動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫學(xué) 實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物病原細(xì)菌的分離與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)一動(dòng)物病原細(xì)菌的分離與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈩?dòng)物病原細(xì)菌的分離、鑒定的常規(guī)程序與基本方法二、實(shí)驗(yàn)原理初步分離鑒定：利用細(xì)菌在特定的選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，觀察細(xì)菌培養(yǎng)特征；確定細(xì)菌的血清型、毒力因子：血清學(xué)檢測(cè)或PCR檢測(cè)技術(shù)大腸桿菌的培養(yǎng)特征：37C,培養(yǎng)24h,各種培養(yǎng)基生長(zhǎng)特征：普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板：白色圓形，隆起，中等大小麥康凱瓊脂：紅色、圓形、隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、中等大小糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基：底層變黃，產(chǎn)酸產(chǎn)氣伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：黑色、金屬光澤革蘭氏染色：革蘭氏陰性、分散或成對(duì)排列、兩端鈍圓的短桿菌血清學(xué)鑒定：玻片凝集實(shí)驗(yàn)：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集沉淀。大腸桿菌中， 為了避免

2、K抗原對(duì)O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐熱性高于K抗原，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行、 高壓或煮沸處理。三、實(shí)驗(yàn)材料1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠2）菌株：致病性大腸桿菌菌株3）試劑：營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、CT-SMAC瓊脂、TSI瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、IMViC、 大腸桿菌O157標(biāo)準(zhǔn)血清、生理鹽水、吉姆薩染色液、酒精或棉球。4）儀器：顯微鏡、37C恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、接種棒、剪刀、鑷子、載玻片、記號(hào)筆、 口罩、手套。四、操作步驟分離培養(yǎng)第一天：）處死小鼠，無(wú)菌解剖）觀察各臟器是否出現(xiàn)肉眼病理變化；）無(wú)菌采集內(nèi)臟病料，通過(guò)無(wú)菌操作劃線接種于普通瓊脂平板、改良山梨醇麥康凱（CT-MAC）瓊脂平板各

3、一塊，37C培養(yǎng)24h；）同時(shí)無(wú)菌挑取一小塊病料，直接涂片，吉姆薩染色，油鏡觀察組織中的細(xì)菌特征； 第二天）挑取CT-SMAC典型單個(gè)菌落分別接種于TSI瓊脂斜面、伊紅美藍(lán)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯， 37C培養(yǎng)24h。挑取普通培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行糖類發(fā)酵和IMViC生化實(shí)驗(yàn)。糖（醇）類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：接種兩只葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，麥芽糖發(fā)酵培 養(yǎng)基，一支接種，一支對(duì)照；接好后置于37C溫箱中培養(yǎng)24h。吲哚（Indol）試驗(yàn)：接種到胰蛋白胨水（含色氨酸）培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)24-48h。甲基紅（Methyl red）試驗(yàn)：將菌接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)48h。VP（PVoges-Pro

4、skauer）試驗(yàn)：將菌種接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)48h。硫化氫試驗(yàn)：將菌以接種針穿刺接種到醋酸鉛或檸檬酸鐵氨培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)24h。 檸檬酸鹽試驗(yàn)（Citrate utilization）：取少量菌種接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37C培養(yǎng)24h。第三天1 .觀察現(xiàn)象，滴定檢驗(yàn)吲哚（Indol）試驗(yàn)：沿管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。甲基紅（Methyl red膩驗(yàn)：加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察。VP（PVoges-Proskauer試驗(yàn)：加VP A液6滴，B液2滴，用力振蕩，觀察現(xiàn)象進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，采用玻片凝集試驗(yàn)0血清型鑒定：將生化特征符合大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培

5、養(yǎng)液，置于12 1。高壓2h制高壓抗原;； 然后用大腸桿菌0抗原單因子血清進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，鑒定分離株的。血清型。撥片凝集實(shí)驗(yàn)：取潔凈載玻片一張，用微量加樣器分別取2 5ul。單因子血清加至載玻片內(nèi)，再用微量加 樣器加2 5ul待鑒定的細(xì)菌，將他們充分混勻，將載玻片輕輕搖動(dòng)12分鐘，觀察結(jié)果 并記錄報(bào)告。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果解剖及制片觀察結(jié)果解剖后觀察小鼠腹部，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部臟器沒(méi)有較大的病理變化，但縱切開(kāi)小腸剝?nèi)バ∧c內(nèi) 容物，可見(jiàn)血絲分布在腸壁上。制片觀察：我們組的片子只看到被染成淡紫色的組織細(xì)胞和深紫色的腸內(nèi)內(nèi)容物，內(nèi) 容物有的為團(tuán)狀。但在任何視野中都沒(méi)有找到細(xì)菌。借來(lái)觀察成功的片子來(lái)看，可見(jiàn)清晰的組織

6、與細(xì)菌，背景為淡紫色的小腸 組織，細(xì)菌被染成深紫色，呈長(zhǎng)桿狀，還有螺線狀，球狀三種形態(tài)。猜測(cè)為大腸桿菌。普通培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果：培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿了隆起、白色的菌落，菌落與大腸桿菌的相似。 改良山梨醇麥康凱培養(yǎng)基:整個(gè)培養(yǎng)基是一片紅色，未看到生長(zhǎng)出來(lái)的菌落。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：有綠色金屬光澤菌落。TSI :斜面處培養(yǎng)基為黃色瓶底處培養(yǎng)基為深紅色，表明產(chǎn)酸產(chǎn)氣。糖發(fā)酵結(jié)果：乳糖發(fā)酵管：由紫色變?yōu)樯罴t色蔗糖發(fā)酵管：有淺藍(lán)色變?yōu)闇\黃色麥芽糖發(fā)酵管：由藍(lán)色變?yōu)樯铧S色甘露糖發(fā)酵管：由藍(lán)色變?yōu)樯铧S色葡萄糖發(fā)酵管：由藍(lán)色變?yōu)樯铧S色生化鑒定結(jié)果：吲哚實(shí)驗(yàn)：滴加吲哚試劑后，液面出現(xiàn)紅色，陽(yáng)性甲基紅試驗(yàn)：加甲基紅后，變?yōu)榧t色，

7、陽(yáng)性Korser氏肉湯：無(wú)明顯變化，依然澄清透明，即如果為陰性蛋白胨水培養(yǎng)基：滴加指示劑后，出現(xiàn)紅色，結(jié)果為陽(yáng)性，硫化氫鑒定為陰性 玻片凝集實(shí)驗(yàn):未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象項(xiàng)IMViC伊 紅 美 藍(lán)CT-SMAC乳糖蔗糖麥 芽 糖甘露 糖葡 萄 糖TSI玻 片 凝 集鑒 定 結(jié) 果+-+-六、討論分析蛋白胨水培養(yǎng)基應(yīng)為陰性，而實(shí)驗(yàn)如果卻為陽(yáng)性；撥片凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果 卻為陰性，除此之外，其他均符合大腸桿菌的特性，故可推測(cè)兩個(gè)不符合大腸桿菌特點(diǎn)的是 由于菌太稀的原因，基本斷定為大腸桿菌，但建議用PCR的方法進(jìn)行再次鑒定。七、思考題通過(guò)本次試驗(yàn)是否可以確定引致小鼠死亡的病原菌？答：不能。因?yàn)楸敬卧囼?yàn)結(jié)果并沒(méi)有肯定的結(jié)果，而且之前雖然的CT-SMAC培養(yǎng)基長(zhǎng) 出了大腸桿菌的典型菌落，但是不排除存在其他菌的可能性，及并不能確定大腸