細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用與進(jìn)展一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用與進(jìn)展 1、熱原 2、歷史回顧-鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 3、BET的發(fā)展趨勢(shì)與特點(diǎn) 1、熱原 -熱原是指臨床上引起哺乳動(dòng)物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)熱原是指臨床上引起哺乳動(dòng)物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)。 -Webster -Webster將熱原定義為將熱原定義為“ “ 致熱劑致熱劑”。 1)1)早期的熱原研究早期的熱原研究 靜脈療法的研究與熱原的研究密切相關(guān) 在18,19世紀(jì)有很多關(guān)于靜脈療法的報(bào)道,所有病人在注射后都伴隨有發(fā)熱反應(yīng),當(dāng)時(shí)的醫(yī)生都深信發(fā)熱對(duì)人體有益 1912年,Hort和Penfold闡明注射

2、發(fā)熱的真正本質(zhì),將細(xì)菌分為熱原和非熱原兩種: A A、革蘭氏陰性細(xì)菌為熱原細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌為熱原細(xì)菌 B、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為非熱原細(xì)菌 他們推斷出所有的注射發(fā)熱都是由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的可濾過的,熱穩(wěn)定的物質(zhì)導(dǎo)致的 2)2) 熱原的檢測(cè)熱原的檢測(cè) 1941年,美國(guó)USP,FDA和NIH(美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所)邀請(qǐng)了14個(gè)制藥廠商參與第一次熱原的協(xié)作研究。 1942年,美國(guó)藥典第一次收載熱原檢查法 該方法是將一定量的供試品通過靜脈注入家兔體內(nèi),在規(guī)定時(shí)間內(nèi),觀察家兔體溫升高的情況來判定供試品中所含熱原量是 否符合規(guī)定。 3)3) 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(BET)(BET) 利用鱟試劑來檢測(cè)

3、由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素,用以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量是否符合規(guī)定 2、歷史回顧鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 1)1)國(guó)際國(guó)際 1956年,美國(guó)科學(xué)家Frederic Bang發(fā)表論文鱟的一種細(xì)菌性疾病,闡述了細(xì)菌內(nèi)毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象.隨后,Bang 和Levin發(fā)明了鱟試劑。 1980年,FDA發(fā)表使用鱟試劑檢查人用和獸用注射藥終成品內(nèi)毒素的準(zhǔn)則;美國(guó)藥典20版(USPXX)收載BET法。 1989年英國(guó)藥典收載BET法 1991年日本藥局方收載BET法。 1999年,USPXXIV版規(guī)定670種藥品用BET法檢查,保留熱原檢查的藥品約20種。 2000年,國(guó)

4、際調(diào)和委員會(huì)使USP,EP和JP達(dá)成BET的國(guó)際調(diào)和案,統(tǒng)一的BET法收載于USPXXIV版NF19的第二增補(bǔ) 本中,并于2001年1月1日生效 2)2)國(guó)內(nèi)國(guó)內(nèi) 1983年,由11個(gè)單位參加的衛(wèi)生部鱟試劑研究協(xié)作組的成立。 1988年,衛(wèi)生部頒布細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和鱟試劑標(biāo)準(zhǔn) 1991年,衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定4種藥品可使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。 1993年,中國(guó)藥典(CP)九零版第二增補(bǔ)本收載BET法。 1995年版CP規(guī)定13個(gè)品種使用BET法。 2000年,CP2000版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種增至69種;附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中收錄了BET定量法。 2005年,CP2005版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

5、品種增至168種;BET法正式收載光度測(cè)定法。 3、BET發(fā)展趨勢(shì)與特 1)BET1)BET技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)(1)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查 - BET法所具有的優(yōu)點(diǎn):快速快速, ,靈敏靈敏, ,可標(biāo)準(zhǔn)化可標(biāo)準(zhǔn)化等(2)走向統(tǒng)一的BET法 - WHO實(shí)現(xiàn)了內(nèi)毒素的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(IS)的效價(jià)(IU)與各國(guó)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)(EU)的統(tǒng)一,即1IU=1EU。 2)BET2)BET技術(shù)及應(yīng)用發(fā)展的特點(diǎn)技術(shù)及應(yīng)用發(fā)展的特點(diǎn) (1)BET方法呈多樣化凝膠法凝膠法 比濁法 - 動(dòng)態(tài)比濁法 - 終點(diǎn)比濁法 比色法 - 動(dòng)態(tài)比色法 - 終點(diǎn)比色法 (2)BET趨向自動(dòng)化 凝

6、膠法 恒溫設(shè)備方面,干式恒溫儀器逐步取代水浴恒溫箱 定量BET 試管式定量檢測(cè)儀 酶標(biāo)板式定量檢測(cè)儀 全自動(dòng)的BET系統(tǒng) 專用的數(shù)據(jù)軟件 3)3)BETBET試劑的發(fā)展試劑的發(fā)展 鱟試劑的靈敏度越來越高 凝膠法最高達(dá)0.0075EU/ml,商品試劑0.015EU/ml 定量法高達(dá)0.001EU/ml 4)4)BETBET應(yīng)用的領(lǐng)域越來越廣應(yīng)用的領(lǐng)域越來越廣 藥品檢驗(yàn) 藥品生產(chǎn)過程質(zhì)控 臨床應(yīng)用:輔助診斷 其它領(lǐng)域:食品衛(wèi)生,環(huán)境保護(hù) 二、細(xì)菌內(nèi)毒素的理論基礎(chǔ)二、細(xì)菌內(nèi)毒素的理論基礎(chǔ) 1、細(xì)菌內(nèi)毒素 2、鱟試劑 3、BET檢查用水 4、BET檢查程序 5、5,2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 6、相

7、關(guān)參數(shù)的計(jì)算 7、試驗(yàn)相關(guān)知識(shí) 1、細(xì)菌內(nèi)毒素 1)1)化學(xué)成分及特性化學(xué)成分及特性 革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物 是高分子量脂多糖復(fù)合物是高分子量脂多糖復(fù)合物(LPS)(LPS) 單體分子量介于10,000至20,000道爾頓 典型地以100,000至500,000道爾頓的聚合體形式存在 (1)特性 - 致熱性致熱性：內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞,使之釋放內(nèi)原性熱原,再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞, 引起發(fā)熱反應(yīng)。 - 耐熱性耐熱性：需要在250攝氏度干熱30分鐘才能徹底滅活。 - 分子極性分子極性：多糖鏈有親水性,脂肪鏈具有疏水性,在水中呈不均勻分布 。 - 酸堿性酸堿性：與強(qiáng)酸

8、強(qiáng)堿水解反應(yīng)。 - 鱟反應(yīng)性鱟反應(yīng)性： 能與鱟試劑發(fā)生多級(jí)酶促反應(yīng),形成凝膠。除上述性質(zhì)外,LPS還有許多其它的生物活性 (2)化學(xué)結(jié)構(gòu) 含有含有3 3個(gè)截然不同的區(qū)域個(gè)截然不同的區(qū)域 O-O-特異側(cè)鏈特異側(cè)鏈 核心多糖核心多糖 類脂類脂A A 2)2)細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 內(nèi)毒素是熱原之一種內(nèi)毒素是熱原之一種。 醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點(diǎn)是醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點(diǎn)是, ,內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原, ,控制內(nèi)毒素污控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱原污染染就等于控制熱原污染。 3)3) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與環(huán)境內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與

9、環(huán)境內(nèi)毒素 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 環(huán)境內(nèi)毒素環(huán)境內(nèi)毒素( (主要檢測(cè)對(duì)象主要檢測(cè)對(duì)象) ) 4)4) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液的制備 中國(guó)藥典2005年版BET法要求,將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品用家標(biāo)準(zhǔn)品用BETBET檢查用水溶解后檢查用水溶解后, ,需在旋渦混合器上需在旋渦混合器上混勻混勻1515分鐘分鐘, ,以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合混合3030秒鐘秒鐘.其他國(guó)家的BET法也有類似的要求. 具有兩極活性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布 5)5)內(nèi)毒素的清除方法內(nèi)毒素的清除方法 (1) 沖洗沖洗 (2) 蒸餾 (3) 反滲透反滲透 (4)

10、超濾超濾 (5) 活性炭吸附 6)6) 內(nèi)毒素的滅活方法內(nèi)毒素的滅活方法 (1) (1) 酸酸/ /堿水解堿水解 (2) (2) 氧化氧化(H(H2 2O O2 2) ) (3) (3) 干熱干熱(180 2h(180 2h或或250 30min)250 30min) 2、鱟試劑 1)1)鱟試劑的分類鱟試劑的分類 (1)種類：美洲鱟試劑和中國(guó)鱟試劑； (2)檢測(cè)方法：凝膠法凝膠法和光度法； (3)特異性：普通和特異性鱟試劑。 2)2)鱟試劑的規(guī)格鱟試劑的規(guī)格 (1)單次實(shí)驗(yàn)試劑 (2)多次試驗(yàn)試劑 3)3)鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (1)靈敏度靈敏度 定義：定義：在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定

11、的條件下，能使鱟試在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能使鱟試劑產(chǎn)生陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的最低濃度，單位為劑產(chǎn)生陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的最低濃度，單位為EU/mlEU/ml。常用。常用的鱟試劑的靈敏度有：的鱟試劑的靈敏度有：0.250.25、0.1250.125、0.030.03。 (2)自身凝集：陰性對(duì)照在陰性對(duì)照在3737度度4h4h不產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。不產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。 4)4)鱟試劑的使用鱟試劑的使用 (1)使用前，應(yīng)將鱟試劑置于室溫環(huán)境下使其達(dá)到室溫后再?gòu)?fù)溶使用； (2)復(fù)溶鱟試劑后，應(yīng)避免強(qiáng)烈振動(dòng)產(chǎn)生泡沫； (3)由于鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的不可逆性鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的不可逆性，反應(yīng)過程中必須避免

12、反應(yīng)試管的振動(dòng)造成假陰性； (4)對(duì)鱟試劑有過敏癥者應(yīng)小心使用，小心鱟試劑粉末逸出。 5)5)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理 3、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水） 定義定義 (1)2010(1)2010年藥典，年藥典，BETBET水系指內(nèi)毒素含量小于水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml（用于凝膠法）或（用于凝膠法）或0.005EU/ml0.005EU/ml（用于（用于光度測(cè)定法）且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用的滅菌注光度測(cè)定法）且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用的滅菌注射用水射用水 ； (2)美國(guó)藥典要求的BET水是指與所使用的鱟試劑不發(fā)生反應(yīng)的滅菌注射用水或其它水。

13、4、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和程序 1)1)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) (1)(1)凝膠法；凝膠法； I I、靈敏度復(fù)核試驗(yàn)；、靈敏度復(fù)核試驗(yàn)； II II、干擾實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn) (2)光度法 ； I、標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證； II、干擾實(shí)驗(yàn) 2) 2)檢查法檢查法 (1)凝膠法凝膠法； I、凝膠限量試驗(yàn)?zāi)z限量試驗(yàn)； II、凝膠半限量試驗(yàn) (2)光度法 ； I、動(dòng)態(tài)法（比濁法、比色法）； II、終點(diǎn)法（比濁法、比色法） ； 三、相關(guān)計(jì)算三、相關(guān)計(jì)算 1、內(nèi)毒素限值 2、最大有效稀釋倍數(shù) 3、最低有效濃度 4、樣品稱稀釋過程中加液量的計(jì)算 1、內(nèi)毒素限值 -一般按公式一般按公式 L=K/M L=K/M 來確定。來確定。

14、 A.L A.L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值； B.K B.K為人每公斤體重每小時(shí)可接受的最大內(nèi)毒素為人每公斤體重每小時(shí)可接受的最大內(nèi)毒素劑量，注射劑劑量，注射劑K=5EU/(kgK=5EU/(kg* *h)h) C.M C.M為人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。為人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。人均體重按人均體重按60kg60kg計(jì)算。計(jì)算。 例子例子1 1：注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉，成人最大劑：注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉，成人最大劑量為量為1500mg/1500mg/次。次。 例子例子2 2：注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量為：注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量

15、為2.08.0g2.08.0g，分，分3434次給藥，一日最高劑量不超過次給藥，一日最高劑量不超過12g.12g. 2、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） -供試品供試品MVDMVD按下式計(jì)算：按下式計(jì)算：MVD=cL/MVD=cL/ A.C A.C為供試品濃度，其中當(dāng)為供試品濃度，其中當(dāng)L L以以EU/mlEU/ml表示時(shí)，表示時(shí)，c c為為1.0ml/ml1.0ml/ml； B.M B.M為內(nèi)毒素限值；為內(nèi)毒素限值； C. C.為鱟試劑的靈敏度（凝膠法）或標(biāo)準(zhǔn)曲線為鱟試劑的靈敏度（凝膠法）或標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度（光度法）最低點(diǎn)濃度（光度法）。 例子：如果使用鱟試劑靈敏度為例子：如果使用鱟試劑靈敏度為

16、0.25EU/ml0.25EU/ml，注射，注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉（濃度為用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉（濃度為10mg/ml10mg/ml，L=0.2EU/mgL=0.2EU/mg）的最大有效稀釋倍數(shù)為：）的最大有效稀釋倍數(shù)為： 3、最低有效濃度（MVC） MVC=MVC=/L/L A. A. 為鱟試劑的靈敏度（凝膠法）或標(biāo)準(zhǔn)曲線為鱟試劑的靈敏度（凝膠法）或標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度（光度法）；最低點(diǎn)濃度（光度法）； B.L B.L為內(nèi)毒素限值；為內(nèi)毒素限值； 例子：如果用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉的最低有效濃度為： 4、樣品稀釋過程中加液量的計(jì)算 稀釋過程中，假設(shè)從溶液稀釋

17、過程中，假設(shè)從溶液S S1 1?。ㄈ。╔ X）mlml溶液稀釋溶液稀釋（n n）倍至）倍至S S2 2，加液量為（，加液量為（y y）, ,則滿足則滿足 Y=Y=（n-1n-1）* * x x 例子：如從溶液例子：如從溶液S S1 1取取0.5ml0.5ml稀釋稀釋3.83.8倍至倍至S S2 2, ,則加液則加液量為：量為： Y= Y=（3.8-13.8-1）* * 0.5=1.4 0.5=1.4（mlml）, ,即即0.5ml0.5ml的的S1S1加加1.4ml1.4ml稀釋液即得稀釋液即得S S1 1的的3.83.8倍稀釋液倍稀釋液S S2 2。 5、計(jì)算 A A、20102010版藥典

18、：紫杉醇注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：版藥典：紫杉醇注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查： 取本品，加內(nèi)毒素檢查用水稀釋制成每取本品，加內(nèi)毒素檢查用水稀釋制成每1ml1ml中含中含紫杉醇紫杉醇0.15mg0.15mg或更低濃度，依法檢查每或更低濃度，依法檢查每1mg1mg紫杉醇紫杉醇中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.40EU0.40EU，問應(yīng)該選用靈敏度，問應(yīng)該選用靈敏度為多少的鱟試劑來做檢測(cè)？為多少的鱟試劑來做檢測(cè)？解答：解答： =MVC=MVC* *L=MVCL=MVC* *0.4EU/mg0.4EU/mg 藥典要求：藥典要求：MVC 0.15mg/mlMVC 0.15mg/ml， 則選用鱟試劑靈敏度則

19、選用鱟試劑靈敏度 0.15mg/ml0.15mg/ml* *0.4EU/mg=0.06EU/ml0.4EU/mg=0.06EU/ml B B、注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉細(xì)菌內(nèi)毒素：、注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉細(xì)菌內(nèi)毒素： 取本品，用內(nèi)毒素檢查用水制成每取本品，用內(nèi)毒素檢查用水制成每1ml1ml中含中含0.6mg0.6mg的溶液，依法檢查，每的溶液，依法檢查，每1mg1mg本品中含內(nèi)毒素的本品中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于量應(yīng)小于0.050EU0.050EU，問應(yīng)該選用靈敏度為多少的鱟，問應(yīng)該選用靈敏度為多少的鱟試劑來做檢測(cè)？試劑來做檢測(cè)？解答：解答： =MVC=MVC* *L=MVCL=MVC* *0.05

20、0EU/mg0.050EU/mg 藥典要求：藥典要求：MVC =0.6mg/mlMVC =0.6mg/ml， 則選用鱟試劑靈敏度則選用鱟試劑靈敏度 =0.6mg/ml=0.6mg/ml* *0.050EU/mg=0.03EU/ml0.050EU/mg=0.03EU/ml五、凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)五、凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù) 1、凝膠法BET試驗(yàn)程序 2、試驗(yàn)器具 3、鱟試劑靈敏度復(fù)核 4、干擾初篩試驗(yàn) 5、檢查法 6、實(shí)驗(yàn)相關(guān)知識(shí)及技巧 1、凝膠法BET試驗(yàn)程序 A、試驗(yàn)準(zhǔn)備； B、確定供試品的內(nèi)毒素限值； C、選擇鱟試劑 D、計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)或最低有效濃度； E、鱟試劑靈敏度復(fù)核； F

21、、干擾初篩實(shí)驗(yàn)； G、干擾實(shí)驗(yàn)； H、日常檢測(cè) 2、試驗(yàn)器具器具分類器具分類器具名稱器具名稱稀釋容器稀釋容器無熱原小試管無熱原小試管移液器具移液器具移液槍移液槍(1000ul(1000ul、200ul)200ul)無熱原吸嘴無熱原吸嘴(1000ul(1000ul、200ul)200ul)孵育儀器孵育儀器恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋 混合食品混合食品渦旋混合儀渦旋混合儀其它其它試管架、異丙醇浸泡的無紡布、鑷試管架、異丙醇浸泡的無紡布、鑷子、剪刀、砂輪、標(biāo)記筆、錫箔紙子、剪刀、砂輪、標(biāo)記筆、錫箔紙 1）試驗(yàn)器具的要求及處理； A A、玻璃器皿需經(jīng)除熱原處理，以除去可能存在的、玻璃器皿需經(jīng)除熱原處理，以除去

22、可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后250 250 干烤至少干烤至少30min30min； B B、塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無干、塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無干擾的器械；擾的器械； 2 2）孵育反應(yīng)儀器）孵育反應(yīng)儀器 反應(yīng)溫度的要求（反應(yīng)溫度的要求（37 37 1 1 ） 3、鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn) 1）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?A、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的條件是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求； B、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的操作技能是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求； C、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求； D、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用器具是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求； 2）實(shí)驗(yàn)

23、步驟 A、開啟恒溫儀器預(yù)熱； B、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液的制備； C、鱟試劑的準(zhǔn)備； D、加樣及恒溫反應(yīng)； E、結(jié)果判斷； F、數(shù)據(jù)處理。 3）操作步驟示意圖 內(nèi)毒素毒素RSE和CSEBET水復(fù)溶混勻稀釋為2、0.5、 0.25內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液旋渦混合器混合15分鐘鱟試劑TALBET水復(fù)溶混勻單次管：原安瓿多次管：反應(yīng)試管輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合30秒0.1mlTAL+0.1mlCSE（RSE），平行4管NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管371,602min結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)1800陽(yáng)性（+）：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性（-）：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實(shí)

24、驗(yàn)有效：NC管全部呈陰性（- -） 2.0管全部呈陽(yáng)性（+ + + +） 0.25管全部呈陰性（- - - -）數(shù)據(jù)處理：靈敏度測(cè)定值cantilg(X/4) X：為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg） 鱟試劑靈敏度標(biāo)示值有效： 2c0.5封口，混勻 反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度 4）靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)舉例 A、試劑名稱名稱廠家廠家規(guī)格規(guī)格標(biāo)志效價(jià)標(biāo)志效價(jià)數(shù)量數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml18支CSE安度斯10EU/支10EU/支1瓶BET水安度斯5ml/瓶0.003EU/ml10瓶B、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的制備3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.6ml

25、1.0ml0.4ml3.0mlBET水CSE3.0ml3.0ml3.0ml15min30s30s30s30s10EU/ml10EU/ml1EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml 0.06EU/ml0.06EU/ml2 21 10.50.50.250.25C、鱟試劑的準(zhǔn)備和加樣0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.06EU/mlD、恒溫反應(yīng)

26、 將加樣完的鱟試劑混合液輕輕搖均（避免產(chǎn)生氣泡），放入37 1的恒溫器中孵育60 2min(孵育過程中避免振動(dòng)影響凝膠形成)。 若恒溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸汽進(jìn)入反應(yīng)管內(nèi)造成污染。E、結(jié)果判斷 陰性陽(yáng)性靈敏度實(shí)驗(yàn)符合要求的基本條件 NC（陰性對(duì)照）管全部為陰性（- - - -） 2全部為陽(yáng)性（+ + + +） 0.25全部為陰性（- - - -）計(jì)算： 按c=antilg(X/4)計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)（最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度）的幾何平均值； 其中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值； 當(dāng)c在0.52時(shí)，靈敏度驗(yàn)證合格。 F、數(shù)據(jù)處理 例子： 計(jì)算：c=antilg(log0.12

27、5)+(log0.25)+(log0.25)+(log0.25)/4=10-0.67731749 =0.210EU/ml0.125,0.5 平行管內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（EU/ml）NC0.5 0.25 0.125 0.061+-2+-3+-4+- 4、干擾初篩試驗(yàn) 1）目的及原理 A、本試驗(yàn)是檢測(cè)樣品與鱟試試劑相容性的篩選試驗(yàn)，通過對(duì)一系列含2內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出對(duì)鱟試驗(yàn)無干擾的濃度； B、本試驗(yàn)可減少干擾實(shí)驗(yàn)的盲目性。 2）實(shí)驗(yàn)步驟 A、供試品限值的確定； B、供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定； C、試劑的選擇； D、反應(yīng)溶液的制備； E、加樣與反應(yīng)； F、結(jié)果判斷。 3

28、）干擾初篩實(shí)驗(yàn)舉例 A、供試品限度； 硫酸慶大霉素（硫酸慶大霉素（S S），），100ml/100ml/瓶，瓶，20000U/ml; 20000U/ml; 藥典要求其限值藥典要求其限值L=0.5EU/1000UL=0.5EU/1000U。 B、最大有效稀釋倍數(shù)的確定（MVD=cL/）;靈敏度（EU/ml） 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03對(duì)應(yīng)的MVD（倍）204080160 320 C、試劑的選擇； 為了方便試驗(yàn)，干擾初篩試驗(yàn)一般選擇靈敏度較低的鱟試劑作為試驗(yàn)；考慮的時(shí)候還要考慮稀釋倍數(shù)，稀釋倍數(shù)越大，試驗(yàn)數(shù)據(jù)越不可靠。 所以本次檢測(cè)選用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑做為檢

29、測(cè)試劑，稀釋倍數(shù)最大為40倍。名稱名稱廠家廠家規(guī)格規(guī)格標(biāo)志效價(jià)標(biāo)志效價(jià)數(shù)量數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24支CSE安度斯10EU/支10EU/支1瓶BET水安度斯5ml/瓶0.003EU/ml10瓶溶液溶液A S4 S8 S16 S32 S40各各2支支溶液溶液B S4E2 S8E2 S16E2 S32E2 S40E2各各2支支溶液溶液C E2 各各2支支溶液溶液D W各各2支支 C、各反應(yīng)溶液的制備； 溶液C的制備 溶液A的制備 1.4ml1.4ml3.2ml0.8ml1.4mlBET水原液1.4ml15min30s30sS S原液原液S S5 5S S1010S S20201.4ml1.4ml30sS S4040溶液B的制備 例