四-目的基因的檢測與表達(dá)產(chǎn)物的測定分析42頁P(yáng)PT課件

1、基因工程的基本操作程序第二節(jié)四 目的基因的檢測與表達(dá)產(chǎn)物的測定基因工程的概念 基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。目的基因供體細(xì)胞受體細(xì)胞獲得新性狀基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定為什么非要有載體和目的基因一同進(jìn)入受體細(xì)胞呢？ 研究發(fā)現(xiàn)，單個基因或DNA片段導(dǎo)入另一生物體的細(xì)胞后，往往會被細(xì)胞內(nèi)的防御系統(tǒng)消滅掉，這樣就大大降低了目的基因的表達(dá)效率；如果把目的基因包裝一下，就很容易逃

2、過受體細(xì)胞的防御系統(tǒng)，免遭“滅頂之災(zāi)”。 基因工程：把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。前面三個步驟完成后，在全部的受體細(xì)胞中，真正能夠攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞是很少的。因此，必須通過一定的手段對受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因進(jìn)行檢測。 檢測的方法有很多種，例如，大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因，當(dāng)這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒，并被轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，就可以根據(jù)受體細(xì)胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細(xì)胞是否獲得了目的基因。重組DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞后，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)過程。 標(biāo)記

3、基因的作用在于便于檢測目的基因的情況。因為標(biāo)記基因和目的基因同位于運(yùn)載體上，要導(dǎo)入都導(dǎo)入，要表達(dá)則都會表達(dá)。一般標(biāo)記基因的DNA序列是已知的，若選用抗氨芐青霉素基因，則可在目的基因?qū)牒笥冒逼S青霉素來處理受體細(xì)胞，若無異常，則抗氨芐青霉素已合成，說明基因已得到表達(dá)。標(biāo)記基因 目的基因 啟動子 終止子 復(fù)制原點2.基因表達(dá)載體的組成基因工程的概念 把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。目的基因的獲得供體細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞獲得新性狀篩選含有目的基因的受體細(xì)胞目的基因在受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)1.檢

4、測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。DNA分子雜交檢測方法是：采用DNA分子雜交技術(shù)。先將轉(zhuǎn)基因生物的基因組提取出來；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作標(biāo)記做成探針；使探針與基因組DNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。 兩種生物的互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈。即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行。因此，當(dāng)用探針與轉(zhuǎn)基因生物的目的基因雜交時，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置能看到），則說明目的基因已經(jīng)插入受體細(xì)胞的染色體DNA中?；蛱结槪菏且恍《螁捂湹腄NA或RNA,帶有

5、放射性同位素標(biāo)記，并能與目的基因的一條鏈堿基互補(bǔ)配對2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步。分子雜交采用DNA與RNA分子雜交技術(shù)。從轉(zhuǎn)基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作標(biāo)記做成探針；使探針與mRNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體（對抗進(jìn)行同位素標(biāo)記）進(jìn)行抗原抗體雜交；如果出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 如：一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后，是否具有了抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的接種實驗，觀察害

6、蟲的存活情況或植物的患病情況以確定是否具有抗性及抗性的程度。 又如：有的基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的功能中否與天然產(chǎn)品相同，甚至超過天然產(chǎn)品。2.形態(tài)檢測:檢測轉(zhuǎn)基因生物是否表達(dá)出相應(yīng)的性狀 目標(biāo)性狀或標(biāo)記基因的性狀1.分子檢測2.形態(tài)檢測:檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測轉(zhuǎn)基因生物是否表達(dá)出相應(yīng)的性狀 目標(biāo)性狀或標(biāo)記基因的性狀DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交 目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功歸納步驟檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因DNA與DNA雜交檢測目的

7、基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNADNA與RNA雜交檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交檢測抗蟲棉是否翻譯出毒蛋白：從蘇云金芽孢桿菌中提取毒蛋白，注入某種動物體內(nèi)，從動物的血清中分離出相應(yīng)的抗體，并用熒光標(biāo)記該抗體，然后用標(biāo)記的抗體與抗蟲棉的細(xì)胞提取液混合，如出現(xiàn)雜交帶，則表明抗蟲基因已經(jīng)在棉花細(xì)胞中表達(dá)。歸納: 基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR技術(shù)人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法、基因槍法；顯微注射法；氯化鈣法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯、個體水平的檢測1.利用大腸桿菌可以生

8、產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。2.-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？思考與探究（2019福建）32現(xiàn)代生物科技專題肺細(xì)胞中的let-7基因表達(dá)減弱，癌基因RAS表達(dá)增強(qiáng)，

9、會引發(fā)肺癌。研究人員利用基因工程技術(shù)將let-7基因?qū)敕伟┘?xì)胞實現(xiàn)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的增殖受到抑制。該基因工程技術(shù)基本流程如圖。（）進(jìn)行過程時，需用 _ 酶切開載體以插入let-7基因。載體應(yīng)有RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，以驅(qū)動let-7基因轉(zhuǎn)錄，該部位稱為 。限制性核酸內(nèi)切酶（或限制） _ 啟動子 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（2019福建） 32現(xiàn)代生物科技專題 肺細(xì)胞中的let-7基因表達(dá)減弱，癌基因RAS表達(dá)增強(qiáng)，會引發(fā)肺癌。研究人員利用基因工程技術(shù)將l

10、et-7基因?qū)敕伟┘?xì)胞實驗表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的增殖受到抑制。該基因工程技術(shù)基本流程如圖。（）進(jìn)行過程時，需用 酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞，以利于傳代培養(yǎng)。胰蛋白 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（）研究發(fā)現(xiàn)，let-7基因能影響癌基因RAS的表達(dá)，其影響機(jī)理如圖。據(jù)圖分析，可從細(xì)胞中提取 進(jìn)行分子雜交，以直接檢測let-7基因是否轉(zhuǎn)錄。肺癌細(xì)胞增殖受到抑制，可能是由于細(xì)胞 （RASmRNA/RAS蛋白）含量減少引起的。RNA RAS蛋白 “漢水丑生的生物同行”超級群

11、大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（5）基因工程中除質(zhì)粒外，和 也可作為運(yùn)載體。 （4）反轉(zhuǎn)錄作用的模板是 ，產(chǎn)物是 。若要在體外獲得大量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，常采用技術(shù)。（6）若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，原因是 mRNA（或RNA） cDNA （或DNA） 噬菌體 未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)粒（外源DNA）的能力極弱 PCR 動植物病毒等 （1）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上 抗四環(huán)

12、素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有 四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大 腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如 果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已 進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎 后從中提取-珠蛋白。“漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。30.在培育轉(zhuǎn)基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作為標(biāo)記基因，只有含卡那霉素抗性基

13、因的細(xì)胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長。下圖為獲得抗蟲棉的技術(shù)流程?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。請據(jù)圖回答：（1）A過程需要的酶有_。（2）B過程及其結(jié)果體現(xiàn)了質(zhì)粒作為運(yùn)載體必須具備的兩個條件是 ?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶 具有標(biāo)記基因；能在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存 “漢水丑生

14、的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。“漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（3）C過程的培養(yǎng)基除含有必要營養(yǎng)物質(zhì)、瓊脂和激素外，還必須加入_。（4）如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進(jìn)行檢測，D過程應(yīng)該用 作為探針。 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修

15、改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記?？敲顾?放射性同位素（或熒光分子）標(biāo)記的抗蟲基因 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（5）科學(xué)家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。將轉(zhuǎn)基因植株與_雜交，其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為1：1。非轉(zhuǎn)基因植株 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019

16、年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（5）科學(xué)家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。若該轉(zhuǎn)基因植株自交，則其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為_。 3:1 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（5）科學(xué)家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。若將該轉(zhuǎn)基因植株的花藥在卡那霉素培養(yǎng)基上作離體培養(yǎng)，則獲得的再生植株群體中抗卡那霉素型植株占_%。100 練習(xí)1：(2019理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三

17、角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所 用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處， DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）aa練習(xí)1：(2019理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化法和 法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放 射性同位素標(biāo)記的 作探針進(jìn)行分子雜交檢 測，又要用 方 法從個體水平鑒

18、定水稻植株的耐鹽性。基因槍/花粉管通道法植物組織培養(yǎng)耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）3.下圖為采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)AFB1解毒酶的流程圖據(jù)圖回答問題： 在甲、乙條件下培養(yǎng)含AFB1解毒酶基因的菌株經(jīng)測定甲菌液細(xì)胞密度小、細(xì)胞含解毒酶：乙菌液細(xì)胞密度大、細(xì)胞不含解毒酶過程l 應(yīng)選擇_菌液的細(xì)胞提取總RNA ，理由是_ 過程中，根據(jù)圖示，可以看出與引物結(jié)合的模版是_ 檢測酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，應(yīng)采用_方法。甲甲菌液細(xì)胞的AFB1基因的表達(dá)已轉(zhuǎn)錄形成mRNA，而在已菌夜細(xì)胞中該基因未轉(zhuǎn)錄AFB1解毒酶基因的cDNA抗原-抗體雜交“漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年

19、高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（2019江蘇）27、下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：（1）一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma切割前后，分別含有_個游離的磷酸基團(tuán)。（2）若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的Sma酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越 _。（3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Srna切割，原因是_。（4）與只使用EcoR I相比較，使用BamH和Hind 兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止_。0、2高 Sma會破壞質(zhì)

20、粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化（5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入_酶。（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了 _。（7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在_的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達(dá)的初步檢測。DNA連接鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì)（2019重慶）31.（16分）擬南芥是遺傳學(xué)研究的模式植物，某突變體可用于驗證相關(guān)的基因的功能。野生型擬南芥的種皮為深褐色（TT），某突變體的種皮為黃色（tt）,下圖是利用該突變體驗證油菜種

21、皮顏色基因(Tn)功能的流程示意圖。 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（1）與擬南芥t基因的mRNA相比，若油菜Tn基因的mRNA中UGA變?yōu)?，其末端序列成為“”，則Tn比多編碼個氨基酸（起始密碼子位置相同，、為終止密碼子）。（2）圖中應(yīng)為 。若不能在含抗生素Kan的培養(yǎng)基上生長，則原因是 。若的種皮顏色為 ，則說明油菜Tn基因與擬南芥T基因的功能相同。2重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒未導(dǎo)入 深褐色 （3）假設(shè)該油菜Tn基因連接到擬南芥染色體并替換其中一個t基因，

22、則中進(jìn)行減數(shù)分裂的細(xì)胞在聯(lián)會時的基因型為_ ；同時，的葉片卷曲（葉片正常對葉片卷曲為顯性，且與種皮性狀獨立遺傳），用它與種皮深褐色、葉片正常的雙雜合體擬南芥雜交，其后代中所占比列最小的個體表現(xiàn)_ 取的莖尖培養(yǎng)成16顆植珠，其性狀通常_（填 “不變”或“改變”）。（4）所得的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥_（填“是”或者“不是”）同一個物種。TnTnt t 黃色正常、 黃色卷曲 不變 是 （2019山東）35【生物現(xiàn)代生物科技專題】人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型常用于致病機(jī)理的探討及治療藥物的篩選。利用正常大鼠制備遺傳性高血壓轉(zhuǎn)基因模型大鼠的流程如圖所示?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（1）卵母細(xì)胞除從活體輸卵管中采集外，還可以從已處死的雌鼠_中獲取。 （2）圖中的高血壓相關(guān)基因作為 ，質(zhì)粒作為_二者需用 切割后連接成重組載體，該過程與質(zhì)粒上含有 有關(guān)。（3）子代大鼠如果 和_