第四章抗體工程

1、第五節(jié)第五節(jié) 抗體工程抗體工程 抗體研究的抗體研究的 3 3 個(gè)階段：個(gè)階段：18901890年白喉抗毒素，年白喉抗毒素，多克隆抗體多克隆抗體；19751975年雜交瘤技術(shù)年雜交瘤技術(shù)單克隆抗體單克隆抗體；19941994年年基因工程抗體基因工程抗體. .抗體庫(kù)技術(shù)抗體庫(kù)技術(shù) ？ 抗體庫(kù)技術(shù)抗體庫(kù)技術(shù)是指是指用細(xì)菌克隆用細(xì)菌克隆代替代替B細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆來(lái)表達(dá)制備各種抗體來(lái)表達(dá)制備各種抗體。 背景知識(shí)：背景知識(shí)： 噬菌體展示技術(shù)（噬菌體展示技術(shù)（phage display techniques,PDT） 即用分子克隆的方法即用分子克隆的方法將外源基因片段插入噬菌體殼蛋將外源基因片段插入噬菌體殼

2、蛋白的非必需區(qū)白的非必需區(qū)，該基因的表達(dá)產(chǎn)物，該基因的表達(dá)產(chǎn)物與殼蛋白一起以融與殼蛋白一起以融合蛋白的形式展示于噬菌體顆粒的表面合蛋白的形式展示于噬菌體顆粒的表面，進(jìn)而通過(guò)親，進(jìn)而通過(guò)親和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，最終和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，最終獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的多肽獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的多肽/蛋白質(zhì)，并實(shí)現(xiàn)基因克蛋白質(zhì)，并實(shí)現(xiàn)基因克隆化的一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)隆化的一種重要的分子生物學(xué)技術(shù) 噬菌體展示技術(shù)的原理融合蛋白PIII基因型表達(dá)型融合蛋白 噬菌體展示技術(shù)特點(diǎn)噬菌體展示技術(shù)特點(diǎn)： 將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并

3、展示在噬菌體表面，同時(shí)的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面，同時(shí)將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使得得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機(jī)的連蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機(jī)的連結(jié)在一起結(jié)在一起。 選擇方法： 淘選（Panning)而不是 篩選（Screening)非展示系統(tǒng) 展示系統(tǒng)Solid phase selection with immunotubes BBBBBBvvImmunotubecoated withantigencoated withstreptavidin and biotinylated antigenB生物素淘篩的過(guò)程淘篩的過(guò)程biotin antige

4、nSolution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidincoated microtitre wells親合素 Wash to remove unbound phage particles.Elute bound phageAmplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea) ELISAb) Specificityc) Sequencingd) Affinitye) ActivityE.coli感染和擴(kuò)增 噬菌體展示技術(shù)最關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)有三：噬菌體展示技術(shù)最關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)有三：

5、第一，淘選的高效率使得在極低的存在 水平下，也可挑選到高親和力噬菌體； 第二，所挑選到的噬菌體可在微量存在的情況下，通過(guò)感染細(xì)菌得到富集； 第三：展示的多肽或蛋白質(zhì)與其包含在噬菌體內(nèi)部的基因密碼的連接，使得蛋白質(zhì)的序列分析既快速又簡(jiǎn)便。 噬菌體抗體文庫(kù)噬菌體抗體文庫(kù) 利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，將抗體分子片段基因與外殼蛋白基因（基因III或基因VIII）連接，構(gòu)建表達(dá)性基因文庫(kù)，即為噬菌體抗體展示文庫(kù)（phage antibody display repertoire）。經(jīng)篩選可獲得特異性抗體基因。 噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建 RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)獲取抗體某一特定基因區(qū)段.如重鏈和輕鏈可變

6、區(qū)(VH、VL)基因。 抗體基因的組合形式多為單鏈抗體scFv，也用連接鏈(G4S)3，組合成功能分子。 常用: 噬菌粒(phagemid)載體，具有噬菌體和質(zhì)粒的共同特點(diǎn)。 特點(diǎn)：抗體蛋白和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)在載體表面。再感染后，能使目的克隆得以再感染后，能使目的克隆得以擴(kuò)增。擴(kuò)增。 琥珀終止碼在適當(dāng)位置上引入載體是抗體庫(kù)的關(guān)鍵性技術(shù)。它可被抑制基因(SupE)抑制而翻譯成谷氨酸，故可用含有或不含有SupE基因的菌株篩選和鑒定融合蛋白。而克隆位點(diǎn)后的基因序列則有利于對(duì)可溶性表達(dá)產(chǎn)物的鑒定和純化。LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII 抗體分子基因片段的抗體分子基因

7、片段的可溶性表達(dá)可溶性表達(dá)：在噬菌體抗體在噬菌體抗體呈現(xiàn)中，抗體分子片段在呈現(xiàn)中，抗體分子片段在融合蛋白的融合蛋白的N端端呈游離狀態(tài)，可呈游離狀態(tài)，可正確的折疊，形成具有功能的蛋白分子。正確的折疊，形成具有功能的蛋白分子。 如果抗體片段基因和外殼蛋白基因（如果抗體片段基因和外殼蛋白基因（III或或VIII）間）間放置放置琥珀琥珀終止密碼子終止密碼子（TAG），則在），則在不帶不帶琥珀抑制基因琥珀抑制基因（amber suppressor）的宿主菌中，）的宿主菌中，TAG為終止密碼子，為終止密碼子，合成的抗體分子蛋白多肽合成的抗體分子蛋白多肽穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜，以可溶蛋白的形，以可溶蛋白的

8、形式式分泌表達(dá)分泌表達(dá)；而在帶有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的；而在帶有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗體分子多肽以融合蛋白的形式錨定在噬菌體膜上?？贵w分子多肽以融合蛋白的形式錨定在噬菌體膜上。 過(guò)程：過(guò)程： 抗原固相化；抗原固相化； 對(duì)噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)對(duì)噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級(jí)文增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級(jí)文庫(kù)，再反復(fù)與抗原吸附庫(kù)，再反復(fù)與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地?cái)U(kuò)淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地?cái)U(kuò)增。增。 目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其

9、產(chǎn)物用Western blot分析確定后，就完成了全過(guò)程。 抗體基因庫(kù)的構(gòu)建和基因篩選的抗體基因庫(kù)的構(gòu)建和基因篩選的表面呈現(xiàn)技術(shù)表面呈現(xiàn)技術(shù) 外源性段基因片克隆到外源性段基因片克隆到絲狀噬菌體絲狀噬菌體的基因組的基因組DNA中，與噬菌體基因中，與噬菌體基因III（g3）連接，外源性因基蛋白與）連接，外源性因基蛋白與基因基因III融合蛋白呈現(xiàn)在噬菌體表面，融合蛋白呈現(xiàn)在噬菌體表面，外源蛋白保持了外源蛋白保持了原來(lái)的構(gòu)象原來(lái)的構(gòu)象。立體構(gòu)象這一技術(shù)方法為構(gòu)建抗體基因。立體構(gòu)象這一技術(shù)方法為構(gòu)建抗體基因庫(kù)、庫(kù)、cDNA文庫(kù)和突變基因文庫(kù)，文庫(kù)和突變基因文庫(kù)，篩選目的基因提供了篩選目的基因提供了快速高

10、效的手段快速高效的手段，標(biāo)志著基因工程抗體發(fā)展的質(zhì)的飛，標(biāo)志著基因工程抗體發(fā)展的質(zhì)的飛躍。躍。 1、絲狀噬菌體的生物學(xué)、絲狀噬菌體的生物學(xué) 絲狀噬菌體（絲狀噬菌體（filamentous phage）包括）包括M13、f1、fd等突變體，是一種長(zhǎng)絲狀病毒顆粒，直徑為等突變體，是一種長(zhǎng)絲狀病毒顆粒，直徑為6.5nm。其基。其基因組是一個(gè)單鏈環(huán)狀因組是一個(gè)單鏈環(huán)狀DNA，編碼，編碼10種蛋白質(zhì)，其中種蛋白質(zhì)，其中g(shù)p3、gp6、gp7、gp8和和gp9 5種蛋白質(zhì)組成外殼蛋白，種蛋白質(zhì)組成外殼蛋白，基因基因VIII（gp8）是噬菌體顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白）是噬菌體顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由大約，由大約70

11、0個(gè)形態(tài)個(gè)形態(tài)亞單位圍繞病毒基因組呈管狀蛋白外殼，其余亞單位圍繞病毒基因組呈管狀蛋白外殼，其余4種外殼蛋種外殼蛋白分別由基因白分別由基因III、VI、VII、IX編碼，各有編碼，各有5個(gè)拷貝，均個(gè)拷貝，均參與噬菌體的組裝。在噬菌體的一端還含有數(shù)拷貝的次要參與噬菌體的組裝。在噬菌體的一端還含有數(shù)拷貝的次要衣殼蛋白（衣殼蛋白（gp3）。）。 2、噬菌體呈現(xiàn)中噬菌體外殼蛋白的應(yīng)用、噬菌體呈現(xiàn)中噬菌體外殼蛋白的應(yīng)用 在基因在基因III 蛋白和基因蛋白和基因VIII蛋白末端插入外源蛋白，表蛋白末端插入外源蛋白，表達(dá)的融合蛋白可呈現(xiàn)在噬菌體表面，達(dá)的融合蛋白可呈現(xiàn)在噬菌體表面，不影響噬菌體的功能不影響噬菌

12、體的功能，因而因而gp3和和gp8被應(yīng)用于噬菌體展示（被應(yīng)用于噬菌體展示（phage display）?；??；蛞騐III蛋白在噬菌體顆粒外殼上有蛋白在噬菌體顆粒外殼上有2700個(gè)拷貝，個(gè)拷貝，N-端端15個(gè)氨基酸暴露于噬菌體表面，可插入外源蛋白個(gè)氨基酸暴露于噬菌體表面，可插入外源蛋白，但外源肽，但外源肽段段多于十肽時(shí)多于十肽時(shí)會(huì)影響蛋白會(huì)影響蛋白VIII的功能?；虻墓δ堋；騃II蛋白在噬菌蛋白在噬菌體顆粒外殼上有體顆粒外殼上有3-5個(gè)拷貝，將外源基因緊靠基因個(gè)拷貝，將外源基因緊靠基因III上游，上游，在噬菌體表面表達(dá)融合蛋白，在噬菌體表面表達(dá)融合蛋白，不影響噬菌體的功能。不影響噬菌體的

13、功能。VH接頭DNAVL（1）噬菌體抗體的構(gòu)建：）噬菌體抗體的構(gòu)建：抗體抗體Fab和和ScFv均可在噬菌體中表達(dá)，均可在噬菌體中表達(dá)，并呈現(xiàn)在噬菌體表面。并呈現(xiàn)在噬菌體表面。在在Fab表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)，可將表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)，可將L鏈基因和鏈基因和Fd段基因構(gòu)建于一個(gè)載體上，段基因構(gòu)建于一個(gè)載體上，轉(zhuǎn)染大腸桿菌。轉(zhuǎn)染大腸桿菌。Fd段或段或L鏈基因與噬菌體外殼蛋白基因（基因鏈基因與噬菌體外殼蛋白基因（基因III或基因或基因VIII）相連，融合蛋白錨定在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上，與另一條鏈）相連，融合蛋白錨定在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上，與另一條鏈（游離狀態(tài)）結(jié)合可形成抗原結(jié)合特異性的抗體。（游離狀態(tài)）結(jié)合可形成抗原結(jié)合特異性的抗體

14、。在在ScFv表達(dá)時(shí)，利用表達(dá)時(shí)，利用PCR技術(shù)和技術(shù)和DNA接頭（接頭（linker），可將），可將L鏈和鏈和H鏈的鏈的V區(qū)基因隨機(jī)重組在一起，再克隆到載體中去表達(dá)區(qū)基因隨機(jī)重組在一起，再克隆到載體中去表達(dá)ScFv抗體抗體分子片段（分子片段（ScFv基因與基因基因與基因III或或VIII連接），并呈現(xiàn)在噬菌體表連接），并呈現(xiàn)在噬菌體表面利于篩選。面利于篩選。將特異性抗原固相化，用文庫(kù)的噬菌體與其反應(yīng)，將特異性抗原固相化，用文庫(kù)的噬菌體與其反應(yīng)，經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫、收獲和純化表達(dá)特異性抗體的噬菌體經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫、收獲和純化表達(dá)特異性抗體的噬菌體 。 （2）噬菌體抗體的表達(dá)載體：）噬菌體抗體的表達(dá)載

15、體：用于噬菌體抗體表達(dá)的載用于噬菌體抗體表達(dá)的載體包括體包括噬菌體載體噬菌體載體和和噬粒噬粒（phagemid）。將抗體片段基）。將抗體片段基因與野生型噬菌體基因因與野生型噬菌體基因III的的5 端連接，可表達(dá)與蛋白端連接，可表達(dá)與蛋白III N端融合的抗體片段分子，呈現(xiàn)在噬菌體的表面。端融合的抗體片段分子，呈現(xiàn)在噬菌體的表面。噬粒噬粒是含是含噬菌體基因間隔區(qū)基因的質(zhì)粒載體，本身不含噬菌體蛋白噬菌體基因間隔區(qū)基因的質(zhì)粒載體，本身不含噬菌體蛋白編碼基因，在導(dǎo)入大腸桿菌后不產(chǎn)生子代噬菌體。當(dāng)用編碼基因，在導(dǎo)入大腸桿菌后不產(chǎn)生子代噬菌體。當(dāng)用輔輔助噬菌體助噬菌體感染時(shí)，輔助噬菌體編碼的噬菌體蛋白，可

16、將單感染時(shí)，輔助噬菌體編碼的噬菌體蛋白，可將單鏈?zhǔn)闪ｆ準(zhǔn)闪NA包裝成噬菌體病毒顆粒釋放出來(lái)，其外殼蛋白包裝成噬菌體病毒顆粒釋放出來(lái)，其外殼蛋白呈現(xiàn)抗體分子片段，同時(shí)含有呈現(xiàn)抗體分子片段，同時(shí)含有g(shù)p3和和gp8，并能再次感染大，并能再次感染大腸桿菌而繁殖。噬粒具有質(zhì)粒特性，帶有抗藥性基因和復(fù)腸桿菌而繁殖。噬粒具有質(zhì)粒特性，帶有抗藥性基因和復(fù)制起點(diǎn)，便于篩選含目的片段的克隆和在大腸桿菌內(nèi)的擴(kuò)制起點(diǎn)，便于篩選含目的片段的克隆和在大腸桿菌內(nèi)的擴(kuò)增。增。 （3）噬菌體抗體分子的親和力成熟：）噬菌體抗體分子的親和力成熟： 如同模擬體內(nèi)如同模擬體內(nèi)B 細(xì)胞經(jīng)抗原多次刺激后產(chǎn)生的抗細(xì)胞經(jīng)抗原多次刺激后產(chǎn)生

17、的抗體親和力增加一樣，由于抗體基因庫(kù)的容量大，基因體親和力增加一樣，由于抗體基因庫(kù)的容量大，基因的隨機(jī)組合及的隨機(jī)組合及CDR區(qū)的堿基突變（可采取區(qū)的堿基突變（可采取PCR錯(cuò)配、錯(cuò)配、隨機(jī)突變等），可獲取高親和力的抗體基因片段。隨機(jī)突變等），可獲取高親和力的抗體基因片段。 （4）抗體分子基因片段的可溶性表達(dá)：）抗體分子基因片段的可溶性表達(dá)：在噬菌體抗體呈在噬菌體抗體呈現(xiàn)中，抗體分子片段在現(xiàn)中，抗體分子片段在融合蛋白的融合蛋白的N端端呈游離狀態(tài)，可正呈游離狀態(tài)，可正確的折疊，形成具有功能的蛋白分子。如果抗體片段基因確的折疊，形成具有功能的蛋白分子。如果抗體片段基因和外殼蛋白基因（和外殼蛋白基因（

18、III或或VIII）間放置）間放置琥珀琥珀終止密碼子終止密碼子（TAG），則在），則在不帶不帶琥珀抑制基因（琥珀抑制基因（amber suppressor）的宿主菌中，的宿主菌中，TAG為終止密碼子，合成的抗體分子蛋白多為終止密碼子，合成的抗體分子蛋白多肽肽穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜，以可溶蛋白的形式，以可溶蛋白的形式分泌表達(dá)分泌表達(dá)；而在帶有；而在帶有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗體分子多肽以融合蛋琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗體分子多肽以融合蛋白的形式錨定在噬菌體膜上。白的形式錨定在噬菌體膜上。1模擬天然全套抗體庫(kù)模擬天然全套抗體庫(kù) 抗體文庫(kù)可以達(dá)到或超過(guò)抗體文庫(kù)可以達(dá)到或超過(guò)1011庫(kù)

19、容，所以能包含庫(kù)容，所以能包含B細(xì)胞全部克隆。細(xì)胞全部克隆。 建庫(kù)的外源基因來(lái)自人體外周血、骨髓或脾臟的建庫(kù)的外源基因來(lái)自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增，這是人體多克隆細(xì)胞的總這是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA。 使用的通用引物采自多個(gè)人體，具有人的種屬普使用的通用引物采自多個(gè)人體，具有人的種屬普遍性。遍性。 抗體的抗體的VH和和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性。因此，能模擬天然全套抗體庫(kù)。樣性。因此，能模擬天然全套抗體庫(kù)。二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn) 2避開(kāi)了人工免

20、疫和雜交瘤技術(shù)避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 由于抗體庫(kù)的大容量和極高的篩選效率，使得由于抗體庫(kù)的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能免除使用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融抗體，因而能免除使用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)。合技術(shù)。3可獲得高親和力的人源化抗體可獲得高親和力的人源化抗體 在噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)中，在噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)中，VH和和VL基因的隨機(jī)基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程，所用重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程，所用的抗體基因又都來(lái)自人體，因此，所產(chǎn)生的抗的抗體基因又都來(lái)自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是

21、高親和力的人源化抗體。體必然都是高親和力的人源化抗體。 單克隆抗體單克隆抗體 噬菌體抗體噬菌體抗體 雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù) 展示技術(shù)展示技術(shù)宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞: 雜交瘤雜交瘤 細(xì)菌細(xì)菌篩選范圍篩選范圍 : 103 107 109時(shí)間時(shí)間: 幾個(gè)月幾個(gè)月 幾周幾周操作操作: 繁雜繁雜 相對(duì)簡(jiǎn)單相對(duì)簡(jiǎn)單免疫免疫: 必須必須 可避免可避免人源抗體人源抗體: +費(fèi)用費(fèi)用: 高高 低低生產(chǎn)量生產(chǎn)量: 有限有限 無(wú)限無(wú)限基因獲取基因獲取: 再克隆再克隆 直接直接應(yīng)用前景應(yīng)用前景: 有限有限 不可估不可估二、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀二、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀 1. 抗體抗體： 抗狂犬病毒的單鏈抗體，抗狂犬病毒

22、的單鏈抗體， 抗抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體，此囊膜糖蛋白的單鏈抗體，此抗體可專一性殺死被抗體可專一性殺死被HIV-1感染并感染并表達(dá)有表達(dá)有g(shù)p120的淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞, 中和響中和響尾蛇毒素的單鏈抗，尾蛇毒素的單鏈抗， 等等等等。2. 疫苗：疫苗： 展示在噬菌體表面的展示在噬菌體表面的HIV-1 的的gp120-V3 環(huán)環(huán) 可像天然抗原一樣引起可像天然抗原一樣引起顯著的免疫應(yīng)答顯著的免疫應(yīng)答, 等等。等等。3. 多肽類藥物：多肽類藥物： 如一些激動(dòng)劑或拮抗劑從多肽庫(kù)中分離鑒如一些激動(dòng)劑或拮抗劑從多肽庫(kù)中分離鑒定出來(lái)；已獲得一定出來(lái)；已獲得一13 肽，它能中和蛇毒肽，它能中和蛇毒 -bungarotoxin；從；從CX7C 多肽庫(kù)中掏選到一個(gè)多肽庫(kù)中掏選到一個(gè)多肽