育種的過程？單倍體育種的過程？花藥離體培養(yǎng)（花藥離體培養(yǎng)（N）單倍體植株（單倍體植株（N）秋水仙素處理，秋水仙素處理，使染色體翻倍使染色體翻倍植株（植株（2N）特點：特點：1 明顯縮短育種年限明顯縮短育種年限2 后代植株都為純合子。后代植株都為純合子。正常植株（正常植株（2N） 被子植物的花的結(jié)構(gòu)：被子植物的花的結(jié)構(gòu)：三、三、產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑形成原因：主要取決于培形成原因：主要取決于培養(yǎng)基中的激

16、素的種類及其養(yǎng)基中的激素的種類及其濃度的配比濃度的配比胚狀體胚狀體 體細(xì)胞胚體細(xì)胞胚 1、材料的選擇、材料的選擇 不同植物的誘導(dǎo)成功率不同不同植物的誘導(dǎo)成功率不同. 同一植物的不同生理狀況也對誘導(dǎo)成功率有同一植物的不同生理狀況也對誘導(dǎo)成功率有直接的影響直接的影響. （一般選月季的初花期）（一般選月季的初花期） 合適的花粉發(fā)育期合適的花粉發(fā)育期（單核居中期與靠邊期之間）（單核居中期與靠邊期之間） 2、培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)基的組成（ MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基+ +不同比例的植物生不同比例的植物生長調(diào)節(jié)激素）長調(diào)節(jié)激素）此外，植株生長條件、材料低溫預(yù)處理、接種密度等此外，植株生長條件、材料低溫預(yù)處理、接種

17、密度等四、影響花藥培養(yǎng)的主要因素四、影響花藥培養(yǎng)的主要因素實驗操作材料選取材料的消毒接種和培養(yǎng)2、通過、通過鏡檢鏡檢來確定是否處于適宜的發(fā)來確定是否處于適宜的發(fā)育期。育期。1、從花藥看：月季的初花期、從花藥看：月季的初花期 從花粉看：單核居中期與靠邊期之間從花粉看：單核居中期與靠邊期之間 從花蕾看：完全未開放的從花蕾看：完全未開放的 方法：方法：醋酸洋紅法醋酸洋紅法(將染色體染成紅色將染色體染成紅色) 焙花青焙花青-鉻礬法鉻礬法(花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色)?；ㄋ帲ㄝd玻片上）花藥（載玻片上）1%的醋酸洋紅的醋酸洋紅1滴滴用鑷用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片鏡檢

18、（花粉粒的細(xì)鏡檢（花粉粒的細(xì)胞核被染成紅色）胞核被染成紅色）花藥在花藥在卡諾氏固定液卡諾氏固定液中處理中處理20min取出，置取出，置于載玻片上于載玻片上焙花青鉻礬溶液染色焙花青鉻礬溶液染色蓋上蓋玻蓋上蓋玻片片鏡檢（花粉粒的細(xì)胞核被染成藍(lán)黑色）鏡檢（花粉粒的細(xì)胞核被染成藍(lán)黑色）花花蕾蕾（_）清洗清洗吸干水分吸干水分消毒消毒24min沖洗沖洗35次次浸泡約浸泡約30s（_）（_）（_）（_）70%70%酒精酒精無菌吸水紙無菌吸水紙無菌水無菌水無菌水無菌水1%1%氯化汞溶液氯化汞溶液1%1%次氯酸鈣溶液次氯酸鈣溶液飽和漂白粉溶液飽和漂白粉溶液1%1%氯化汞溶液氯化汞溶液說明：說明：用于培養(yǎng)的花藥，

19、實際上多數(shù)未熟，由于用于培養(yǎng)的花藥，實際上多數(shù)未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，通常處于無它的外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，通常處于無菌狀態(tài)，所以只要將整個花蕾或幼穗消毒即可。菌狀態(tài)，所以只要將整個花蕾或幼穗消毒即可。（三）接種和培養(yǎng)（三）接種和培養(yǎng) 1 1 消毒后花蕾，要在消毒后花蕾，要在 下除去萼片和花瓣，并立下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。即將花藥接種到培養(yǎng)基上。 3 通常每瓶接種花藥通常每瓶接種花藥 ，溫度控制在，溫度控制在 左左右，右， 。幼小植株形成后才。幼小植株形成后才 。 2 在剝離花藥時，要盡量在剝離花藥時，要盡量 （否則接種后，否則接種后，容易從受傷部位

20、產(chǎn)生二倍體的愈傷組織容易從受傷部位產(chǎn)生二倍體的愈傷組織），同時還要徹），同時還要徹底底 ，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成胚狀體的形成。無菌條件無菌條件不損傷花藥不損傷花藥去除花絲去除花絲7-10個個25不需要光照不需要光照需要光照需要光照2.2.關(guān)于影響花藥培養(yǎng)的因素的說法，不正確的是關(guān)于影響花藥培養(yǎng)的因素的說法，不正確的是A.A.材料的選取和消毒是花粉植株誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵材料的選取和消毒是花粉植株誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵B.B.選擇盛開的或略微開放的花作為實驗材料選擇盛開的或略微開放的花作為實驗材料C.C.選擇合適的花粉發(fā)育時期選擇合適的花粉發(fā)育時期D.D.親本植株生長條件、材料的低溫預(yù)處理、接種親本植株生長條件、材料的低溫預(yù)處理、接種密度都對實驗有影響密度都對實驗有影響如果選擇盛開的或略微開放的花作為實驗材料，花瓣有所松動，微生物可能侵入到花藥3.3.下列關(guān)于植物組織培養(yǎng)