生物制藥(工藝)學(xué)課件：第七章 凝膠層析

1、第七章 凝膠層析層析技術(shù):利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性等）的不同，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中，當(dāng)流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，而達到分離的技術(shù)。 層析技術(shù)操作簡便，樣品可多可少，既可用于實驗室的研究工作，又可用于工業(yè)生產(chǎn)，還可與其他分析儀器配合，組成各種自動分析儀器。層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。自1944年應(yīng)用濾紙

2、作為固定支持物的“紙層析”誕生以來，層析技術(shù)的發(fā)展越來越快。1950年以來，相繼出現(xiàn)了氣相層析，高壓液相層析，薄層層析，薄膜層析，親和層析，凝膠層析等。層析的分類1、按分離相狀態(tài)分類 ： 1） 氣相層析：氣-固層析(GSC)和氣-液層析(GLC)。 2）液相層析：液-固層析(LSC)和液-液層析(LLC)。 3）超臨界層析(SFC)2、按層析的分離機理分類 （1）排阻層析（凝膠層析） （2）離子交換層析 （3）吸附層析 （4）分配層析 （5）親和層析層析技術(shù)的分類 ：凝膠層析（Gel chromatography）：將樣品化合物通過一定孔徑的凝膠固定相，利用流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組份得

3、以分離的層析（色譜）方法。常出現(xiàn)多種名稱 ：如凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透等。凝膠過濾 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959)分子篩層析（molecular sieve chromatography） (Hjertn, Mosbach, 1962)排阻層析 （exclusion chromatography）(Pedersen, 1962)指混合物隨流動相經(jīng)固定相的層析柱時，混合物中各組份按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。 凝膠層析的基本原理凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)凝膠層析的實驗條件和操作凝膠層析的應(yīng)用主要內(nèi)容：色譜峰變寬的問題第一節(jié) 凝膠層析的基本原理

4、一、分離原理 凝膠層析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開： 4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；凝膠層析的基本原理相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內(nèi)擴散到膠粒孔隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流程增長，移動速率慢而最后流出層析柱。中等大小的

5、分子，它們也能在部分凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。三種理論1、平衡排除理論 當(dāng)溶質(zhì)層流過一個填料顆料這段距離時，溶質(zhì)分子已多次進出于填料的孔，達到平衡。 平衡條件是在流速很小時的一個極端情況。 在分離過程中起主要作用。2、擴散分離理論 認為溶質(zhì)分子在流經(jīng)色譜柱的過程中，在流動相和固定相之間沒有達到平衡，存在著流速依賴性。聚苯乙烯和苯乙烯樣品淋出曲線的流速依賴性1流速為0.65ml/min；2流速為2.0ml/min溶劑為甲苯。203、流動分離理論 紅細胞在毛血細管中流動時比血漿流得快。 較大的分子較先通過或繞過這個填料顆粒，使溶質(zhì)能按其大小進行分離。

6、只有在流速很高時才起作用內(nèi)水體積Vi外水體積Vo柱床體積Vt洗脫體積VeVt=Vo+Vi+Vg =R2hVe=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/VV0：外水體積。 V0等于被完全排阻的大分子的洗脫體積?？梢杂靡粋€已知相對分子質(zhì)量遠超過凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍色葡聚糖-2000溶液通過柱床，即可測出柱床的外水體積Vo。Vi：內(nèi)水體積。可由gWr求得（g為干凝膠質(zhì)量，g，Wr為凝膠吸水量，以mL/g表示）。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(zhì)（如重鉻酸鉀）的洗脫體積Ve計算，即 VeV0V 對某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積 Ve 、V0 和Vi 之間的關(guān)系可用下式表示： V

7、e V0 Kd Vi 式中 Ve 為洗脫體積，它包括自加入樣品時算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時所流出的體積。 Kd為每個溶質(zhì)分子在流動相和固定相之間的一個特定的分配系數(shù)，它只與被分離物質(zhì)分子大小和凝膠顆粒內(nèi)孔隙大小分布有關(guān)。Kd可通過實驗由 Ve 、 V0 和 Vi 求得。 當(dāng)Kd=0時，Ve=V0 ，說明這種溶質(zhì)相對分子質(zhì)量大，完全不能進入凝膠顆粒微孔內(nèi)，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來。當(dāng)Kd=1時，Ve=V0+Vi ，說明這種溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量小，完全向凝膠顆粒內(nèi)擴散，在洗脫過程中將最后流出柱外。當(dāng)0Kdl時，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴散，Kd愈大，進入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大。A：

8、Kd=0B：0Kd1C：Kd=1凝膠層析柱洗脫的三部分示意圖26物質(zhì)的Kd值（p202表7-1）對一定種類規(guī)格的凝膠，物質(zhì)的Kd值為該物質(zhì)的特征常數(shù)。不同型號葡聚糖凝膠柱床參數(shù)型號VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G-10017610G-二、凝膠層析的特點凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單。分離效果較好，重復(fù)性高；樣品回收率高，接近100。分離條件緩和。應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，分離的分子量范圍也很寬。對分子量相近物質(zhì)分辨率不高，分離操作較慢。 （流速、粘度、非特異吸附）第二節(jié) 常用凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 凝膠層析法常用的凝膠有天然

9、凝膠（如瓊脂粉凝膠）和人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）。 30一、葡聚糖凝膠 (Sephadex)二、修飾葡聚糖凝膠 (Modified Sephadex)三、聚丙烯酰胺凝膠 （Bio-Gel P）四、瓊脂糖類凝膠 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas)六、疏水性凝膠（hydrophobic gels） 一、葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中最常用的凝膠。1959年P(guān)orath和Flodin合成（商品名為Sephadex）G類最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是-1,6-糖苷鍵（約占95%

10、），分枝為1,3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑將鏈狀結(jié)構(gòu)連接為三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OClCH2CHCH21、結(jié)構(gòu)交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu) 2、規(guī)格型號網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大 。G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表持水量。如G-25表示1g干膠持水2.5mL，G-100表示 1g干膠持水10mL。Sephadex G主要規(guī)格和分離范圍(p204-205 表7-3）34Sephadex G編號意義： 1、吸液量； 2、溶漲時間； 3、凝膠孔徑；

11、4、分離范圍 蛋白質(zhì)、多糖35葡聚糖凝膠性能與編號的關(guān)系編號交聯(lián)度吸液量膨脹速度凝膠孔徑分離限凝膠強度（ Sephadex G-150 ）小大慢大大?。?Sephadex G- 50 ）大小快小小大1、Sephadex在水、鹽、堿、弱酸以及有機溶液中都比較穩(wěn)定，可以多次重復(fù)使用。 2、穩(wěn)定工作pH為2-10，強酸溶液和氧化劑會使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂。 3、在高溫下穩(wěn)定，可煮沸消毒，在100下40 min對凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒有明顯的影響。3、性質(zhì)4、含有少量羧基，呈弱酸性，對陽離子有輕微吸附作用。但一般在離子強度大于0.02mol/L時，幾乎沒有吸附作用。5、對蛋白質(zhì)等有非特異性吸附（用牛血清

12、蛋白等飽和）。6、對芳香族、雜環(huán)化合物表現(xiàn)出滯留現(xiàn)象（環(huán)狀結(jié)構(gòu)） 。7、機械穩(wěn)定性相對較差，不耐壓，分辨率高的細顆粒要求流速較慢，所以不能實現(xiàn)快速而高效的分離。4、保存1）濕法 （防腐劑：0.02%疊氮化鈉， 0.02%三氯叔丁醇，20%乙醇，洗必泰，硫柳汞，醋酸苯汞等。）2）干法 （用濃度逐漸升高的乙醇分步處理，再60-80干燥，膨化的凝膠不能直接高溫烘干）3）半縮法 （60-70%乙醇使之部分脫水）二、修飾葡聚糖凝膠 1、親脂性葡聚糖凝膠 在其骨架上引入一些有機基團（甲基、羥丙基等），既親脂又親水，可在多種有機溶劑中膨脹。用于有機溶劑的凝膠過濾，尤其適用于嗜脂性分子及制備各種天然產(chǎn)物；結(jié)合

13、凝膠過濾、分配色譜及吸附層析的特點，能 分離結(jié)構(gòu)非常相近的分子；排阻極性與原母體凝膠相同，分離效果優(yōu)良，負載量可達200mg樣品/ml凝膠2、交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 在G類凝膠上引入一些酸性或堿性基團后，則制得各種葡聚糖凝膠離子交換劑 。具有離子交換和分子篩雙重作用。3、Superdex系凝膠 由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成的復(fù)合凝膠。將交聯(lián)葡聚糖的優(yōu)良過濾選擇性及交聯(lián)瓊脂糖的物理化學(xué)穩(wěn)定性集于一身，成為具有優(yōu)良選擇性及高分辨率的產(chǎn)品。4、Sephacryl系凝膠 由丙烯烷基葡聚糖經(jīng)甲叉雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成。 理化性質(zhì)穩(wěn)定，可分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖、病毒顆粒等。42三、聚丙烯酰胺凝膠

14、 商品名為生物凝膠-P（Bio-Gel P）。該凝膠由丙烯酰胺組成；以亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑。特點： 1、孔徑可調(diào)； 2、穩(wěn)定性好、機械強度好； 3、無非特異吸附，保存方便； 4、編號反映出它的分離界限。 在聚丙烯酰胺凝膠的合成過程中，單體和交聯(lián)劑的配比可以任意改變。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，交聯(lián)度越小，則網(wǎng)孔越大。 聚丙烯酰胺凝膠全是由碳一碳骨架構(gòu)成，穩(wěn)定性較好，適合于做凝膠層析的載體。只有在極端pH條件下酰胺鍵才被水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團，故一般只在pH211的范圍內(nèi)使用。 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示

15、，從Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以1000即相當(dāng)于排阻限度（按球蛋白或肽計算）。目前，美國Bio-Rad Laboratories生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的Bio-Gel P。45聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì) 生物凝膠的編號反映出它的分離界限。如Bio-Gel P-100。46四、瓊脂糖類凝膠 （Sepharose ） （一）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)是由-D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖以-1，3-和-1，4-糖苷鍵相間連接而成的鏈狀分子。Sepharose 瓊脂糖凝膠（agarose gel）可以分離葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區(qū)間擴大到大分

16、子和病毒顆粒，其最大范圍可達相對分子質(zhì)量108，但是由于瓊脂有強烈的吸附作用，給使用造成了困難，后來，從瓊脂中分離出兩個組分，一個組分為帶負電荷的瓊脂果膠，含有磺酸基和羧基；另一組分叫瓊脂糖，它不含有帶電基團，其結(jié)構(gòu)是有-D-吡喃半乳糖和3，6脫水-L-吡喃半乳糖相結(jié)合的鏈狀多糖。這種瓊脂糖被用來進行凝膠層析，它既具有瓊脂凝膠相同的分離區(qū)間，又沒有吸附作用。但其穩(wěn)定性遠不如葡聚糖凝膠和生物膠P，強酸強堿能引起結(jié)構(gòu)破壞。最好使用條件控制在pH 49之間，溫度040，超出此范圍,可能被破壞。49瓊脂糖凝膠特點：1、沒有共價鍵的交聯(lián)。2、孔徑依賴于瓊脂糖的濃度。3、瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性較差。4、非

17、特異性吸附力低。5、分離范圍大。6、顆粒強度差。 瓊脂糖的商品名稱有: Sepharose(瑞典) Bio-gel A(美國) Segavac(英國) Gelarose(丹麥)等多種，因生產(chǎn)廠家不同名稱各異。 瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠。它的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異。 瑞典的商品名稱為Sepharose，有3種型號，即Sepharose 2B，4B和6B（同中國相同）。阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。 美國的BioGA，有6個型號，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以106表示排阻限度。 。 英國的稱為Sagavac，又分為Sagav

18、ac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分數(shù)，F(xiàn)代表粉末狀，C代表顆粒狀。 丹麥的稱為Gelarose，有5種類型，即2，4，6%，8和10。 53（二）架橋瓊脂糖凝膠（Sepharose CL） 架橋瓊脂糖凝膠為瓊脂線性分子經(jīng)1,3-二溴丙醇交聯(lián)的凝膠。它的凝膠孔徑均勻，機械強度明顯加大。對熱和化學(xué)物質(zhì)的穩(wěn)定性大大增加,在pH314范圍內(nèi)穩(wěn)定。 54（三）超膠（Utro-gel ACA）所謂超膠是瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠。商品名稱后面的編號為兩位數(shù)，各表示混合膠中聚丙烯酰胺與瓊脂糖的百分濃度。55 （四） Superose系

19、凝膠 是由珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián)制得的可用于HPLC的高速凝膠過濾介質(zhì)。大大提高了理化穩(wěn)定性。有6%和12%兩個規(guī)格。56五、多孔玻璃微球(Bio-glas)特點：1、化學(xué)穩(wěn)定性高、強度大。 2、對糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附作用（硅羥基） ：聚乙烯二醇浸泡鈍化。 3、編號表示其孔徑，越大，分離分子量也越大。57六、疏水性凝膠（hydrophobic gels）常見的有：聚甲基丙烯酸酯凝膠和聚苯乙烯凝膠。聚苯乙烯凝膠有 Styragel和Bio-Bead S，專門分離不溶水的有機物質(zhì)。Styragel商品, 分離范圍為1 6004.0107。生物珠（Bio-Bead S），適于分離分子量較小的物質(zhì)（

20、m2700）。58一、凝膠的選擇和處理 二、凝膠層析柱的設(shè)計和制備 三、凝膠層析操作 四、主要參數(shù)測算 五、凝膠層析的某些擴展第三節(jié) 凝膠層析的實驗條件和操作 凝膠種類、型號、粒度。凝膠的性質(zhì)：分離范圍（滲入限與排阻限）、理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等。分離目的和樣品的性質(zhì)。一、凝膠的選擇與處理 1、凝膠的選擇1）類分離（組分離）： 將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類。2）分級分離： 將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白。 生物樣品的兩種分離形式：1）類分離目的：分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相近的組

21、分。凝膠選擇：使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。 大分子：Kd=0（全排阻） 小分子：Kd=1（全滲入）從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽蛋白質(zhì)的分子量5000D， 無機鹽的分子量：幾十到幾百之間。Sephadex G-25凝膠分離范圍：10005000D 被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。 大分子組（蛋白質(zhì)）：全排阻 小分子組（無機鹽）：全滲入。分子量小于5000D的肽類選用Sephadex G-15凝膠。目的：分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。凝膠選擇：使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大些。2組分樣品：分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。

22、決不能都分布在凝膠分離范圍的一側(cè)，即Kd不要都接近于0或1。3組分樣品：最好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，第三個為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1/3。2）分級分離 G不同分離范圍的葡聚糖凝膠上血清蛋白的層析圖同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脫效果2、凝膠粒度的選擇 凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細和超細四類。顆粒越細，分離效果越好，因為它容易達到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平變寬。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70m左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應(yīng)在150m左右。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定

23、，效果較好。1、干膠過篩2、濕膠懸浮凝膠顆粒均一化處理方法塔板理論-柱分離效能指標(biāo) 將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）。 色譜柱長：L， 理論塔板高度（HETP)：H， 理論塔板數(shù)：n， 則三者的關(guān)系為： n = L / H3、凝膠的預(yù)處理使用前須溶漲，使干膠顆粒充分吸收溶劑，并達到平衡。干膠以10倍以上吸液量的溶劑浸泡。熱法溶漲(水浴中加熱溶脹)。1、層析柱的選擇選柱：有效體積、柱比。 依據(jù)樣品數(shù)量、性質(zhì)以及分離目的。 柱比：類分離：510； 分級分離：25100, 脫鹽柱：高50cm為宜；分級分離100cm足夠。 下

24、部支撐物：不易阻塞，死腔小（填充小玻珠）二、凝膠層析柱的設(shè)計和制備 層析柱通常是玻璃的。總的說來，長柱分辨好。但大量物質(zhì)的處理則用粗的柱比較適宜。層析柱的基本裝置如圖。72不同規(guī)格凝膠柱床所需Sephadex G凝膠量2、凝膠柱的填裝裝柱示意圖75常用的支持物有棉花、玻璃纖維、玻璃珠、垂熔玻璃等（不漏不堵）。減少“死體積”。消除“管壁效應(yīng)”。(1%二甲基二氯硅烷苯溶液）空柱中應(yīng)留約1/5的水或溶劑。不斷攪拌下使膠粒均勻沉降，使不發(fā)生凝膠分層和膠面傾斜。注意事項1）除去氣泡的溶脹凝膠應(yīng)與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度也要恒定。2）應(yīng)調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當(dāng)稀釋有利于裝柱過程中氣泡的

25、排除。3）將柱子固定在穩(wěn)定的支架上，并保證其垂直。4）先向柱內(nèi)加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要捧除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的20。 5）柱頂接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注人柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)生氣泡。 6）柱裝好后，停10min，然后打開出液口，排出過量洗脫劑。 7）柱內(nèi)膠面上部保留23cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍住體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來。 8）調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，得到理想流速（可以使用蠕動泵控制）。檢查流體靜力壓，不要超過規(guī)數(shù)值。 層析柱（a）自制簡易層祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3

26、尼龍網(wǎng)）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進出口；2.多孔底板；3柱床；4恒溫水進口；5恒溫水出口；6可調(diào)節(jié)的塞子） 層析系統(tǒng)連接示意圖 1密封橡皮塞；2恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5可調(diào)蜾旋夾；6.自動收集器； 7.核酸一蛋白質(zhì)檢測儀返回833、凝膠床的檢查和維護觀察有無凝膠分層、溝流和氣泡等現(xiàn)象。有色物質(zhì)溶液過柱，觀察柱床有無溝流，色帶是否平整。 檢查物質(zhì)為藍色葡聚糖： 平均分子質(zhì)量為2106Da，在265nm及630nm處都有吸收峰。既檢查了裝柱質(zhì)量也測定了V0。84操作壓 層析柱由于進出口之間液位壓力差形成的對凝膠顆粒的壓力稱作“操作壓”。 操作壓力太大，會使凝

27、膠床壓得太實，從而降低流速。85層析床橫截面所允許的最大壓力 三、凝膠層析操作1、樣品和加樣3種加樣方法： 1）直接將樣品加到層析床表面：盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動。 2）利用兩種液體比重不同而分層的原理，將高比重樣品加入床表面低比重的洗脫液之中，樣品就慢慢均勻地下沉于床表面，再打開出口，使樣品滲入層析。 3）用微量泵控制。 注意事項：粘度小于0.01Pas （帕斯卡秒）。蛋白質(zhì)類樣品濃度:不大于4%。理想的樣品色帶應(yīng)是狹窄且平直的矩形色譜帶。減少樣品稀釋，非平流流經(jīng)凝膠層析床體。加樣時盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動。渾濁樣品應(yīng)先除去顆粒后再上柱。加樣體積：樣品與柱床體積比例懸殊時

28、分離效果好（設(shè)備和器材浪費，工作效率降低，樣品稀釋） 分析（ 1-2mL/100mL床體積） 制備（20-30mL/100mL床體積）黏度是流體抗拒流動的程度，是流體分子間相互吸引而產(chǎn)生阻礙分子間相對運動能力的量度，即流體流動的內(nèi)部阻力。物質(zhì)在外力作用下，液層發(fā)生位移，分子間產(chǎn)生摩擦，對摩擦所表現(xiàn)的抵抗性稱為絕對黏度，簡稱黏度，黏度的國際單位制單位為帕斯卡秒（Pas）。相對黏度指液體的黏度與同溫度水的黏度比值。 樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2 000，使終濃度為5%，相對粘度0.118;（2）加葡萄糖2 000，使終濃度為2.5%，相對粘度0.042; （3）加葡萄糖2 000，使終

29、濃度為1% ，相對粘度0.010。 912、洗脫與收集1）洗脫液（成分不改變） 通常用水 防治蛋白沉淀和變性：緩沖鹽溶液（離子濃度至少0.02mol/L：氨水、醋酸、甲酸銨等易發(fā)揮） 吸附性較強物質(zhì)：水和有機溶劑混合物（如水-甲醇，水-丙酮等）2）流速（操作壓、型號、顆粒）保持一定的操作壓，不超限。編號小的葡聚糖凝膠，以及顆粒粗的凝膠流速大；編號大的，粒度細的流速慢。在一定范圍內(nèi)，操作壓加大，流速加快。流速（V）與操作壓（P）成正比，與柱長（L）成反比： V= K P/L 流速對洗脫曲線的影響 流速較低，分辨率較高，樣品稀釋較輕。幾種葡聚糖凝膠拄床承受壓力圖 而對于強度差的凝膠，符合以上公式壓

30、力范圍很小。進一步加大壓力時，由于凝膠顆粒變形流速反而降低。 各種層析柱裝置的操作壓（或靜水壓）（a）（b）操作壓等于柱或貯液器內(nèi)液面和出水接管末端的高度差；（c）（d）壓力的大小是由恒壓瓶內(nèi)空氣入口管的底部至出口接管末端的高度計算。向下（c）或向上（d）移動出水管無關(guān)緊要 凝膠層析恒壓加液裝置 蠕動泵（恒流泵）3）恒溫范圍（410） 溫度變化干擾分離、降低分辨率；防止蛋白變性。4）采用分部收集器收集。 計時、記滴 BS100自動部分收集器安裝圖1反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報警板；9.試管；10收集盤；11.時間選揮旋鈕；12.時間選擇固定螺

31、釘；13自動開關(guān)；14、指示燈；15.電源開關(guān)；16換向開關(guān)（逆、順）；17手動開關(guān)部分收集器核酸蛋白檢測儀及記錄儀核酸蛋白檢測儀返回記錄儀返回3、凝膠柱的再生流速下降、柱板結(jié) 反沖、重新裝柱污染 漂洗（稀酸、稀堿、其他溶劑）四、主要參數(shù)計算V0及Vi的測算Kd及Kav的值分辨率R1051、V0及Vi的測算1重量法 Vt=Vo+Vi+Vg =/4d2h Vi=gWr Vo=Vt（Vi+Vg） Vg估算為1cm3/g干膠。2過柱法 已知物質(zhì)的洗脫體積 Ve=Vo+KdVi 如用全滲入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物質(zhì)過柱，測量其洗脫體積，計算該凝膠柱的V0值及Vi值。常用藍色葡聚糖（Kd=0

32、）及重鉻酸鉀（Kd=1）。1062、分配系數(shù)測定分配系數(shù)當(dāng)測得某物質(zhì)的Ve及Vt ，內(nèi)水體積Vi及外水體積V0時，算出Kd及Kav的值。Kd、Kav及Ve被認為是一種組分對于某一個凝膠柱的特征常數(shù)。判斷各組分的分離情況、測定分子量、預(yù)測放大柱床后的洗脫體積。3、分辨率凝膠層析中，兩物質(zhì)（A和B）和分辨率（R）定義為： VeA=Vo+KdAViVeB=Vo+KdBVi提高分辨率的方法只有增大Ve或減小兩物質(zhì)洗脫峰的體積。當(dāng)R值1，兩物質(zhì)完全分開，小于1時則不能完全分離。分離時較大柱床體積可增大Ve 。減少（WA+WB）的方法是適當(dāng)濃縮樣品（黏度增大）、選用小粒度凝膠、流速適當(dāng)減慢等。五、凝膠層析

33、的擴展 （一）上行凝膠層析 利用流動和重力方向相反的上行層析法，即洗脫液向上流動的層析法。 反轉(zhuǎn)柱 。（二）增加有效床高 -提高分辨率 （1）串聯(lián)層析 ：有效柱長 （2）循環(huán)層析：即在同一根或兩根柱上，樣品反復(fù)進行層析。（自動分析裝置）循環(huán)層析人血漿藍蛋白的循環(huán)層析分離（三）薄層凝膠層析 用交聯(lián)葡聚糖作為薄層層析的支撐載體，稱“薄層凝膠層析”。 僅適用于分析 。特點：生化分析；設(shè)備簡單，操作方便，分離迅速；分辨率高；同一薄板可同時分析數(shù)個樣品。112第四節(jié) 色譜峰變寬的問題 樣品的洗脫曲線不是一個窄的矩形峰，而是一個較寬的高斯峰。洗脫曲線： 樣品的分子量分布， 儀器造成的峰加寬效應(yīng)。 113一、峰寬的表示方法W是峰寬，它是通過曲線的兩個拐點的切線和基線交點之間的距離。拐點之間的距離等于2，稱為峰的標(biāo)準(zhǔn)偏差。是衡量峰的寬度的量。 W=4 114二、溶液通過色譜柱造成的峰加寬Giddings提出的無規(guī)則行走模型。溶質(zhì)分子本身的運動是無規(guī)則的。（一）分子擴散（二）渦流擴散（三）流動相中傳質(zhì)阻力（三）固定相中傳質(zhì)阻力色譜柱內(nèi)造成的峰加寬填充介質(zhì)粒度越小,峰加寬效應(yīng)越小。溶液在柱外產(chǎn)生的峰加寬 （一）連接管路 當(dāng)液體流經(jīng)細管時，徑向速度梯度使矩形溶液脈沖變成拋物面形，并導(dǎo)致濃度的徑向梯度。 減小管徑 （二）檢測池 體積小，忽略不計分離效果分離度 分離效果