第四組微生物大實驗實驗報告(共10頁)

1、微生物大實驗(shyn)土壤中芽孢桿菌的分離(fnl)及鑒定實驗報告學(xué) 院：生命科學(xué)學(xué)院(xuyun) 專 業(yè)：生物技術(shù)班 級：組 數(shù):學(xué) 號:姓 名:前言(qin yn)芽孢(y bo)桿菌是能形成(xngchng)芽孢 (內(nèi)生孢子)的桿菌。芽孢是休眠體，不是繁殖體。絕大多數(shù)是一個菌體僅形成一個芽孢芽孢位于菌體內(nèi),由核心、皮層、芽孢殼和外壁組成。核心是芽孢的原生質(zhì)體，內(nèi)含DNA、RNA、可能與 DNA相聯(lián)系的特異芽孢蛋白質(zhì)以及合成蛋白質(zhì)和產(chǎn)生能量的系統(tǒng)。芽孢桿菌屬是大的(410um), 革蘭氏陽性，嚴(yán)格需氧或兼性厭氧的有莢膜的桿菌。該屬細(xì)菌的重要特性是能夠產(chǎn)生對不利條件具有特殊抵抗力的芽孢。

2、芽孢桿菌屬可分為以下亞群：多粘芽孢桿菌、枯草桿菌（包括蠟樣桿菌和 HYPERLINK /view/1660828.htm t _blank 地衣芽孢桿菌）、短芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌。芽孢桿菌是一種耐高溫、高壓及低PH值的有益微生物，本實驗從土壤中分離出15株芽孢桿菌，從中挑選出一株芽孢桿菌進(jìn)行生理生化鑒定，以及分子鑒定。通過進(jìn)一步的實驗，了解到其生理生化特點。一、實驗(shyn)目的：掌握芽孢桿菌屬常見種的分離、鑒定方法和技術(shù)。將土壤(trng)樣品中分離的芽孢桿菌屬未知種鑒定到屬。二、實驗(shyn)原理：芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌會失去活性。，

3、因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進(jìn)一步分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。三、實驗儀器材料：1、儀器：顯微鏡、培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、燒杯、移液管、涂布棒、載玻片、接種環(huán)、接種針、試管架、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、電泳儀、PCR儀、提取DNA試劑盒2、材料：培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、孔雀綠溶液、番紅復(fù)染液、NaOH溶液、草酸銨溶液、碘液、乙醇、硝酸鹽、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖四、實驗步驟：（一）、菌種的分離和純化1、取樣2、LB培養(yǎng)基的配制： 1L水、10g蛋白胨、5g牛肉膏、10g Nacl、15g瓊脂、120滅菌30分鐘待用3、平板及斜面的制備4、制備土壤菌懸液：稱取土樣約1g土壤放入盛有9ml無菌

4、水并帶有玻璃珠的三角瓶中，置于搖床上150r/min,振蕩10min。使土樣與水充分混合，使細(xì)胞分散。用一支1ml無菌吸光吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10-1 稀釋液，以此類推制成10-2 ，10-3 .10-6等幾種稀釋度的土壤溶液。5、涂布：用無菌吸管分別(fnbi)吸取每個梯度0.2ml的土壤溶液，準(zhǔn)確(zhnqu)放入PDA平板中，用無菌玻璃(b l)涂棒在培養(yǎng)及表面輕輕地涂布，使溶液分布均勻。室溫下靜置5-10min。6、培養(yǎng)：將平板置于28溫箱培養(yǎng)1-2天。選擇單個菌落挑取少量的菌苔，接種于斜面上。7、純化： 挑取單菌落溶于無菌水中，充分震蕩搖勻，

5、接種于已滅菌的LB培養(yǎng)基的平板上。8、初染：將純化后得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并從中挑選出呈紫色的菌株，純化保種并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及分子鑒定（二）形態(tài)觀察：1、個體形態(tài)特征觀察2、群體形態(tài)特征觀察（三）芽孢桿菌鑒定的生理生化試驗1、好氧性試驗細(xì)菌對氧氣的需求是細(xì)菌鑒定的重要指標(biāo)之一。若在培養(yǎng)基中加入還原劑，如巰基醋酸鈉和甲醛次硫酸鈉，可除去培養(yǎng)基中的氧氣或氧化型的物質(zhì)，使厭氧菌能在有氧條件下生長。 （1）培養(yǎng)基a、胰胨 20g K2HPO4 1.5g NaCl 2.5g 巰基醋酸鈉 0.6g 美藍(lán) 0.002g Na2SO3 0.2g L-胱氨酸 0.4g 蒸餾水 1000mL 瓊脂 0.

6、5g pH7.2，分裝試管（裝量約1/2試管），0.1MPa、121滅菌15min。b、酪素水解物 20g NaCl 5g 巰基醋酸鈉 2g 甲醛次硫酸鈉 1g 瓊脂 15g 蒸餾水 1000mL pH7.2，分裝試管（裝量約1/2試管），0.1MPa、121滅菌20min，培養(yǎng)基不擱斜面。 （2）試驗方法 取一環(huán)（接種環(huán)外徑1.5mm）肉湯培養(yǎng)液，穿刺接種到上述培養(yǎng)基底部，30培養(yǎng)3d至7d觀察結(jié)果。好氧菌在培養(yǎng)基上部生長，厭氧菌則在培養(yǎng)基底部生長。2、糖發(fā)酵(f jio)試驗（木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇）糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是細(xì)菌(xjn)分類鑒定的一項重要依據(jù)。（1）培養(yǎng)基 (NH4)2HP

7、O4 1g MgSO47H20 0.2g KCl 0.2g 酵母(jiom)膏 0.2g 糖或醇類 10g 水洗瓊脂 56g 蒸餾水 1000mL 0.04%溴甲酚紫（或溴百里酚藍(lán)）酒精液 20mL pH7.07.2，分裝10100mm小試管，培養(yǎng)基高度34cm，0.05MPa，110滅菌20min。 （2）試驗方法 取培養(yǎng)1824h的菌種，直針穿刺接種到培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)1、2、4、7、14d后觀察結(jié)果。指示劑由紫色變黃（溴百里酚藍(lán)由綠變黃），表示發(fā)酵糖類產(chǎn)酸，瓊脂柱中出現(xiàn)氣泡，則表示產(chǎn)氣。3、M.R試驗（甲基紅試驗）M.R試驗和V.P試驗分別測試細(xì)菌產(chǎn)酸和產(chǎn)生中性物質(zhì)的能力。有的利用葡萄糖

8、產(chǎn)酸，使PH值低于4.2，并可維持4d以上。甲基紅陰性的細(xì)菌可將產(chǎn)生的酸進(jìn)一步代謝，在4d內(nèi)生成中性化合物。因此，觀察時間對于該項試驗非常重要，一般細(xì)菌以4d觀察為宜。如果細(xì)菌在4d期間M.R和V.P反應(yīng)均為陽性，則應(yīng)該培養(yǎng)較長的時間，以確定生成的酸是否已完全轉(zhuǎn)變。（1）培養(yǎng)基 蛋白胨 5g 葡萄糖 5g NaCl 5g 蒸餾水 1000mL 調(diào)節(jié)pH至7.07.2,分裝試管，每管45mL，0.05MPa，110滅菌20min。（2）試劑 甲基紅 0.1g 95%酒精 300mL 蒸餾水 200mL（3）方法將菌種接種(jizhng)到上述培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)4、6d。在培養(yǎng)基中加入(jir)幾

9、滴甲基紅試劑，若培養(yǎng)基顯紅色，則為甲基紅陽性，黃色，則為陰性。如為陰性，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間。4、淀粉(dinfn)水解試驗許多芽孢桿菌都能產(chǎn)生淀粉酶，可將培養(yǎng)基中的淀粉水解為糊精等小分子，或進(jìn)一步水解為麥芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。（1）培養(yǎng)基 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g NaCl 5g 淀粉 2g 瓊脂 20g 水 1000mLpH7.27.4，分裝三角瓶，0.1MPa，121滅菌20min。（2）方法將培養(yǎng)基熔化并冷卻至50，倒平板，待冷卻凝固后，取菌種點種于培養(yǎng)基上，每皿可點種35個菌株，適溫培養(yǎng)24d，待長出菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以剛好鋪滿整個平板為宜。若菌落

10、周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉已被水解。5、硝酸鹽還原試驗 有的細(xì)菌可將培養(yǎng)基中的NO3還原為NO2、NH3和N2等，硝酸鹽還原作用的反應(yīng)式如下： 2H 2H HNO3 HNO2 HNO H2NOH NH3H2O H2N2O2 H2ON2OH2O N2須注意反應(yīng)(fnyng)過程中，NO3可能(knng)是最終產(chǎn)物，也可能是中間產(chǎn)物。如NO3被還原(hun yun)為NO2，加入格里斯試劑則培養(yǎng)基呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色。（1）培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 1000mL KNO3 1g pH7.07.4，0.1MPa，121滅菌30min。（2）試劑a、格里斯試劑A液：對氨基苯磺酸 0.

11、5g 10%稀醋酸 150mLB液：萘胺 0.1g 蒸餾水 20mL 10%稀醋酸 150mLb、二苯胺試劑 稱取0.5g二苯胺溶解于100mL濃H2SO4中，用20mL蒸餾水稀釋。（3）方法 將試驗菌種接種于培養(yǎng)基中（須做不接種的對照管），適溫培養(yǎng)1、3、5d，取兩支潔凈的試管，倒如少許培養(yǎng)液，然后在其中分別各加一滴A液和B液，對照管加入同樣的試劑。如培養(yǎng)液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色或棕色時，表示有NO2存在，為硝酸鹽還原陽性。如無紅色出現(xiàn)，則進(jìn)一步加入12滴二苯胺試劑，如培養(yǎng)液呈藍(lán)色，則表示培養(yǎng)基中仍存在NO3，如培養(yǎng)液不顯藍(lán)色，則表示NO3和新形成的NO2均已還原成其他物質(zhì)，仍按硝酸鹽還原陽性記錄。6、耐鹽性試驗（2、5、7%NaCl）該項試驗可檢測滲透壓對細(xì)菌生長的影響。不同的細(xì)菌對鹽的耐受性不同，可作為鑒別(jinbi)性特征之一。（1）培養(yǎng)基 在牛肉膏蛋白胨液體(yt)培養(yǎng)基中分別加入2、5、7、10%的NaCl。（2）方法(fngf) 將幼齡菌制成菌懸液，然后直針接種到培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)37d，與未接種的對照管對比，目測生長情況。注意培養(yǎng)基要求必須十分澄清。（3）實驗結(jié)果：形態(tài)觀察：4、生理生化鑒定結(jié)果枯草芽孢桿