常用分子生物學技術 11-7 new

1、Email: Tel: 61648209Southern Medical University南方醫(yī)科大學基因工程研究所生物化學與分子生物學教研室周玨宇周玨宇 常用分子生物學技術的原理及應用The popular technology in molecular biology: principle and application2一、分子雜交與印跡技術二、PCR技術的原理與應用三、核酸序列分析四、基因文庫五、生物大分子相互作用研究技術六、遺傳修飾動物模型的建立和應用主 要 內 容3第第 一一 節(jié)節(jié)分子雜交與印跡技術分子雜交與印跡技術Molecular hybridization & blott

2、ing technology4核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復性過程中，如果把不同復性過程中，如果把不同DNA單鏈分單鏈分子放在同一溶液中，或把子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的的單鏈分子之間有一定的堿基堿基配對配對關系，就可以在不同的分子之間形成關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙雜化雙鏈鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術的原理5實質是核酸分子的變性與復性過程6核酸分子雜交技術核酸分子雜交技術是依據(jù)是依據(jù)DNA雙鏈堿基雙鏈堿基互補、

3、變性和復性互補、變性和復性原理，用已知堿基序原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針檢測樣本中列的單鏈核酸片段作為探針檢測樣本中是否存在與其互補的同源核酸序列是否存在與其互補的同源核酸序列。7雜交分離、變性、轉移、固化DNA片段標記核酸探針制備待測核酸樣品制備核酸探針分子雜交操作程序預雜交加入標記核酸探針漂洗除去未參與雜交的標記探針檢測雜交信號8（一）印跡技術（一）印跡技術利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉移到轉移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因這一技術類似于用吸墨紙吸

4、收紙張上的墨跡，因此稱之為此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。，譯為印跡技術。 9帶有帶有放射性核素、生物素或熒光染料放射性核素、生物素或熒光染料標記標記的，且序列已知的，與目的基因互補的核酸序的，且序列已知的，與目的基因互補的核酸序列被稱為列被稱為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。存在。 （二）探針技術（二）探針技術10二、印跡技術的類別及應用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern Blotting)（三

5、）蛋白質的印跡（三）蛋白質的印跡 (Western Blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析、重組質粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。11英國人英國人Southern (1975)發(fā) 明 ， 將 瓊 脂 糖 中 的發(fā) 明 ， 將 瓊 脂 糖 中 的DNA轉移到硝酸纖維素轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上進行膜或尼龍膜上進行DNA分子雜交分析的方法。分子雜交分析的方法。 Southern印跡Edwin Southern12是經典的是經典的RNA分析法，用于組織細胞中總分析法，

6、用于組織細胞中總RNA或或mRNA的定性和定量分析。過程類似的定性和定量分析。過程類似于于Southern blotting。 Northern印跡13Northern印跡分析原理示意圖印跡分析原理示意圖14Nouthern 印跡檢測印跡檢測miRNA的表達的表達15蛋白質水平上檢測細胞或組織中特定基因的表達活蛋白質水平上檢測細胞或組織中特定基因的表達活性的最常用的方法（定性和半定量分析）。性的最常用的方法（定性和半定量分析）。Western印跡16 蛋白質樣品的制備蛋白質樣品的制備 SDS-PAGE分離分離 蛋白質轉膜蛋白質轉膜 特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質（抗特異抗體（即第一抗體）

7、與膜上的蛋白質（抗原）印跡雜交原）印跡雜交 再經偶聯(lián)了可檢測標記信號的第二抗體（即抗再經偶聯(lián)了可檢測標記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的酶的Ig） 最后經與酶的底物反應而顯影、成像，經掃描最后經與酶的底物反應而顯影、成像，經掃描后獲取免疫印跡信息后獲取免疫印跡信息Western blot基本程序171819辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗可以使加入的化學發(fā)光底物發(fā)生氧化降解，發(fā)射波長為428nm的光，并可通過X光膠片感光記錄下來。 20SDS-PAGE purified recombinant human CK2(重組人酪

8、蛋白激酶2) subunit and its Western blotting用已知的特異抗體檢測目的基因蛋白重組人酪蛋白激酶2 21三種印跡技術的比較22放射自顯影照片23其他：斑點印跡斑點印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA芯片芯片 (DNA chip)24斑點印跡 (dot blotting) 將將RNA或或DNA變性后直接點在尼龍膜或硝酸纖變性后直接點在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用維素膜上，再用放射性或非放射性標記物標記放射性或非放射性標記物標記的寡核苷酸探針與之雜交。的寡核苷酸探針與之雜交。 用途：特定基因的定性分

9、析。用途：特定基因的定性分析。2526原位雜交（in situ hybridization，ISH） 將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列?？蓪毎蚪M織中原位表達的mRNA進行區(qū)域定位。優(yōu)點：不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)。27小鼠大腦皮層mRNA原位雜交細胞原位雜交28miRNA的原位雜交2930DNA芯片 將多種已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于檢測細胞或組織樣品中的核酸種類的技術。3132疊加圖：綠色代表下調；紅色疊加圖：綠色代表下調；紅色代表上調代表上調 ；黃色無差異。；黃色無差異

10、。正常樣品正常樣品Cy3標記標記待測樣品待測樣品Cy5標記標記疊加疊加石奕武，胡維新等：多發(fā)性骨髓瘤的基因表達譜分析，石奕武，胡維新等：多發(fā)性骨髓瘤的基因表達譜分析，湖南醫(yī)科大學學報，湖南醫(yī)科大學學報，2003，28（3）：）：201205331. 芯片的制備 Gene probes（cDNA、DNA）substrate Ready-to-usemicroarrayOligo probesAGCTorarrayer34Sample cellsExtract RNA or DNA2) RT or PCR amplification3) Fluorescent labelingReference

11、cellsSample readycombineLabeled RNA or DNA (Sample )Labeled RNA or DNA (Reference) 2)1)3)1)2)3)2. 基因表達譜雙色標記353. 分子雜交1) hybridizeApply sample2) rinse364. 檢測分析Laser 1Laser 2Detector 1Detector 2Scanner375. 圖 像 處 理Detector 1Detector 2False-color differential image386. 圖 像 分 析394041第第 二二 節(jié)節(jié) PCR技術的原理與應用技術

12、的原理與應用（Polymerase Chain Reaction，PCR）42聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。431971年，Khorana（美國MIT教授，1968年諾貝爾醫(yī)學獎得主）：“經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因?！焙怂狍w外擴增最早設想被遺忘原因：（1）很難進行測序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發(fā)現(xiàn)了II型限制酶， 體外克

13、隆基因已成為可能。44 1976年，臺籍科學家錢嘉韻（Alice Chien）從黃石國家公園的嗜熱菌Thermus aquaticus中分離出熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶。 1985年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis發(fā)明PCR反應，Saiki等首次應用PCR法成功地擴增了人 -珠蛋白的DNA，并應用于鐮刀狀紅細胞貧血的產前診斷。4546 1988年Saiki開始將耐熱性Taq DNA聚合酶應用于PCR，整個反應只加一次酶即可，擴增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡化。 1989年被譽為的“分子年”，PCR為十大科技發(fā)明之首。 1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學獎。

14、47 patent sold by Cetus corp. to La Roche for $300 million depends on thermo-resistant DNA polymerase (e.g. Taq polymerase) and a thermal cycler48The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael SmithLa Jolla, CA, USA Kary B. Mullis

15、 University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies495 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5

16、 5 5 5 Template DNA一、PCR技術的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 50Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。5130次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No. ofNo. Amplicon Cycles Copies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,82452u理論擴增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），2530循環(huán)，目標DNA可增加109倍。u實際擴增率：()n，X為PCR的實際擴增率，平均約為75

17、%。u由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實際上進行30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達106107。u以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。5354PCR反應條件變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C55模板DNA引物Taq DNA聚合酶4種dNTP含Mg2+的緩沖液。PCR的反應體系56 DNA RNA：總RNA、mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA基因組DNA質粒DNA（一）（一） 模板（模板（template ）57模板模板DNA的來源：的來源： 微生物中提取微生物中提取DNA 從細胞中提取從細胞中提取DNA：血

18、細胞、絨毛、尿樣、毛：血細胞、絨毛、尿樣、毛 發(fā)、精斑、口腔上皮細胞發(fā)、精斑、口腔上皮細胞 固定和包埋的組織標本：脫蠟、蛋白酶固定和包埋的組織標本：脫蠟、蛋白酶K消化消化模板模板DNA的濃度：的濃度： 0.12ug/100ul體系體系 PCR產量隨模板產量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高濃度的增加而顯著升高 模板模板DNA濃度過高導致非特異性產物增加濃度過高導致非特異性產物增加 58（二）（二） 引物（引物（primers） 人工合成的兩段寡核人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的與感興趣區(qū)域一端的一條一條DNA模板鏈互補，模板鏈互補，另一個引物與感興趣另一個

19、引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補模板鏈互補3355Sense primerAntisense primer59 引物：決定引物：決定PCR反應的特異性反應的特異性 PCR 產物的產物的特異性特異性取決于取決于引物與模板引物與模板DNA互補的程度互補的程度 理論上，只要知道任何一段模板理論上，只要知道任何一段模板DNA序序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，用引物，用 PCR就可將模板就可將模板DNA在體外大在體外大量擴增量擴增60u基本原則是最大限度地提高擴增效率和特基本原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能抑制非

20、特異性擴增。異性，同時盡可能抑制非特異性擴增。引物設計的原則61引物長度：引物長度： 15-30bp，常用，常用20bp左右左右 引物的有效長度不能大于引物的有效長度不能大于 38 bp，否則最適，否則最適 延伸溫度會超過延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度聚合酶的最適溫度 （74），不能保證），不能保證PCR擴增產物的特異性擴增產物的特異性引物擴增跨度：引物擴增跨度：以以500bp為宜為宜 特定條件下可擴增長至特定條件下可擴增長至10kb的片段的片段62引物堿基：引物堿基：G+C含量以含量以40-60%為宜為宜 G+C太少擴增效果不佳，太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非過多易出現(xiàn)非

21、特異條帶特異條帶 ATGC最好隨機分布，避免最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不應超過端不應超過3個連續(xù)個連續(xù)的的G或或C避免引物內部出現(xiàn)二級結構和引物間互補避免引物內部出現(xiàn)二級結構和引物間互補 特別避免特別避免 3端的互補，否則會形成引物二聚端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性的擴增條帶體，產生非特異性的擴增條帶 6364引物引物 3端的堿基要求嚴格配對（不能做任何端的堿基要求嚴格配對（不能做任何修飾）修飾） 特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端 堿基不配對而導致堿基不配

22、對而導致PCR失敗失敗引物引物5端可修飾端可修飾 引物引物5端限定著端限定著PCR產物的長度，但對擴增特產物的長度，但對擴增特 異性影響不大；引物異性影響不大；引物5端堿基可不與模板端堿基可不與模板DNA 互補而呈游離狀態(tài)；引物互補而呈游離狀態(tài)；引物5端最多可加端最多可加10個堿個堿 基而對基而對PCR反應無影響反應無影響653限制性內切酶的識別序列限制性內切酶的識別序列啟動子序列啟動子序列定點突變定點突變探針標記探針標記（放射性元素或非放射性物質，如生物素、地高（放射性元素或非放射性物質，如生物素、地高辛等）。辛等）。66引物的特異性：引物的特異性： 引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列引物應與

23、核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯無明顯 同源性同源性引物量：引物量： 每條引物的濃度每條引物的濃度0.1 0.5M，以最低引物量，以最低引物量產生所需要的結果為好產生所需要的結果為好引物濃度偏高會引起引物濃度偏高會引起錯配錯配和和非特異性擴增非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會且可增加引物之間形成二聚體的機會67引物設計軟件引物設計軟件 Primer Premier 5.0 Oligo Primer express primer 3 MethPrimer68（三）（三） DNA 聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）Thermus aquaticus69n目前有兩種 Taq D

24、NA 聚合酶供應 天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成n一個典型的 PCR反應約需酶量1- 2.5U/100 ul體系n濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少7071 特性：特性： 熱穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性：92.5、95、97.5時，半衰期時，半衰期分別為分別為130 min、40 min、5-6 min 延伸效率：延伸效率：75-80時，時，150個核苷酸個核苷酸/s 校正功能：校正功能：Taq DNA聚合酶沒有聚合酶沒有3-5外切酶活外切酶活性，性，Vent 、Pfu等具有等具有3-5外切酶活性外切酶活性72（四）（四） dNTP 的質量與濃度的質量與濃度 在在P

25、CR反應中，反應中，dNTP應為應為50200M，濃，濃度過低會度過低會降低降低PCR產物量產物量 注意注意4種種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制的濃度要相等（等摩爾配制 ），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配偏高或偏低），就會引起錯配 高濃度的高濃度的dNTP可與可與Mg2+結合，使游離的結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響濃度下降，影響DNA聚合酶的活性聚合酶的活性 73（五）（五） PCR緩沖液（緩沖液（PCR buffer） 一般組成：一般組成：50mM KCl, 10-50mM Tris-HCl（室溫（室溫PH8.3）

26、，），1.5mM MgCl2 附加成分：牛血清白蛋白、明膠、非離附加成分：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如子去污劑（如Tween20，濃度，濃度0.05%）二甲亞砜（二甲亞砜（DMSO）74Mg2+濃度 Mg2+對對PCR擴增的擴增的特異性特異性和和產量產量有顯著有顯著的影響的影響 在一般的在一般的 PCR反應中，各種反應中，各種dNTP濃度濃度為為200umol/L時，時，Mg2+濃度為濃度為1.52.0 mmol/L為宜為宜 Mg2+濃度過高，濃度過高，反應特異性降低反應特異性降低，出現(xiàn)，出現(xiàn)非特異擴增，非特異擴增， 濃度過低會濃度過低會降低降低 Taq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性

27、，使反應產物減少，使反應產物減少75二、PCR技術的主要用途（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析76 巢式PCR（nested PCR ） 逆轉錄PCR（RT-PCR） 原位PCR（in situ PCR） 熒光定量PCR（qPCR）三、幾種重要的PCR衍生技術77其他其他PCR技術技術 名名 稱稱 主主 要要 用用 途途簡并引物擴增法簡并引物擴增法擴增未知基因片斷擴增未知基因片斷巢式巢式PCR提高提高PCR敏感性、特異性，可分析突變敏感性、特異性，可分析突變復合復合PCR同時檢測多個突變或病原同時檢測多個突變或病原反向反

28、向PCR擴增已知序列兩側的未知序列，致產物突變擴增已知序列兩側的未知序列，致產物突變單一特異引物單一特異引物PCR擴增未知基因組擴增未知基因組DNA單側引物單側引物PCR通過已知序列擴增未知通過已知序列擴增未知cDNA錨定錨定PCR分析具有不同末端的序列分析具有不同末端的序列增效增效PCR減少引物二聚體，提高減少引物二聚體，提高PCR特異性特異性固著固著PCR有利于產物的分離有利于產物的分離cDNA末端快速擴增末端快速擴增擴增擴增cDNA末端末端定量定量PCR定量定量mRNA或染色體基因或染色體基因原位原位PCR研究表達基因的細胞比例研究表達基因的細胞比例臆斷臆斷PCR鑒定細菌或遺傳作用鑒定細

29、菌或遺傳作用通用引物通用引物PCR擴增相關基因或檢測相關病原擴增相關基因或檢測相關病原78（一）巢式PCR（nested PCR） Two sets of primers are used in two successive PCRs.79原理：先在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板合成互補的cDNA（complementary DNA），再以cDNA為模板進行PCR反應。是一種快速、簡便、敏感性極高的檢測mRNA表達的方法。（二）逆轉錄PCR（RT-PCR）808182（三）原位PCR技術 (in situ PCR) 原位PCR技術就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來，從而

30、在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。 保持了兩項技術的優(yōu)勢又彌補了各自的不足。是細胞學診斷中一種嶄新的檢測技術。83細胞或組織固定：經固定和乙醇通透化處理后適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入；PCR擴增細胞內目的片段；原位雜交檢測擴增產物。84multidrug resistance associated-protein (mrp) genemultidrugresistanceassociatedprotein85（四）實時PCR技術 (real time PCR) 實時PCR(real-time PCR)技術通過動態(tài)監(jiān)測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對

31、定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。 兩種方法：SYBR green（熒光染料摻入法）和Taqman probe （探針法）。 86p 實時熒光定量PCR常規(guī)定量PCR技術： 對PCR擴增反應的終產物進行定量 重復性差 半定量實時定量PCR技術： 對PCR擴增反應中每一輪循環(huán)的產物進行定量87同一個樣品重復同一個樣品重復96次次p起點定量與終點定量終點定量起點定量l 起始DNA量是樣本中本來的量，更有意義；終點DNA量經過PCR “加工”，不是所需要的數(shù)據(jù)l 起點定量誤差小，終點定量誤差大88PCR方程只在指數(shù)期成立方程只在指數(shù)期成立循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)線性增長期平臺期y = x(1+e)n指數(shù)增長期

32、指數(shù)增長期89p熒光定量PCR技術基本原理 熒光擴增曲線圖 Ct值 閾值 標準定量曲線 90 熒光擴增曲線：每個循環(huán)收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到熒光擴增曲線。91什么是CT值熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長（即穿過閾值線）時的循環(huán)次數(shù)從基線到指數(shù)增長的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)半對數(shù)圖譜半對數(shù)圖譜線性圖譜線性圖譜92什么是閾值（threshold）基線范圍閾 值標準偏差標準偏差基線信號的標準偏差基線信號的標準偏差 x 10 熒光域值是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 前15個循環(huán)的熒光信號為熒光本底

33、信號93標準定量曲線CT值與值與起始起始DNA濃度的關系濃度的關系CT值lg 起始DNA濃度CT = - k lgX0 + b94與與DNA結合時發(fā)光結合時發(fā)光游離時不發(fā)光游離時不發(fā)光 1. SYBR Green I染料法染料法SYBR Green I 是是一種一種DNA小小溝結合染料溝結合染料95在在PCR過程中染料與過程中染料與DNA結合發(fā)光結合發(fā)光聚合完成聚合完成聚合開始聚合開始96熔解曲線熔解曲線(Dissociation curve) 導數(shù)圖譜導數(shù)圖譜 原始數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù) 只有染料法才需要做熔解曲線只有染料法才需要做熔解曲線探針法沒有必要探針法沒有必要總的DNA雙螺旋結構降解一半的溫度

34、稱為熔解溫度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。97染料法小結染料法小結成本低：不需要探針適合初步篩查：先用SYBR篩查，再用探針法熔解曲線：鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體無模板特異性：不能分辨主帶與雜帶，是總信號不能做多重檢測：每孔只能檢測一個目標基因靈敏度低：適合于5000 拷貝以上的基因定量98 TaqMan探針的結構探針的結構 35RQ33553552. 熒光標記探針法熒光標記探針法99TaqMan探針定量原理探針定量原理reverse primerRQforward primer33553551. 聚合probeRQ33553552. 鏈取代Q33553553. 探針被切斷R35

35、53554. 聚合完成QRR = 報告基團報告基團ReporterQ = 淬滅基團淬滅基團Quencher3100當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一個熒光基團的吸收光譜重疊，且當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一個熒光基團的吸收光譜重疊，且兩個兩個基團距離足夠近基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉移長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉移(FRET)，實際相當于短波長熒光基團釋放的熒光被屏蔽實際相當于短波長熒光基團釋放的熒光被屏蔽。 Frster resonance e

36、nergytransfer through space(Frster Ann.Phys. 1948)熒光共振能量轉移熒光共振能量轉移(FRET)101Taq酶的酶的53外切活性外切活性102TaqMan MGB探針探針 MGB完全配對，有信號完全配對，有信號 MGB一個堿基不配對，沒有信號一個堿基不配對，沒有信號MGB探針能夠分辨探針能夠分辨1個堿基的差別個堿基的差別103 TaqMan MGB探針原理探針原理AGGCCTTGAGAGATATRGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR|QQ(non-fluorescent quenc

37、her) NFQQMGB(minor groove binder)NFQMGBR報告熒光報告熒光非熒光淬滅基團非熒光淬滅基團小溝結合物小溝結合物提高探針提高探針Tm值值104降低背景熒光：MGB探針的淬滅基團NFQ，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。提高Tm值，探針設計更短：MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10C左右，使MGB探針可比普通TaqMan探針設計得更短，既降低了成本，也使探針設計成功率大為提高。105兩種探針比較兩種探針比較TAMRA0.00.20.40.60.81.01.21.40510152025303540Cycle Number RnMGBTAMRA探針：長

38、探針：長38-mer: ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGMGB探針：長探針：長17-mer:CTGTAAGTAGATATAAC106Loop能和靶序列互補能和靶序列互補Stem是由互補序列組成是由互補序列組成分子信標分子信標（Molecular beacon）3. TaqMan探針的衍生形式探針的衍生形式工作原理工作原理 發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針 內部淬滅的熒光團內部淬滅的熒光團107RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信標技術108Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC

39、 Red 640FRET ProbesExcitationEmissionTransfer熒光能量傳遞雜交雙探針雜交雙探針109探針法小結探針法小結No Blots!No Gels!既靈敏又特異：PCR與分子雜交的結合 雙倍放大：PCR放大與熒光放大的結合110111第第 三三 節(jié)節(jié)核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic acid sequence analysis112分子生物學的三大核心技術DNA序列分析序列分析DNA測序，測序，1977聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應DNA擴增，擴增，1985DNA重組技術重組技術基因克隆，基因克隆，1973113核酸序列分析的基本原理化學裂解法

40、(Maxam-Gilbert法)末端合成終止法 (Sanger法)DNA序列測定是基因診斷最確切的方法。序列測定是基因診斷最確切的方法。114一、化學裂解法(Maxam-Gilbert法)基于某些化學試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應強度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5末端，經放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。115Maxam-Gilbert化學降解測序法化學降解測序法 116 (Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法)HO P O

41、 P O P O CH2OOOOHOHOHOA, C, G or T13 OH5 雙脫氧核苷三磷酸脫去脫去二、DNA鏈末端合成終止法117117DNA單鏈模板 末端終止118119120雙脫氧末端終止法 讀出模板互讀出模板互補序列補序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反應混合物反應混合物Klenow酶酶 未知序列的單鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測讀出待測序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性標記的引物放射性標記的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTG

42、ACTTCGACAA5 3 121122123The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Paul BergWalter GilbertFrederick Sanger1/2 of th

43、e prize1/4 of the prize1/4 of the prizeStanford University Stanford, CA, USAHarvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom 124DNA自動測序法設計原理：以Sanger法為基礎熒光標記物：不同顏色的熒光分別代表A、G、C、T電泳 電信號 顯示125同位素標記到熒光標記，平板電泳到毛細管電泳多色熒光標記毛細管電泳 單色熒光

44、標記平板電泳同位素標記平板電泳A C G TA C GT測序圖譜測序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T126ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5 TG A A T G A 3ACG CT127ABI 3730 DNA測序儀測序儀128DNA自動測序結果舉例129表示一個表示一個SNP位點，該位點出現(xiàn)了雙峰，對應的核苷酸分位點，該位點出現(xiàn)了雙峰，對應的核苷酸分別為別為C和和T，因此該位點為，因此該位點為CT雜合型，如果該位點只有一個雜合型，如果該位點只有一個峰峰C或者或者T，則該位點基因型為，則該位點基因型為CC或或TT純合型

45、純合型130目前所用測序技術的缺點1、原理基于DNA鏈終止法，故測序長度受限，目前為1000 nt左右。2、測序反應費時費力 科學家們完成第一個人類基因組測序整整花了13年的時間，耗費了30億美元的費用。3、測序準確度不高 DNA聚合酶造成的堿基錯配，DNA序列判讀錯誤。4、測序基于PCR反應，需要引物，并且有些結構復雜的難于進行PCR反應的片段不能測序。131下一代測序技術 又稱為二代測序技術，其代表技術為羅氏公司(Roche)的454測序儀(Roche GS FLX sequencer), Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)和

46、ABI的SOLiD測序儀(ABI SOLiD sequencer)。132 可實現(xiàn)大規(guī)模并行化分析 不需電泳，設備易于微型化 樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本 優(yōu)勢： 測序策略主要基于循環(huán)芯片測序法（Cyclic-array sequencing），即制備DNA文庫，單分子擴增，在固相載體上形成DNA簇陣列，并行地利用DNA聚合酶或者連接酶進行酶促反應，同時讀取反應產生的特異性熒光信號，最終得到超大量的DNA序列信息。 133舉例：舉例：Solexa測序測序HiSeq 2000134基本流程： 將基因組DNA隨機切割成為小片段DNA； 在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單

47、鏈模板文庫； 將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面； 對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。 針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環(huán)反應，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定堿基序列。135 Solexa測序：在一個反應中同時加入4種核苷的標簽，采用邊合成邊測序（SBS sequencing by synthesis ）。 完成人類基因組草圖不同測序儀的比較圖136單分子測序技術被稱為第三代測序技術單分子測序技術被稱為第三代測序技術 主要策略： 通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現(xiàn)單分子測序，如單分子實時技術（single molecu

48、le real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學方式來實現(xiàn)單分子測序； 直接讀取單分子DNA序列信息。 137基基 因因 文文 庫庫Gene Library第第 四四 節(jié)節(jié)138基因組DNA文庫 (genomic DNA library)cDNA文庫 (cDNA library) 基因文庫 (gene library)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。139一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。 用于構建基因組文庫的載體有 噬菌體、粘粒和

49、酵母人工染色體等。140cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經逆轉錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。 二、cDNA文庫141142第五節(jié)第五節(jié) 生物大分子相互作用生物大分子相互作用研究技術研究技術The method of Protein-protein and Protein-DNA intraction143 酵母雙雜交 各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉換效應分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等一、蛋白質相互作用研究技術144標簽融合蛋白結合實驗是一個基于親和色譜原理的分析蛋白質體外直接相互作用的

50、方法。（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結合、分析兩種分子結合的具體結構部位及篩選細胞內與融合蛋白相結合的未知分子。 145標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖146（二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 是以抗體和抗原間專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 原理：如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。 147實驗流程示意圖148缺點為：

51、1. 可能檢測不到低親和力和瞬間的Pr-Pr相互作用2. 兩種Pr的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；3. 必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。 149（三）酵母雙雜交技術的基本原理和用途150酵母轉錄因子（Gal 4）與BD-fusion -誘餌（bait）與AD-fusion -獵物或靶蛋白（prey or target protein）報告基因（reporter gene） -Lac Z（編碼-半乳糖苷酶）檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因。151ADYADYXDNA-BDGAL4

52、UASPromoterlacZ reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ reporter geneXDNA-BD X-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的顯色底物，在-半乳糖苷酶的催化下會產生藍色產物，所以可以輕易的檢測出LacZ基因的表達。 152n 酵母雙雜交系統(tǒng)的應用 證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用的生物信息學推測。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質分子的相互作用功能結構域或關鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質的編碼基因與BD基因融合成為“

53、誘餌”表達質粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因的表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質。153或稱凝膠遷移變動實驗(gel shift assay)，最初用于研究DNA結合蛋白與相應DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經成為轉錄因子研究的經典方法。目前也被用于研究RNA結合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質相互作用分析技術（一）電泳遷移率變動測定（EMSA）154細胞蛋白質提取物標記的DNA片段蛋白質與DNA結合蛋白質-DNA復合物電泳遷移滯后凝膠電泳顯影滯后條帶表明DNA是與蛋白質結合的區(qū)域只能確定只能確定DNA序列中含有蛋序列中含有蛋白結合位點白結合位點n 凝膠遷移實驗結果示意圖155染 色 質 免 疫 沉 淀 技 術 ( c h r o m a t i n