第六章單倍體的產(chǎn)生

1、第六章單倍體的產(chǎn)生1引言單倍體的概念所謂單倍體，指的是具有配子染色體數(shù)的個體或細(xì)胞。一倍體：只含有一個染色體組的個體或細(xì)胞（n=x）,倍體不能進(jìn)行減數(shù)分裂,所以是不育的。二倍體：含有二個染色體組的個體或細(xì)胞（2n=2x,n代表配子染色體數(shù),2n代表合子染色體數(shù),x代表染色體組）。三倍體：具有三個染色體組的細(xì)胞或個體。四倍體：具有四個染色體組的細(xì)胞或個體。多倍體：細(xì)胞或個體中的染色體組數(shù)多于二個。整倍體：體細(xì)胞內(nèi)含有完整的染色體組的類型稱為整倍體。非整倍體：如果在二倍體的基礎(chǔ)上,增加或減少個別染色體,這種變異的細(xì)胞或個體叫非整倍體。1.1 單倍體在遺傳研究和植物育種中的意義（1）在單倍體細(xì)胞中染

2、色體組減半,表現(xiàn)型和基因型一致,一旦發(fā)生突變,無論是顯性還是隱性,在當(dāng)代就可表現(xiàn)出來。單倍體植株中由隱性基因控制的性狀,雖經(jīng)染色體加倍,但由于沒有顯性基因的掩蓋而容易顯現(xiàn)。因此單倍體是體細(xì)胞遺傳研究和突變育種的理想材料。在誘導(dǎo)頻率較高時(shí),單倍體能在植株上較充分地顯現(xiàn)重組的配子類型,可提供新的遺傳資源和選擇材料。（2）在品種間雜交育種程序中,通過F1代花藥培養(yǎng)得到單倍體植株后,經(jīng)染色體加倍立即成為純合體,從雜交到獲得不分離的雜種后代單株只需要2個世代,和常規(guī)育種方法相比,顯著縮短了育種年限。1.2 獲得單倍體植株的途徑單倍體的重要意義雖然早已為人所知,然而,由于在自然界單倍體出現(xiàn)的頻率極低，只有

3、0.001%0.01%，因此以前它們并未得到廣泛的利用。目前，人們誘導(dǎo)單倍體植株主要采用整體操作技術(shù)和花藥、花粉的離體培養(yǎng)技術(shù)。1.3.1 整體操作技術(shù) 雌核發(fā)育。通過阻止授粉途徑（利用預(yù)先離子輻射處理的花粉或使用不親和花粉），引起未受精卵細(xì)胞發(fā)育成單倍體植株。 胚珠雄核發(fā)育。由有雄核的卵細(xì)胞發(fā)育成單倍體植株。在這種發(fā)育途徑中，卵細(xì)胞核在受精前發(fā)生消失或失活。 通過遠(yuǎn)緣雜交消除一個親本的基因組。這種情況出現(xiàn)在屬間和種間雜交中，在受精之后的發(fā)育過程中雙親之一的基因組被選擇性消除。于是，形成的胚只具有一親本的基因組，由此發(fā)育形成的植株理所當(dāng)然屬于單倍體。 半受精。雜交過程中，卵細(xì)胞核與萌發(fā)花粉粒產(chǎn)

4、生的精核不發(fā)生融合，各自獨(dú)立地進(jìn)行分裂，產(chǎn)生嵌合的單倍體植株。 化學(xué)處理。一些化學(xué)試劑如氯霉素和對氟苯丙氨酸，可能誘導(dǎo)體細(xì)胞或組織中的染色體丟失，產(chǎn)生單倍體。用甲苯藍(lán)、順丁烯二酰肼、一氧化二氮和秋水仙素也可能產(chǎn)生類似的結(jié)果。 高低溫處理。高低溫處理，可以起到抑制配子融合，誘導(dǎo)單倍體的作用。 輻射效應(yīng)。據(jù)報(bào)道，X射線或紫外線能誘導(dǎo)染色體斷裂，導(dǎo)致親本的染色體丟失，形成單倍體植株。1.3.2 花藥、花粉的離體培養(yǎng)技術(shù)整體處理方法獲得單倍體植株的頻率低。與此相反，使用離體培養(yǎng)的方法成功獲得的單倍體植株數(shù)量驚人。通過花藥培養(yǎng)（花藥孤雄發(fā)育）或花粉培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的單倍體涉及34個科約247種植物，其中包括

5、不少有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物。茄科植物特別容易誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，然而十字花科、禾本科、毛茛科等植物通過花藥孤雄發(fā)育（此后稱為雄核發(fā)育）、單個花粉粒培養(yǎng)也能誘導(dǎo)獲得單倍體。目前，這項(xiàng)技術(shù)已成為人們獲得單倍體植株的主要途徑。2通過花藥和花粉培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體的理論解釋花藥和花粉培養(yǎng)都指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化，最終發(fā)育成完整植株。只不過后者是將花粉從花藥中游離出來，成為分散或游離態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)。從組織器官角度來說，花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)的范疇，而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。但兩者的目的都一樣，就是要誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體植株?；ㄋ帲╝nther）是植物花的

6、雄性器官，包括二倍性的藥壁和藥隔組織以及單倍性的雄性性細(xì)胞花粉粒（pollengrain）。一個花藥的每個花粉囊中都充滿了花粉粒，每個花粉粒在母體植株上的最終角色都是發(fā)育成一個雄配子體。但在花藥的離體培養(yǎng)過程中，花粉粒的命運(yùn)會脫離常軌，最終發(fā)育成一個單倍體的孢子體。為什么會這樣呢？這涉及到花粉小孢子的發(fā)育途徑。2.1 活體小孢子發(fā)育途徑一個花粉母細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)2次細(xì)胞分離（第一次減數(shù)分裂，第二次有絲分裂），形成4個子細(xì)胞，稱為四分體，四分體分散成單核花粉粒。在正常情況下，單核經(jīng)第一次有絲分裂，產(chǎn)生一個大而疏松的營養(yǎng)核和一個小而致密的生殖核，稱二核花粉粒。第二次有絲分裂僅限于生殖核，形成兩個精子，

7、它們處在花粉或花粉管中，稱為三核花粉粒。最后花粉粒進(jìn)一步膨大，花粉進(jìn)入成熟期。2.2 離體小孢子發(fā)育途徑在離體培養(yǎng)條件下，花粉是產(chǎn)生花粉植株的原始細(xì)胞，我們把花粉形成植株的途徑稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑”。目前，多數(shù)學(xué)者習(xí)慣把小孢子或花粉沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株的過程稱為“雄核發(fā)育”。離體培養(yǎng)時(shí)，小孢子在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)不同的發(fā)育模式。目前，一般根據(jù)小孢子第一次有絲分裂的情況將雄核發(fā)育分為A途徑（不均等分裂）和B途徑（均等分裂），其中A途徑又根據(jù)第二次分裂及其以后的情況細(xì)分為A-V途徑、A-G途徑、A-VG途徑（又稱E途徑）及C途徑（圖6-1）。IE藥藥fK四分過了單桜處抱了二曙林地fA'

8、;fi.制百蝕分聲方松毬合靜體鳳IE播內(nèi)址刖有塑升整燈覆甌合四惦休原匪円借*餐"G®®攢肉乳別有蛭分裂站核冊合三帝休貶吒單借怵原（T單警悴胚核融合零卅體，減并車佰怖肝圖51小抱子正常發(fā)育途徑與離體培養(yǎng)條件下胚胎發(fā)育途徑比較A第一次有絲分裂為非均等分裂，形成一個營養(yǎng)核、一個生殖核A-V.營養(yǎng)核重復(fù)分裂而生殖核敗育A-G.生殖核重復(fù)分裂而營養(yǎng)核敗育AVG.生殖核和營養(yǎng)核共同分裂C.營養(yǎng)核、生殖核分別或同時(shí)進(jìn)行核內(nèi)復(fù)制，有絲分裂后核融合分別形成二倍體、三倍體、四倍體胚B.第一次有絲分裂為均等分裂，形成兩個相似的營養(yǎng)型核，進(jìn)而重復(fù)分裂形成單倍體胚或先核融合然后重復(fù)分裂形成

9、多倍體胚D.自然條件下小抱子的第二次分裂、淀粉粒及萌發(fā)形成的花粉管2.2.1 A途徑小抱子的第一次有絲分裂按配子體方式進(jìn)行，為不均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞（或營養(yǎng)核和生殖核），這種途徑又可細(xì)分為以下幾種途徑：（1）A-V途徑多細(xì)胞花粉（或多核花粉）由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂衍生而成，生殖細(xì)胞以游離核的形式存在一個周期后退化，或分裂一至數(shù)次存在于多核花粉的一側(cè)，有的甚至到球形胚形成仍存在。因此，生殖核并不參與花粉抱子體的形成在花粉中往往可以觀祭到生殖細(xì)胞的存在。（2）A-G途徑生殖細(xì)胞進(jìn)行多次分裂形成胚狀體，營養(yǎng)細(xì)胞不分裂或者僅分裂數(shù)次形成胚柄結(jié)構(gòu)。由生殖細(xì)胞形成的細(xì)胞群其核致密，染色后著色較深，

10、容易同營養(yǎng)細(xì)胞衍生而來的細(xì)胞群區(qū)分開來。（3）A-VG途徑（又稱E途徑）花粉內(nèi)的營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞獨(dú)立分裂，形成兩類細(xì)胞群，各群的子細(xì)胞都類似其母細(xì)胞。（4）C途徑在獲得的花粉植株群體中，除單倍體外，常有相當(dāng)比例的二倍體、三倍體、四倍體、非整倍體等非單倍體植株，即出現(xiàn)小抱子培養(yǎng)過程中染色體自發(fā)加倍現(xiàn)象。1977年，Sunderland提出C途徑，即生殖細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞通過核融合后共同形成多細(xì)胞花粉，產(chǎn)生非單倍體植株。此途徑中生殖核與營養(yǎng)核共同參與了花粉植株的形成。2.2.2 B途徑小抱子第一次有絲分裂為均等分裂，形成兩個大小相近的細(xì)胞（或游離核）。以后，由這兩個細(xì)胞（或游離核）連續(xù)分裂產(chǎn)生單一類

11、細(xì)胞組成的多細(xì)胞花粉或多核花粉。2.2花粉植株形態(tài)發(fā)生方式如果不考慮小抱子核的早期分裂行為，花粉植株的形態(tài)發(fā)生有兩種途徑，即胚狀體發(fā)育途徑（直接發(fā)生途徑）和愈傷組織發(fā)生途徑（間接發(fā)生途徑）（圖62）。A7花蕾原胚原胚試管植株¥花藥培養(yǎng)離體+花薊宜接維核發(fā)背闔接雄樓發(fā)育%觸怖化單梧休愈務(wù)組織冉生單滅單倍體試管電殊試管植株痕倍休植株圖6-2花藥培養(yǎng)與花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式3花藥培養(yǎng)的一般程序3.1取材花藥在接種以前，應(yīng)預(yù)先用醋酸洋紅壓片法進(jìn)行鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期，并找出花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾或幼穗的大小、顏色等外部特征之間的對應(yīng)關(guān)系。一般而言，單核后期花藥對培養(yǎng)反應(yīng)較好。但值得注意的是

12、，這種相關(guān)性絕不是一成不變的，而會因品種和氣候的不同而異，因此，在實(shí)驗(yàn)中還必須由每個花蕾取出一個花藥，通過鏡檢確定花粉發(fā)育的準(zhǔn)確時(shí)期。3.2 預(yù)處理適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率。常用的預(yù)處理方法是低溫冷藏，具體的處理溫度和時(shí)間長度因物種而異：但低溫預(yù)處理對小麥效果不穩(wěn)定，有時(shí)還有負(fù)效果。3.3 消毒花藥適宜培養(yǎng)時(shí)，花蕾尚未開放，花藥在花被或穎片的嚴(yán)密包被之中，本身處于無菌狀態(tài)。因此，通常只要以70酒精噴灑或擦拭花器或包被著麥穗的葉鞘表面，即可達(dá)到滅菌要求。3.4 接種在無菌條件下把雄蕊上的花藥輕輕地從花絲上摘下，水平地放在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在整個操作過程中不應(yīng)使花藥受到損傷，若

13、受損傷，則應(yīng)淘汰，因?yàn)閾p傷常常會刺激花藥壁形成二倍體愈傷組織。如果所碰到的是花器很小的植物，如天門冬屬、蕓苔屬和三葉草屬植物等，可能需要借助解剖鏡夾取花藥，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分連同其中原封未動的雄蕊一起接種在培養(yǎng)基上。在有些情況下，甚至是接種整個花序以得到花粉單倍體。然而這種簡單化的方法只適用于這樣一些基因型，即其中雄核發(fā)育在只含無機(jī)鹽、維生素和糖的簡單培養(yǎng)基上即可進(jìn)行，而在這種培養(yǎng)基上孢子體組織增殖的機(jī)會很少。不過，當(dāng)必須使用生長素才能誘導(dǎo)花粉粒雄核發(fā)育的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)盡可能把孢子體組織去掉。由于花藥對離體培養(yǎng)的反應(yīng)存在“密度效應(yīng)”，因此每個容器中接種的花藥數(shù)量不宜太少，以形成一個

14、合理的群體密度。3.5 培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件培養(yǎng)方式：花藥的培養(yǎng)方式主要有3種：一是在瓊脂固化培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，二是在加入30Ficoll（水溶性聚蔗糖）的液體培養(yǎng)基表面飄浮培養(yǎng)，三是利用固體一液體雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便既能保持較高的接種密度，培養(yǎng)基又不易失水干涸。培養(yǎng)條件：主要包括溫度和光照。（1）溫度花藥對培養(yǎng)溫度的要求因物種而不同，對于大多數(shù)小麥品種來說，在培養(yǎng)的最初6d給以3032C的較高溫度，然后再轉(zhuǎn)入2830C下培養(yǎng)，花藥出愈率會有明顯提高。水稻花藥培養(yǎng)的適宜溫度從一開始就是27C。愈傷組織分化階段對溫度的要求不像誘導(dǎo)階段那樣嚴(yán)格，例如小麥在17C和30E下花粉愈傷組織分化頻率沒有顯著差

15、異，水稻花粉植株的分化也多在和誘導(dǎo)期間相同的溫度下進(jìn)行。（2）光照對光照的要求在物種間差異更為明顯。如連續(xù)光照可顯著增加煙草花粉胚的產(chǎn)量，卻強(qiáng)烈抑制曼陀羅的花粉胚胎發(fā)生。禾谷類植物在花粉愈傷組織誘導(dǎo)期間則以暗培養(yǎng)或散射光培養(yǎng)效果較好，強(qiáng)光會抑制小麥花粉愈傷組織的形成。愈傷組織的分化原則上都應(yīng)在光照下進(jìn)行，但對光照強(qiáng)度和照光時(shí)間的要求則因物種而異。例如水稻花粉愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基之初仍不宜照光培養(yǎng)，須待35d后再給以每天14h，10002000lx的光照，以免引起愈傷組織的老化壞死。對小麥花粉植株則不宜給以長日照。3.6 花粉植株的誘導(dǎo)煙草花藥接種在無激素培養(yǎng)基上1周以后，即有部分花粉粒開始

16、膨大，2周以后細(xì)胞開始不斷分裂，相繼形成球形胚、心形胚和魚雷形胚等，3周后在花藥開裂處即可見到許多淡黃色的胚狀體，見光后變綠，并逐漸長成小苗。禾本科植物的花藥在培養(yǎng)中通常不能形成胚狀體，在這類植物中，花粉植株的誘導(dǎo)往往要分兩步進(jìn)行。第一步，將花藥接種在含有2,4D(12mg/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)花粉粒形成單倍體愈傷組織。第二步，當(dāng)花粉愈傷組織形成后1015d，其直徑已長到1.52.0mm時(shí)，及時(shí)把它們轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株分化。分化培養(yǎng)基中不含2,4-D，含有NAA和KT各0.5mg/L。在分化培養(yǎng)基上，愈傷組織表面陸續(xù)分化出芽和根。在煙草中，花粉植株是經(jīng)由胚狀體產(chǎn)生的，因此幾乎都是單倍

17、體。在稻麥等植物中，由于花粉植株是經(jīng)由愈傷組織產(chǎn)生的，染色體數(shù)常有變化，其中既有單倍體，也有二倍體、三倍體以及各種非整倍體等。4花粉培養(yǎng)在花藥培養(yǎng)中，由于一個花藥內(nèi)的花粉粒在遺傳上是異質(zhì)的，因此，由一個花藥所產(chǎn)生的植株，將構(gòu)成一個異質(zhì)的群體。如果單倍體植株是經(jīng)由花粉愈傷組織的途徑產(chǎn)生的，由于從若干花粉起源的愈傷組織常常混在一起，因此由一個花藥形成的愈傷組織將會是一個嵌合體。而且，如果在花粉愈傷組織化的同時(shí)，花藥壁細(xì)胞也進(jìn)行增殖，那么最終所得到的愈傷組織就不可能具有純粹的配子體起源。解決這個問題的方法是培養(yǎng)離體小孢子或花粉粒，并誘導(dǎo)它們進(jìn)行雄核發(fā)育。與花藥培養(yǎng)相比較，花粉培養(yǎng)在某些方面具有一定的

18、優(yōu)越性。如花粉培養(yǎng)不存在花藥中的有害物質(zhì)，不影響小孢子啟動第一次分裂；排除了藥壁、藥隔、花絲的干擾，從小孢子中獲得的材料是純合的；小孢子能均勻地接觸化學(xué)和物理誘變因素，是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料；小孢子培養(yǎng)可觀察到雄核發(fā)育的全過程，是很好的遺傳和發(fā)育研究的材料體系；小孢子培養(yǎng)可以從每個花藥中獲得更多的單倍體?；ǚ叟囵B(yǎng)需將花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)。所以與花藥培養(yǎng)相比，花粉培養(yǎng)前必須進(jìn)行花粉的分離與純化。4.1 花粉分離與純化方法將小孢子從花藥里游離出來的主要方法有自然散落法、擠壓法和機(jī)械游離法。(1)自然散落法將合適的花蕾消毒后，無菌條件下取出花藥，接種在預(yù)

19、處理液或培養(yǎng)基上。一段時(shí)間后，有些花粉囊自動裂開，里面的小孢子從裂口處散落到培養(yǎng)基中，收集這些脫落下來的小孢子，用新鮮培養(yǎng)基制成一定密度后進(jìn)行培養(yǎng)。所以，此法又稱漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法。此法操作簡單，不需專門儀器，并且可以連續(xù)收集，曾被不少研究者在水稻、大麥、小麥、玉米上成功采用，但效率低，易受花藥組織影響。(2) 擠壓法擠壓法分為兩種：直接擠壓法。消毒處理過的花藥置于無菌培養(yǎng)皿或燒杯中，加入少量提取液，用注射器內(nèi)管或一端壓扁的玻璃棒輕壓花藥，將花粉擠到提取液中，經(jīng)級聯(lián)過篩，除去比小孢子大的組織碎片，然后低速離心，使小孢子沉淀，清洗幾次后，制成小孢子懸浮液用于培養(yǎng)。此法簡便易行，不需專門裝置

20、，也可對單花蕾或花藥進(jìn)行少量分離，所以直到近年仍在蕪菁、結(jié)球甘藍(lán)、大麥、小麥、玉米、水稻等作物上采用。不過，此法不適宜大規(guī)模游離小孢子的操作，并且重復(fù)性受不同操作人員用力大小、時(shí)間長短等因素影響。研磨過濾收集法。與擠壓法相似，不同之處是把消毒過的花蕾置于無菌的研缽中研磨，擠出小孢子。甘藍(lán)、大白菜、小白菜、紅菜苔的小孢子培養(yǎng)主要采用此法。(3) 機(jī)械游離法此法也分為兩種：磁攪拌法。是將花藥接種于盛有培養(yǎng)液或滲透壓穩(wěn)定劑的三角瓶中，放入一根磁棒(為提高分離速度，可另加入幾顆玻璃珠)，置磁力攪拌器上，低速旋轉(zhuǎn)至花藥透明。該法分離花粉比較徹底，但對花粉有不同程度的機(jī)械損傷，且所需時(shí)間長，所以至今用得不

21、太普遍。小型攪拌(超速旋切)法。小型攪拌器的雛形就是廚用攪拌混合器。不過，刀具、容器室、容器蓋均用不銹鋼或耐高溫的塑料制成，以便對容器進(jìn)行滅菌操作。現(xiàn)在在控時(shí)、控速方面得到了進(jìn)一步改進(jìn)，并發(fā)展出可以更換的多種轉(zhuǎn)軸型號，其基本原理是通過旋轉(zhuǎn)刀具的高速轉(zhuǎn)動帶動花蕾、穗子切段或花藥高速運(yùn)動而破碎，從而使小孢子游離出來。機(jī)械上裝有調(diào)速器和時(shí)間控制器(有的還有實(shí)際轉(zhuǎn)速顯示器)，操作方便，重復(fù)性好，可一次處理大量材料。如油菜的花序，玉米、大麥、小麥的雄穗切段等均可直接放入容器中進(jìn)行處理。此外，提取小孢子所需時(shí)間短，獲得率高，成活率也較高。目前不但在油菜上被廣泛采用，而且還逐漸被用于玉米、大麥、小麥等禾谷類

22、作物。(4) 小孢子分離和純化無論哪一種方法提取的小孢子勻漿，都需經(jīng)過去除雜質(zhì)的過篩、離心收集等步驟。特別當(dāng)采用花序或穗切段時(shí)，雜質(zhì)甚至比小孢子量還要多。不同物種甚至同一物種不同品種所用的篩子孔徑由于小孢子的大小不同而有所不同。采用級聯(lián)過篩時(shí)，第一級可以選用孔徑較大的，以便使大雜質(zhì)去除，最后一級應(yīng)選用略大于小孢子直徑的篩子。過篩后經(jīng)過離心收集小孢子群體，一般在80300g條件下進(jìn)行。不過由于各種作物小抱子的密度不同，需要經(jīng)過摸索調(diào)整后才能獲得理想的小孢子得率和成活率。一些研究中使用聚果糖(percoll)或聚蔗糖(ficoll)甚至蔗糖配成不連續(xù)梯度對得到的小抱子群體進(jìn)行純化，以獲得同步性較高

23、的群體。如Joersbo等(1990)對大麥小抱子群體用Percoll梯度純化，結(jié)果為：成活率高達(dá)70的小抱子處于020梯度界面；2030界面的小抱子存活率只有4；30以上的只有碎片和已死的小抱子。4.2 花粉培養(yǎng)方式(1) 平板培養(yǎng)(platecultivationmethod)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，進(jìn)而分化成植株。(2) 液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。由于液體培養(yǎng)容易造成培養(yǎng)物的通氣不良，影響細(xì)胞分裂和分化，可將培養(yǎng)物置于搖床上震蕩，使其處于良好的通氣狀態(tài)。(3) 雙層培養(yǎng)花粉置固體一液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。雙層培養(yǎng)基的制作方法為：在培養(yǎng)皿中鋪加一層瓊脂培

24、養(yǎng)基，待其冷卻并保持表面平整，然后在其表面加入少量液體培養(yǎng)基。(4) 看護(hù)培養(yǎng)(nursecultivationmethod)配制好花粉粒懸浮液和瓊脂固體培養(yǎng)基后，將完整的花藥或花藥的愈傷組織放在瓊脂培養(yǎng)基上，將圓片濾紙放在花藥或愈傷組織上，然后將花粉置于濾紙的上方。應(yīng)用此法培養(yǎng)番茄花粉形成了細(xì)胞無性繁殖系。(5) 微室培養(yǎng)(microchamberculturemethod)將花粉培養(yǎng)在很少的培養(yǎng)基中。具體做法是：把懸浮花粉的液體培養(yǎng)基用滴管取一滴滴在蓋玻片上，然后翻過來放在凹穴載玻片上密封。這種培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)是便于培養(yǎng)過程中進(jìn)行活體觀察，可以把一個細(xì)胞生長、分裂、分化及形成細(xì)胞團(tuán)的全過程記

25、錄下來。缺點(diǎn)是培養(yǎng)基太少，水分容易蒸發(fā)，培養(yǎng)基中的養(yǎng)分含量和pH都會發(fā)生變化，影響花粉細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育。應(yīng)用這個方法曾誘導(dǎo)油菜花粉形成多細(xì)胞團(tuán)，但未能繼續(xù)發(fā)育。（6）條件培養(yǎng)基培養(yǎng)（conditionedmediummethod）在預(yù)先培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基中或在加入失活的花藥提取物的合成培養(yǎng)基中，接入花粉進(jìn)行培養(yǎng)。前者的做法是：將發(fā)育時(shí)期合適的花藥接種在合適的培養(yǎng)基上一段時(shí)間后，去掉花藥并離心清除散落在培養(yǎng)基中的花粉，用所得上清液（即條件培養(yǎng)基）再培養(yǎng)合適的花粉。后者的做法是：首先將花藥接種在合適的培養(yǎng)基上一段時(shí)間（如1周），然后將這些花藥取出浸泡在沸水中殺死細(xì)胞，用研缽研碎，倒人離心管離心

26、，上清液即為花藥提取物。提取液過濾滅菌后，加入培養(yǎng)基中，再接種花粉進(jìn)行培養(yǎng)。由于條件培養(yǎng)基和失活的花藥提取物中含有促進(jìn)花粉發(fā)育的物質(zhì)，有利于花粉培養(yǎng)成功。5壯苗和移栽花粉植株非常嬌嫩，很難移植。需采取逐步過渡的方式，使其適應(yīng)從異養(yǎng)到自養(yǎng)。以小麥為例，王培等采用的方法是：將已長出23片葉的花粉植株轉(zhuǎn)入含有多效唑3mg/L,NAA和KT各0.5mg/L,LH（水解乳蛋白）500mg/L和蔗糖8%的MS培養(yǎng)基上，于2225C下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，然后在38C低溫弱光條件下越夏，深秋時(shí)煉苗移栽。移栽的關(guān)鍵是保持高空氣濕度（8090，12周）和低土壤濕度。6禾谷類植物花藥培養(yǎng)中白化苗的形成在禾谷類植物花粉單倍

27、體生產(chǎn)中存在的一個嚴(yán)重問題是出現(xiàn)大量白化苗。在大麥、小麥和水稻的花粉植株中，白化苗通常要占總苗數(shù)的1/3以上，嚴(yán)重的情況下，白化苗頻率可高達(dá)60%90%，這就大大限制了花藥培養(yǎng)技術(shù)在育種實(shí)踐中的應(yīng)用。和綠苗相比，花粉白化苗除了缺乏綠色外，并無其他明顯的形態(tài)學(xué)變異。但是，花粉白化苗因沒有發(fā)育完好的葉綠體，缺乏葉綠素，只能在異養(yǎng)條件下生長一段時(shí)間，很難開花結(jié)實(shí)，這給其遺傳研究帶來了難以克服的困難。6.1 白化花粉植株的亞微結(jié)構(gòu)特征根據(jù)對小麥花藥培養(yǎng)中白化苗的研究，小麥花粉綠苗和花粉白化苗雖在形態(tài)、營養(yǎng)生長和染色體倍性上無明顯差異，但白苗的生殖生長和雌蕊發(fā)育均不正常，在離體培養(yǎng)條件下，它不能完成有性

28、世代和產(chǎn)生種子。在花粉白化苗的細(xì)胞中，常發(fā)現(xiàn)有微核存在，葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，存在著原質(zhì)體，質(zhì)體早期發(fā)育正常，但發(fā)育到一定階段即停止發(fā)育，在質(zhì)體中缺乏核糖核蛋白體。某些胚性花粉粒和白苗的莖段分生細(xì)胞中出現(xiàn)染色體斷片和微核。6.2 白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理幾乎所有的研究者都發(fā)現(xiàn)內(nèi)部因素和外部因素均可在一定程度上影響花粉植株的白苗率。內(nèi)部因素有供體植株的基因型、花藥和花粉本身的狀態(tài)；外部因素有低溫預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、生長激素水平和種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)間等。在內(nèi)部因素中，基因型和花粉發(fā)育時(shí)期的影響最為明顯；在外界因素中，用28E以上高溫和高濃度2,4-D進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，延遲愈傷組織轉(zhuǎn)

29、分化培養(yǎng)，可明顯地促進(jìn)花粉白苗發(fā)生。而花藥410°C低溫預(yù)處理適當(dāng)時(shí)間，可減少白化苗發(fā)生，提高綠苗率。在小麥的花藥培養(yǎng)中，要想獲得高頻率的花粉愈傷組織，就需要高濃度的蔗糖，但使用高濃度的蔗糖會提高花藥培養(yǎng)中的白苗率。質(zhì)體DNA的缺失可能是出現(xiàn)白化苗的直接原因。從小麥的花粉白苗和綠苗中提取出較完整的DNA相比較，結(jié)果表明：白苗質(zhì)體DNA有相當(dāng)大的一段易缺失區(qū)域，白苗質(zhì)體DNA勺相對分子質(zhì)量、含量都比綠苗少得多，如相對分子質(zhì)量僅及正常質(zhì)體DNA相對分子質(zhì)量的1/4,質(zhì)體DNA在總DNA中的比例僅為綠苗的1/6。這些結(jié)果都說明小麥花粉白苗的質(zhì)體DNA是不健全的。缺失基本上都發(fā)生在植株再生的

30、過程中，因?yàn)檎T導(dǎo)再分化之前的愈傷組織內(nèi)的質(zhì)體基因組還保持完整。核基因是控制花藥培養(yǎng)力(包括綠苗率)的關(guān)鍵因素。小麥花粉白苗發(fā)生是由核基因控制的，或是由核DNA變異引起的。核基因可能是通過控制花粉質(zhì)體變態(tài)，質(zhì)體DNA吉構(gòu)改變、缺失過程發(fā)生的遲早、快慢、程度和頻率而影響花粉白苗發(fā)生的。這一推測可解釋基因型的差異和通過一些措施可以降低白苗發(fā)生、提高花粉綠苗率的原因。一些研究者認(rèn)為，離體培養(yǎng)中高頻發(fā)生的體細(xì)胞無性系變異是花粉白苗大量出現(xiàn)的原因之一。6.3 白化苗的控制李景崎等(2002)研究發(fā)現(xiàn)，小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)中，通過采取一些措施可減少或阻止白苗發(fā)生，提高花粉綠苗率：采穗時(shí)主要取主莖和大分蘗穗，取花

31、粉發(fā)育時(shí)期處于單核中晚期的幼穗。鑷取花藥接種時(shí)，幼穗穗軸中部花藥全取，下部多取，上部少取。幼穗4C低溫離體預(yù)處理24h。脫分化培養(yǎng)一般在暗室進(jìn)行，溫度3032C時(shí)，出愈率較高，但白苗多。在29C條件下培養(yǎng)，效果較為理想。脫分化培養(yǎng)基一般情況下用2.0mg/L的2,4-D與0.5mg/L的KT或6-BA配合使用。誘導(dǎo)愈傷組織分化階段，把培養(yǎng)基的碳源由11蔗糖改為9蔗糖+2麥芽糖。前期產(chǎn)生的愈傷組織分化能力較強(qiáng)，后期產(chǎn)生的愈傷組織分化能力降低，白苗率相對較高，所以出愈后應(yīng)提早進(jìn)行轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)。為了找出減少白化現(xiàn)象的有效辦法，還有待進(jìn)一步的研究。所幸的是，除葡萄外，在禾本科以外植物的花藥培養(yǎng)中未曾發(fā)現(xiàn)

32、過白化苗，在禾本科植物體細(xì)胞再生植株中，雖偶有白化苗出現(xiàn)，但頻率很低。7影響雄核發(fā)育的因子基因型植物基因型是影響花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體成功的最重要的因素之一。迄今為止，花藥培養(yǎng)的成功主要局限于3個科的植物茄科、禾本科和十字花科。由此可見，花藥對離體培養(yǎng)的反應(yīng)在很大程度上受基因型的影響。即使是同一科、屬的植物，在不同物種間也存在巨大的差異，如據(jù)Irikura(1975)報(bào)道，在屬于茄屬的46個物種和9個種間雜種中，只有19個物種和4個雜種能產(chǎn)生花粉植株。另據(jù)陳錦驊等(1982)報(bào)道，水稻不同種、亞種和品種間花藥對離體培養(yǎng)反應(yīng)的高低順序是：糯型、粳X秈雜種、粳型、秈型雜交稻、秈型。在粳稻中花粉愈傷

33、組織誘導(dǎo)率平均可達(dá)10，而在秈粳中只有12。煙草屬各個種的花藥對離體培養(yǎng)反應(yīng)最靈敏，花粉植株的獲得率最高，但是其中的郎氏煙草(Nicotianalongsdorffii)花藥培養(yǎng)卻很難成功。7.1 植株生理狀態(tài)和生長條件供體植株的年齡及其所處的生長條件(如光周期、光強(qiáng)、溫度和礦質(zhì)營養(yǎng))也能影響花藥對離體培養(yǎng)的反應(yīng)。一般來說，幼年植株的花藥反應(yīng)能力較好。在開花末季采集的花藥不但形成孢子體的頻率很低，而且發(fā)生反應(yīng)的時(shí)間也較遲。在水稻和小麥等禾谷類植物中，大田植株比溫室植株、主莖穗比分蘗穗花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率高。在煙草中，短光周期(8h)和高光強(qiáng)(16OOOIx)較有利；大麥低溫(18C)和高光強(qiáng)(

34、20000lx)較好；油菜高光強(qiáng)和一定的溫度變化較有利；生長在24C下的曼陀羅屬植株其雄核發(fā)育頻率(45%)比生長在17C(8%)下的高；對煙草植株進(jìn)行氮饑餓處理可提高花藥培養(yǎng)效果。由供體植株生長條件的差異造成的花藥對培養(yǎng)反應(yīng)的不同，可能是內(nèi)生激素水平變動的結(jié)果。7.2 花粉發(fā)育時(shí)期花粉發(fā)育時(shí)期的選擇對雄核發(fā)育也是至關(guān)重要的。一般而言單核后期花藥對培養(yǎng)反應(yīng)較好，但不同物種最適的發(fā)育時(shí)期不同檢查花粉發(fā)育時(shí)期常用的方法是醋酸洋紅染色，但對于DNA含量較低的材料，最好用孚爾根試劑染色。7.3 預(yù)處理接種前或后對花藥采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行預(yù)處理，能使綠苗產(chǎn)量大量增加。在花藥培養(yǎng)中采用的預(yù)處理方法很多，有高

35、低溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等方法。(1) 高低溫處理高低溫處理包括低溫預(yù)處理、低溫后處理以及熱擊處理。所謂低溫預(yù)處理是指在接種之前將材料用0C以上低溫處理一段時(shí)間后再行接種；低溫后處理是指花藥接種后，先置低溫條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)；熱擊處理則是指花藥接種后，先在較高溫度下(一般為3035°C)培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。近年的研究表明，多數(shù)物種的花藥培養(yǎng)中，上述幾項(xiàng)變溫措施均可在不同程度上提高花粉愈傷組織或花粉胚狀體的誘導(dǎo)率，或者提高花粉植株的再生頻率。(2)化學(xué)物質(zhì)處理化學(xué)物質(zhì)處理的方法有以下幾種： 高糖接種前用高糖預(yù)處理花藥一定時(shí)間，再轉(zhuǎn)移到適宜

36、的糖濃度下培養(yǎng)，可大幅度提高愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)率。 甘露醇用甘露醇進(jìn)行預(yù)處理在麥類作物上很普遍。甘露醇預(yù)處理比低溫預(yù)處理和對照能明顯地提高花粉存活率，提高小孢子的質(zhì)量，抑制淀粉積累，有利于小抱子分裂發(fā)育，使發(fā)育進(jìn)度比低溫預(yù)處理和對照提早23h。甘露醇不能作為一種碳源，它的作用被認(rèn)為是造成小孢子短時(shí)間內(nèi)的營養(yǎng)饑餓，從而引起小抱子去分化。但也有人認(rèn)為是給小抱子提供一個適當(dāng)?shù)臐B透壓環(huán)境。 秋水仙素是用秋水仙素(colchicine)處理可改變小抱子的有絲分裂、誘導(dǎo)它們像體細(xì)胞一樣生長。其作用被認(rèn)為擾亂了對不對稱分裂起決定作用的微管細(xì)胞骨架，使單核花粉的細(xì)胞核移向中央，導(dǎo)致均等分裂。 乙烯利乙烯利

37、是一種殺雄劑。在花粉母細(xì)胞正在減數(shù)分裂時(shí)，用乙烯利噴“中國取花春”小麥，因發(fā)生額外有絲分裂，使多核花粉增多。此外也有報(bào)道用EM(S？)、酒精、順丁烯二酰肼等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理的。(3) 其他通過研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過射線(丫射線對小抱子也有刺激作用)、離心(離心重力作用可打破微管，影響小抱子的發(fā)育)、紫外光、磁場等處理可以促進(jìn)雄核發(fā)育。7.4 培養(yǎng)基(1)基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基對花藥培養(yǎng)的成敗影響很大。(2)碳源由于不同植物花粉細(xì)胞滲透壓的差異，使得不同種類植物花藥培養(yǎng)要求不同的糖濃度。一般認(rèn)為，單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度高，在花藥培養(yǎng)中，蔗糖一直是最常用的碳源，關(guān)于糖的種類對花藥培養(yǎng)效應(yīng)的影響近

38、年有新的研究，也有些作者使用其他糖類，如麥芽糖、果糖和葡萄糖等做碳源，取得了良好的培養(yǎng)效果。（3）氨基酸和其他有機(jī)物質(zhì)氨基酸對花藥培養(yǎng)十分重要，越來越受到人們的重視。（4）植物激素培養(yǎng)基中的激素成分對于誘導(dǎo)花粉細(xì)胞的增殖和發(fā)育起著重要作用。由于植物種類的不同，花藥在離體培養(yǎng)中對激素的要求有2種不同的情況：在煙草、毛曼陀羅、假白花曼陀羅以及瘤果曼陀羅等植物中，雄核發(fā)育的途徑是直接形成花粉胚。在這些植物中，一般不需要激素，在基本培養(yǎng)基上就可以產(chǎn)生完整的單倍體植株，在有些情況下，甚至連維生素也無必要。在大多數(shù)已知能進(jìn)行雄核發(fā)育的非茄科物種中，花粉粒首先形成愈傷組織，然后，或是在同一培養(yǎng)基中，或是在略

39、加改變的培養(yǎng)基中，由愈傷組織分化出孢子體。在這些植物中，為了誘導(dǎo)花藥進(jìn)行雄核發(fā)育，必須單獨(dú)地或以不同配比在培養(yǎng)基中加人生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、復(fù)雜的營養(yǎng)混合物（如酵母浸出液，水解酪蛋白）和椰子汁等。在大多數(shù)禾本科植物如水稻、小麥、大麥和黑麥的花藥培養(yǎng)中，外源生長素，特別是2,4D（13mg/L），是啟動小抱子細(xì)胞分裂形成愈傷組織的必要條件。但燕麥和玉米例外，它們的花藥在沒有外源激素刺激的情況下，即能啟動細(xì)胞分裂。在水稻和小麥花藥培養(yǎng)基中除2,4D之外還常常添加KT0.5mg/L,其作用或在于增強(qiáng)愈傷組織的胚胎發(fā)生能力，或在于抑制花絲愈傷組織的形成。有時(shí)，通過審慎地改變培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，有可能改變雄

40、核發(fā)育的方式。例如在小麥中，如果培養(yǎng)基里含有2,4D和水解乳蛋白，花粉就形成愈傷組織；如果在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)加椰子汁，花粉粒就直接發(fā)育成胚。在秈稻的花藥培養(yǎng)中，若培養(yǎng)基里補(bǔ)加了生長素，花粉起初是沿成胚途徑發(fā)育；當(dāng)把帶有幼胚的花藥轉(zhuǎn)移到不含生長素的培養(yǎng)基上以后，就會形成分化完善的花粉胚。但是若把花藥留在含生長素的培養(yǎng)基中時(shí)間較長，就會形成易散碎的愈傷組織。在黑麥中也是這樣，為了促進(jìn)花粉胚的充分發(fā)育，防止它們愈傷化或在成熟前死亡，當(dāng)花藥已在含有激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行了68周的暗培養(yǎng)之后，必須把幼胚轉(zhuǎn)移到不含生長素的培養(yǎng)基上在光下培養(yǎng)。（5）活性炭活性炭的作用是通過吸附培養(yǎng)基中的某些物質(zhì)如激素、維生素、鐵

41、鹽等來影響外植體的生長發(fā)育。對雄核發(fā)育不依賴于外源激素的植物如煙草，在培養(yǎng)基中加入活性碳對雄核發(fā)育具有促進(jìn)作用。但對于必須依賴外源激素才能進(jìn)行雄核發(fā)育的植物來說，在花粉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加活性炭可能是有害而無益的。7.5 藥壁因子大量的證據(jù)表明，在花粉胚發(fā)育過程中花藥壁起著重要的作用。Pelletier和Ilami（1972）通過一系列的移植實(shí)驗(yàn)證明，即使把一個品種煙草的花粉移植到另一個品種的花藥中，前者也能夠順利地發(fā)育成胚。通過這項(xiàng)工作建立了一個“藥壁因子”的概念。隨后又出現(xiàn)了花藥對同一物種及不同物種離體花粉雄核發(fā)育的看護(hù)作用的報(bào)道。甚至花藥浸提液也能刺激花粉胚的形成。在大麥花藥漂浮培養(yǎng)

42、中，若使用曾經(jīng)培養(yǎng)過大麥花藥或子房7d之久的條件培養(yǎng)基，能顯著促進(jìn)花粉胚的形成。組織學(xué)研究也明確證實(shí)了藥壁因子在花粉胚發(fā)育中的作用。在煙草中，只有原來貼靠著花藥壁的花粉粒，才能順利發(fā)育成花粉胚。在天仙子中，也只有處在藥室外圍緊靠絨氈層的花粉能夠成胚。這個事實(shí)進(jìn)一步表明，由絨氈層起源的某些重要物質(zhì)的梯度變化，對于誘導(dǎo)花粉粒發(fā)育成胚起著關(guān)鍵的作用培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件如溫度、光照、板植密度等對雄核發(fā)育也有一定的影響。溫度：溫度對離體培養(yǎng)的花粉的發(fā)育有一定的影響。如煙草在27C下產(chǎn)生的單倍體植株比22C產(chǎn)生的多。不同物種花粉發(fā)育的最適溫度是不同的。一個物種花粉發(fā)育的最適溫度比不分化的愈傷組織生長的最適溫度

43、要高。光照：黑暗條件下，小植株能從花藥培養(yǎng)中發(fā)育出來，有光條件下，花藥能培養(yǎng)出更多更壯的苗。植板密度：花粉培養(yǎng)中，小孢子的植板密度和分化培養(yǎng)時(shí)愈傷組織/細(xì)胞團(tuán)植板密度對植株再生有很大影響。8通過遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生單倍體除花藥和花粉培養(yǎng)外，在遠(yuǎn)緣雜交之后有選擇地進(jìn)行染色體消除也是獲得單倍體的一個途徑。必須把未成熟胚剝離，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這種通過遠(yuǎn)緣雜交后再輔以未成熟胚培養(yǎng)的方法，還由小麥品種中國春獲得了頻率很高的單倍體。9單倍體植株的鑒定和染色體加倍花粉和花藥植株的倍性鑒定確定新形成植株的倍性是非常重要的，因?yàn)榕咝纬傻耐緩讲煌?，植株在倍性上可能存在很大差異，染色體直接計(jì)數(shù)法通過植株的根尖或莖尖等細(xì)

44、胞分裂旺盛處的細(xì)胞染色體直接計(jì)數(shù)是最有效的方法。9.1.1 間接鑒定掃描細(xì)胞光度儀鑒定采用掃描細(xì)胞光度儀(flowcytometry,FCM也叫流式細(xì)胞儀)進(jìn)行鑒定。用流式細(xì)胞測定法可迅速測定葉片單個細(xì)胞核內(nèi)DNA含量，根據(jù)DN跆量曲線圖推斷細(xì)胞的倍性。特別是在離體培養(yǎng)過程中，試管中的芽或小植株很小很嫩時(shí)，此方法僅用lcm2的樣品就很容易確定其倍性。(2) 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法葉片保衛(wèi)細(xì)胞的大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。(3) 植株形態(tài)學(xué)鑒定法不同倍性的植株在形態(tài)上有比較明顯的差別，主要表現(xiàn)在子葉，真葉、花等的形狀、大小和顏色，開花結(jié)實(shí)性，花粉著色能

45、力及大小，果實(shí)形狀及種子的形態(tài)等。在植株生長的不同時(shí)期抓住這些肉眼易辨的典型特征，就能夠有效地將變異植株篩選出來。如生長期四倍體西瓜植株比二倍體葉片肥厚，裂片寬大，葉色深綠，莖節(jié)縮短。開花期花瓣顏色深黃，花朵變大，花瓣增寬、肥厚、皺褶，花蕊和子房增大，種子增大加厚、橫徑和種臍部加寬。三倍體西瓜的子葉多數(shù)畸形或色淺，葉片薄而不對稱。三倍體和單倍體的花粉均不著色。單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。高/低溫脅迫法確定：50C/10h為高溫脅迫的臨界點(diǎn)，OC/5h為低溫脅迫的臨界點(diǎn)，通過此方法鑒定的倍性符合度為90和80。這種方法省掉獨(dú)立單株倍性鑒定過程，只需對試管再生苗進(jìn)行一次

46、短時(shí)處理，即可篩選出四倍體。(5) 雜交鑒定法分為自交鑒定和測交鑒定。前者適用于自花授粉植物，自交后代群體分離的二倍體為雜合二倍體，否則為純合二倍體。有時(shí)也利用四倍體自交結(jié)實(shí)率較低的特性鑒定四倍體植株。測交鑒定適用于雌雄異株的植物，如石刁柏、啤酒花(Humuluslupulus)、獼猴桃等。方法是使雄株和雌株雜交，從F1分離比例來判斷親代雄株的基因型，從而判斷雄親是來自小孢子還是體細(xì)胞。（6）分子標(biāo)記鑒定生化標(biāo)記鑒定。主要是運(yùn)用同工酶進(jìn)行鑒定。該標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記，若等位基因純合時(shí)，無論其拷貝有多少，表現(xiàn)在酶譜帶上僅有一條酶帶，等位基因雜合時(shí)，則呈現(xiàn)不同的酶帶。根據(jù)這一原理，選擇某一同工酶為

47、雜合表現(xiàn)型的植株作為花藥供體，分析再生植株的酶譜即可確定其來源。用同工酶基因標(biāo)記（isozymegenemarker）對花粉植株遺傳標(biāo)記的研究在野生稻、辣椒屬、楊樹、石刁柏上已有不少報(bào)道。分子標(biāo)記研究。RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，片段限制長度多態(tài)性）和RAPD（randomlyamplifiedpolymorphicDNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA是常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，近年來作為遺傳育種的重要手段得到廣泛應(yīng)用。特別是在遺傳理論研究（基因定位、基因圖譜）、鑒定染色體的同源性、物種系統(tǒng)發(fā)育及分類學(xué)上的親緣關(guān)系中發(fā)揮了很大作用。9.1 花粉和花

48、藥植株的染色體加倍單倍體植株能正常地生長到開花期，但由于缺少同源染色體，減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行，因而不能形成有活力的配子。為了得到可育的純合二倍體，必須把單倍體植株的染色體組加倍。雖然在花粉植株中染色體可自發(fā)加倍，但其頻率太低。通過人工措施則可顯著提高加倍頻率。9.2.1 莖段培養(yǎng)單倍體愈傷組織培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂（沒有核分裂的染色體復(fù)制）及花粉核的融合，形成二倍體細(xì)胞，可有意識地利用這一特點(diǎn)來獲得純合的二倍體植株。在此試驗(yàn)中，將單倍體植株的莖段置于含有一定比例的生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成。在愈傷組織生長的過程中有大量的純合二倍體細(xì)胞產(chǎn)生，并進(jìn)而分化出純合的二倍

49、體植株。9.2.2 化學(xué)試劑誘變單倍體植物染色體加倍用得最多的是化學(xué)誘變法，常用的誘變劑有秋水仙素和Oryzalin（黃草消）、trifluralin（氟樂靈，一種除莠劑）、APM（amiprophosmethyl）等除草劑，其中秋水仙素應(yīng)用最廣泛。（1）秋水仙素誘導(dǎo)浸泡法。將再生小植株從試管中取出，無菌條件下用秋水仙素直接浸泡，然后再轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。生長錐處理。用秋水仙素水溶液直接浸生長點(diǎn)；或?qū)⑵涞蔚矫耷蛏先缓髮⒚耷蛑糜陧斞炕蛞秆?，誘導(dǎo)分生組織染色體加倍；或?qū)⑦m宜濃度的秋水仙素調(diào)和在載體羊毛脂中，然后將羊毛脂涂抹在單倍體植物的頂端分生組織上誘導(dǎo)染色體加倍。培養(yǎng)基處理。將單倍體植株的

50、任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。除草劑誘導(dǎo)用抗微管形成的Oryzalin、trifluralin、APM三種除草劑分別添加適量的二甲基亞砜，對大白菜小孢子進(jìn)行處理以獲得純合雙單倍體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種除草劑與秋水仙堿具有相似的功能，但使用濃度要比秋水仙堿低100倍左右。其中APM寸離體加倍表現(xiàn)最為突出，主要是它的毒性極小，且可產(chǎn)生95%100%雙單倍體的加倍率。至于二甲基亞砜的作用，一般認(rèn)為單獨(dú)的二甲基亞砜寸單倍體的染色體加倍沒有作用，它只是秋水仙堿的一種助滲劑，寸單倍體染色體的加倍起主導(dǎo)作用的仍然是秋水仙堿。用抗微管形成的除草劑在西瓜染色體加倍上進(jìn)行了試驗(yàn)，認(rèn)為秋水仙堿并非最佳的染色體加倍誘導(dǎo)物，低濃度（1530卩mol/L）的重氮除草劑（Oryzalin）可有效地誘導(dǎo)染色體加倍，這類除草劑與紡錘絲蛋白的結(jié)合專一，寸染色體損傷小，引起其他變異的幾率可能比秋水仙堿小，并且在這些再生植株中不存在嵌合體和植株生長延遲現(xiàn)象。10在高等植物中單倍性的意義由于多數(shù)突變是隱性，當(dāng)同源染色體上有顯性等位基因存在時(shí)，它們不能表現(xiàn)