腫瘤干細(xì)胞課件

1、CYTOME: 細(xì)胞組，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能元件CYTOMICS: 細(xì)胞組學(xué)，研究異質(zhì)性細(xì)胞組的科學(xué)，特別是以生物信息學(xué)方法研究單細(xì)胞分子水平由基因、蛋白和環(huán)境引起的細(xì)胞異質(zhì)性PROTEOME: 蛋白組，指單個單位生命組分（細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、器官乃至生命個體等）所有蛋白構(gòu)成PROTEOMICS: 蛋白組學(xué)，研究異質(zhì)性生命組分蛋白組的科學(xué)，特別是由基因和環(huán)境引起的變化。干擾RNA（RNAi）信號傳導(dǎo)蛋白（Cell Signalling）系統(tǒng)生物學(xué)環(huán)境細(xì)胞組基因/蛋白組相互作用網(wǎng)絡(luò)Cell-based71%Biochemical23%Uncertain6%Cell-based40%

2、Biochemical60%Past 5 yearsIn DevelopmentSource: Dr. Priya Kunapuli, Senior Research Scientist, Merck Research Laboratories; Dec. 2002Key takeaways: Rapid movement to cell-based assays for contextual analysisGrowth in cell based assays-以細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞組學(xué)研究的過去、現(xiàn)在和未來暗視野光鏡，相差顯微鏡，微分干涉對比顯微鏡，偏振光顯微鏡，熒光顯微鏡單光子共聚焦顯微鏡，

3、多光子共聚焦顯微鏡大體熒光成像系統(tǒng)細(xì)胞計數(shù)儀18世紀(jì)，明視野顯微鏡發(fā)明流式細(xì)胞儀分光高度計，熒光高度計，干涉光高度計放射自顯影細(xì)胞成像定量分析系統(tǒng)?目標(biāo)細(xì)胞分選 形態(tài)學(xué)研究工具的發(fā)展歷程Simple optical microscopeBasic clinical scopeResearch grade fluorescence scopeHigh-end automated HCS systemsConfocal scanning system細(xì)胞定量工具發(fā)展歷程Simple cell counters & sizersAutomated Cell viability2-4 color cy

4、tometer simple assays5-6 color cytometer clinical / high-end res.6 color plus cytometer / sorter high-end res.Cell Lab QuantaCONFOCAL SUB-CELL OR STRUCTURE ORIENTED IMAGING 利用流式細(xì)胞儀( flow cytometer ) 通過檢測熒光信號來檢測細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學(xué)特性并 通過這些特性對細(xì)胞或顆粒進行定量。 & 檢測表面標(biāo)記物 & 檢測胞漿標(biāo)記物 & 檢測胞核內(nèi)標(biāo)記物 & 檢測可溶性蛋白流式

5、細(xì)胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用基礎(chǔ)知識1)認(rèn)識熒光素2)抗原抗體結(jié)合的基礎(chǔ)和特點3)對待測目標(biāo)細(xì)胞標(biāo)記物的理解應(yīng)用的背景知識五光十色的熒光素單分子熒光素耦合的復(fù)合熒光素分子新型的熒光素樣熒光物質(zhì)QdotsQdots-納米晶體：未來的熒光素同一種光源激發(fā)一種晶體發(fā)射多種熒光Qdots 605的激發(fā)波長和發(fā)射波長（VERY SHARP）用熒光標(biāo)記抗體抗體特異性地結(jié)合細(xì)胞上對應(yīng)的抗原表達該抗原的細(xì)胞被標(biāo)記上熒光；抗原表達多的細(xì)胞熒光強度強陽性細(xì)胞百分比或濃度靶蛋白濃度從模擬信號到先進的數(shù)字化信號數(shù)字化信號轉(zhuǎn)換對數(shù)查表保證最優(yōu)化的線性和穩(wěn)定性4次冪轉(zhuǎn)換誤差 1%光纖通訊速度快保真

6、性高實時獲取數(shù)據(jù)和分析報告結(jié)果20比特的數(shù)據(jù)，補償數(shù)字化全矩陣正反補償 離線補償線性對對數(shù)查表 VS 普通對數(shù)放大 讓目標(biāo)細(xì)胞特異性帶上熒光！1)抗原抗體結(jié)合2)熒光素特異性結(jié)合&細(xì)胞器&生物大分子3)生物大分子之間的結(jié)合，如 PS 與ANNEXIN V的結(jié)合抗原抗體結(jié)合非特異性因素抗體的交叉反應(yīng)所以最好選用單克隆抗體FC受體與Fc段的結(jié)合其它因素例如： IgG-CH3與單核細(xì)胞上FcR結(jié)合； IgE-CH4與肥大細(xì)胞上FcR結(jié)合IgG1, IgG2 and IgG4IgG3從模擬信號到先進的數(shù)字化信號數(shù)字化信號轉(zhuǎn)換對數(shù)查表保證最優(yōu)化的線性和穩(wěn)定性4次冪轉(zhuǎn)換誤差 1%光纖通訊速度快保真性高實時

7、獲取數(shù)據(jù)和分析報告結(jié)果20比特的數(shù)據(jù)，補償數(shù)字化全矩陣正反補償 離線補償線性對對數(shù)查表 VS 普通對數(shù)放大 抗原抗體結(jié)合的特異性 血液系統(tǒng)各系列細(xì)胞分化階段抗原表達T細(xì)胞分化發(fā)育與膜表面分子的表達： 胚胎肝臟、骨髓陰性選擇胸腺淺皮質(zhì)區(qū)深皮質(zhì)區(qū)髓 質(zhì) 區(qū) CD4+ CD8-CD4-CD8+CD4-CD8- 4-8-4-8-陽性選擇原T細(xì)胞CD3-CD4-/CD8-CD3+/+CD4-/CD8-CD3+/+CD4+/CD8+8+4+4+8+4+8+抗己抗己MHCIIMHCICD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群 細(xì)胞群 CD抗原 T細(xì)胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B細(xì)胞

8、CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系細(xì)胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK細(xì)胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 內(nèi)皮細(xì)胞 CD105 CD106 CD109細(xì)胞因子受體 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126流式細(xì)胞儀的主要特點高速測定細(xì)胞，大樣本計數(shù)檢測稀有細(xì)胞多參數(shù)分析自動

9、化細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀工作原理 基本原理流路流動室 鞘液SHEATH 樣本流SAMPLE 單細(xì)胞懸液5*1051*106個/ml光路光源濾片光電倍增管PMT HV電路放大電路HV及GAIN 增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計 計算機 單細(xì)胞懸液 大多數(shù)儀器是在50-300 m 大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液 注射進入鞘液中 這一過程,成為流體動力學(xué)聚焦流路流動室Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流式細(xì)胞儀光路圖Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQ

10、uartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (PE)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DL -單激光激發(fā)四色熒光標(biāo)準(zhǔn)模式 確保在同一個細(xì)胞上獲得最多的信息單激光激發(fā)四色光路 - 濾片特性 長通濾片 允許長于設(shè)定波長的光通過 短通濾片 允許短于設(shè)定波長的光通過 帶通濾片 允許一定帶寬的波長通過當(dāng)以 45o 角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光 ，這種方式的濾片稱為

11、二向色性濾片( dichroic filter)630 nm BandPass FilterWhite Light Source散射光信號 細(xì)胞大小及顆粒性FSSS信號散射光信號 FS 細(xì)胞大小 SS 細(xì)胞顆粒性熒光信號 FL1 FITC FL2 PE FL3 ECD FL4 PC5 FL5 - PC7熒光信號原理：細(xì)胞表面的抗原(或細(xì)胞膜受體)與相關(guān)的熒光抗體結(jié)合，形成帶有熒光的抗原抗體復(fù)合物。通過流式細(xì)胞儀測定其熒光量，即可得到細(xì)胞群的不同抗原位點表達情況。電壓調(diào)節(jié)利用同型對照：設(shè)置背景 電壓 volts 增益 Gain設(shè)定陰性和陽性信號強度的臨界點熒光補償 Need to do when

12、 we measure signals from more than 1 fluorescence. FITC520BP520 BPE575BP4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5熒光檢測通道1熒光檢測通道2熒光檢測通道3熒光檢測通道4熒光檢測通道5熒光交叉對光路的影響補償PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC signal - %

13、 PE signalAfter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensationBeckmancoulter-應(yīng)用最精確的全矩陣軟件 利用軟件進行全矩陣顏色補償（任何兩個熒光檢測通道之間都可以進行補償）檢測的一般步驟設(shè)置檢測方案（PROTOCOL)染色標(biāo)

14、本（同型對照，補償管，檢測抗體）同型對照管調(diào)電壓電壓不變，補償管調(diào)補償電壓不變，補償不變，上檢測管檢測后直接閱讀結(jié)果如何看圖流式細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀分選電荷式分選是當(dāng)前的主流分選模式高速分選是保證結(jié)果的基本條件高純度和高活性是分選的基本要求可選的激光要多樣化（空冷、水冷、固體；不同的波長；真正的紫外）提供多種分選流動室光路穩(wěn)定，紫外激光功率大流式分選和磁珠分選的差別和聯(lián)系BECKMAN COULTER提供工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的大型分選機型Epics ALTRA:能滿足絕大多數(shù)的分選需求BD的FACSVantage：只提供水冷激光和JIA流動室，光路不穩(wěn)定，不方便檢測，分選成本高BD的FACSAria：是一種

15、過渡機型，只能提供空冷激光和石英流動室，不適用于大功率分選和活細(xì)胞分選Cytomation的Moflow是最經(jīng)典的流式分選機，僅供應(yīng)少量實驗室，操作和人為干涉復(fù)雜，在中國無維修和售后服務(wù)，價格昂貴電荷式流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector流式細(xì)胞儀應(yīng)用CELLS OF THE IMMUNE RESPONSE INNATE PMN NUETROPHILS EOSINOPHILS BASOPHILS MONOCYTES / MAC

16、ROPHAGES DENDRITIC CELLS: mDC - pDC NK CELLS NKT CELLS gd T LYMPHOCYTES CD5+ B CELLS ADAPTIVE B CELLS HELPER T-CELLSTh1Th2 REGULATORY T-CELLS (Th3) CYTOTOXIC T-CELLS細(xì)胞免疫功能測定淋巴細(xì)胞亞群活化的T淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞調(diào)控性T細(xì)胞樹突狀細(xì)胞先天免疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞(CD3+)名 稱功 能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD

17、29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時升高 CD3+CD4-CD8- 有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達 / T細(xì)胞受體(TCR / ) CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時此細(xì)胞亞群較低 C

18、D45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細(xì)胞 病菌感染時升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細(xì)胞, 感染時升高 感染時升高淋巴細(xì)胞亞群活化T淋巴細(xì)胞名 稱功 能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+ 活化的B細(xì)胞過敏患者中升高 CD19

19、+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞 NK細(xì)胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低, 而病毒感染時升高 CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強烈征兆 根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同還可將CD4+、CD8+分為 CD4+: T h1:CD4+IFNr+ Th2:CD4+IL4+ Th0:CD4+IFNr+IL4+ CD8+: Tc1:CD8+IFNr+ Tc2:CD8+IL4+ Tc0:CD8+IFNr+IL4+Th1Th2細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型和生物學(xué)功能,人的4+細(xì)胞可以分為1、21細(xì)

20、胞產(chǎn)生 2、 12、 、 等細(xì)胞因子,主要參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、遲發(fā)性過敏反應(yīng),并在清除病毒等細(xì)胞內(nèi)致病因子方面起著重要作用2細(xì)胞分泌 4、 5、 6、 10、 13等細(xì)胞因子,主要促進體液免疫反應(yīng),中和胞外病原體相應(yīng)地，CD8+T細(xì)胞也可以分為Tc1和Tc2Th1細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生長和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細(xì)胞 ：介導(dǎo)體液免疫，促進B細(xì)胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高IgE綜合癥和嗜

21、酸性粒細(xì)胞增多癥。淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項目和意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴(yán)重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低腫瘤降低降低增高降低降低抗原特異性T細(xì)胞分析四聚體（tetramer)染色細(xì)胞因子分泌試驗ELISPOTCytokine Secretion AssayTETRAMER抗原遞呈細(xì)胞（APC）攜帶抗原片段通過與TCR復(fù)合物結(jié)合，在APC和T細(xì)胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞免疫效應(yīng)。MHC-四聚體染色技術(shù)用于抗原特異性T細(xì)胞分析的原理在于體外模仿上述抗原遞

22、呈的過程來實現(xiàn)對特異性T細(xì)胞的鑒定，通過流式細(xì)胞儀這種高通量分析儀器對標(biāo)本中這群細(xì)胞進行分析 四聚體技術(shù)的優(yōu)勢是：可以對特異性免疫細(xì)胞進行定量；用流式細(xì)胞儀檢測可以快速測定大量細(xì)胞，可以同時進行其它表面染色，可以直接用外周血測定而不需要培養(yǎng)；四聚體染色不會殺傷細(xì)胞，因此染色后的細(xì)胞可以進行分選或其它功能分析；四聚體對所有的特異性T細(xì)胞都能夠結(jié)合，而不僅僅是對有功能的細(xì)胞進行檢測。 不同廠家的MHC四聚體產(chǎn)品不太一樣：貝克曼庫爾特公司創(chuàng)造性地構(gòu)建和表達了MHC分子3鏈的區(qū)域突變的蛋白（iTAg），能降低其與非特異性T細(xì)胞結(jié)合，大大提高了特異性。并且將MHC四聚體直接標(biāo)記熒光，和常用的抗原多肽負(fù)載

23、后整體商品化，也有單獨的MHC分子（iTAg）單獨出售，極大方便了研究者 Beckman Coulter已經(jīng)有的產(chǎn)品傳染性疾病相關(guān)：HIV gag SLYNTVATL HLA - A*0201HIV pol ILKEPVHGV HLA - A*0201CMV PP65 NLVPMVATV HLA - A*0201EBV GLCTLVAML HLA - A*0201EBV GLCTLVAML HLA - A*0201Influenza M1 GILGFVFTL HLA - A*0201HBV core FLPSDFFPSV HLA - A*0201腫瘤性疾病相關(guān)：Mart1 ELAGIGILTV

24、 HLA - A*0201Gp 100 IMDQVPFSV HLA - A*0201Gp 100 ITDQVPFSV HLA - A*0201Her-2/neu KIFGSLAFL HLA - A*0201Her-2/neu RLLQETELV HLA - A*0201PR-1 VLQELNVTV HLA - A*0201Tyrosinase YMDGTMSQV HLA - A*0201 抗原決定簇分析的科學(xué)平臺iTopia Epitope Discovery System 在目前主要以數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)的理論性分析抗原決定簇的基礎(chǔ)上，iTopia技術(shù)平臺為研究者研究免疫的發(fā)生發(fā)展、疫苗的研制和免疫

25、學(xué)檢測提供了一個科學(xué)合理的解決方案 活化的淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子檢測TH1類細(xì)胞因子: 與細(xì)胞免疫有關(guān)TH2類細(xì)胞因子: 與體液免疫有關(guān)TH17類細(xì)胞因子: 與炎癥反應(yīng)有關(guān)PMA,IONOMYCIN,BFA處理后全血染色分析IFN-GAMMA抗原特異性CD8 T細(xì)胞檢測檢測HBV核心抗原(8AA)特異性CD8 T細(xì)胞新現(xiàn)象?待進一步闡明 TETRAMER結(jié)合后對CD3,CD8位點的結(jié)合是否有影響?觀察到CD3,CD8弱陽性一群細(xì)胞,TER陽性理論支持TETRAMER+CD8競爭位點TETRAMER+CD3競爭位點ELISPOTELISPOT的優(yōu)勢是非常敏感（流式細(xì)胞儀檢測的極限是10*-6,EL

26、ISPOT的極限可以到10*-8)ELISPOT的缺點是計數(shù)麻煩，并且不能限定細(xì)胞因子是由哪一類細(xì)胞分泌的Cytokine Secretion Assay 非常新的思路CD4CD25 Treg調(diào)控性T細(xì)胞的主要功能是抑制機體免疫功能，太強則免疫耐受，太弱會引起自身免疫反應(yīng)調(diào)控性T細(xì)胞調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞對抗原的遞呈調(diào)控性T細(xì)胞的表型是CD4+CD25bright，逐漸發(fā)現(xiàn)越來越多的其它分子可能能夠更精確限定（eg.FOX-P3)CD25也是免疫細(xì)胞晚期活化的標(biāo)記，但表達的平均熒光強度不足夠強樹突狀細(xì)胞分析（Dendritic Cells,DC)DC是主要的抗原遞呈細(xì)胞，同時又是重要的先天免疫細(xì)胞，

27、還是具有免疫調(diào)控功能的一個細(xì)胞群，沒有發(fā)現(xiàn)特異性的抗原標(biāo)記DC研究的主要內(nèi)容包括直接分析計數(shù)、體外誘導(dǎo)檢測,一般分為兩群PDC,MDC當(dāng)前DC檢測的方法：1）Lin-,CD11c,CD123,同時可能表達CD80,CD86,CD83,DR等2）利用BDCA1,2,3,4對外周血或其它組織DC進行分析3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD1233 contexts for DC DISCOVERYPeripheral blood DCDC in tissuesDC generated in vitroFLOW CYTOMETRY兩群樹突狀細(xì)胞MDC/PDC新的DC

28、細(xì)胞群Regulatory DC : Regulatory DC與傳統(tǒng)DC不同，不遞呈抗原，不激活T細(xì)胞主要存在與二級淋巴組織，發(fā)揮與傳統(tǒng)DC相反的作用與淋巴組織的微環(huán)境相互作用，調(diào)節(jié)DC的功能非特異性的先天免疫細(xì)胞細(xì)胞:占外周血T細(xì)胞的10以下，非抗原依賴型免疫細(xì)胞，在傳染病、腫瘤病人外周血數(shù)量增加，表達CD3量較普通T細(xì)胞多NK細(xì)胞：占外周血淋巴細(xì)胞825，傳染病和腫瘤病人數(shù)量偏低。NK細(xì)胞可以根據(jù)NKR的不同而分類，丙型肝炎的發(fā)生和預(yù)后可能與NK細(xì)胞的表型相關(guān)DC：分布與淋巴組織和外周血，為非成熟狀態(tài)，遇到相應(yīng)的抗原后主要分泌IFN-alpha來發(fā)揮左右受體與疾病關(guān)系趨化因子受體CCR5

29、與HIV易感性干細(xì)胞研究造血系統(tǒng)干細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞脂肪干細(xì)胞熱門研究間充質(zhì)干細(xì)胞非造血系統(tǒng)細(xì)胞的主要來源共同的祖先在不同的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件下能分化為不同的系列細(xì)胞或組織無特異性標(biāo)記，天然數(shù)量稀少最好用流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析方法來分析表達的抗原包括間質(zhì)細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,表皮細(xì)胞的標(biāo)志:1)粘附分子類:CD102,CD56,CD54,CD166等,無CD62P;2)生長因子和細(xì)胞因子受體類:CD121-126等,無CD25;3)整合素分子類:CD49,CD29等,無CD11;4)其它分子類:CD105,CD90,CD73等,無CD34,CD45,CD80,CD86.CD34 ISHA

30、GE Single Plateform 熱門研究（腫瘤）干細(xì)胞腫瘤組織無限制的增殖在于腫瘤干細(xì)胞的存在目前研究的腫瘤干細(xì)胞來源于前列腺、乳腺等腫瘤腫瘤干細(xì)胞數(shù)量稀少，常規(guī)方法很難檢測目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞和正常細(xì)胞在HOECHEST 33342染料攝取方面有重大差別因此流式細(xì)胞儀是分析和檢測腫瘤干細(xì)胞的重要工具腫瘤干細(xì)胞中的研究應(yīng)用-Hoechst 33342 side population干細(xì)胞能表達ABCG2泵蛋白，在HOECHST 33342染色時能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色的細(xì)胞群時可以發(fā)現(xiàn)一群不能染色的細(xì)胞既是干細(xì)胞，因此能夠在眾多腫瘤細(xì)胞中區(qū)分出腫瘤干細(xì)胞。QUANT

31、A檢測SP結(jié)果SIDE POPULATION檢測指南波長為355nm的超過50mw的紫外激光;488BP and 488DL for SSC 608LP Hoechst-red 515SP Hoechst-blue 非常關(guān)鍵的染色步驟-Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806 ALTRA檢測SP結(jié)果細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測細(xì)胞凋亡研究 1.鑒別凋亡與壞死:Annexin /PI2.測定凋亡率:Annexin 、Apo 27、TUNEL3.研究凋亡觸發(fā)機制：Caspase、Fas及FasL bcl-2/bax4.多參數(shù)分析凋亡是趨勢細(xì)胞膜

32、非對稱性和通透性檢測 細(xì)胞周期分析:在細(xì)胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進行分析，可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細(xì)胞周期進行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及細(xì)胞周期分析Normal Cell Cycle 細(xì)胞增值和凋亡檢測CFSE檢測細(xì)胞增值Regulatory proteins (bax/bcl-2 family, p53)Forw

33、ard and side scatterDye uptake (YO-PRO-1 + PI)Membrane inversion (Annexin V)Loss of mitochondrial membrane potential (DiOC6)Caspase activation (Ab)DNA strand break (TUNEL, Sub G1)M4M5M6M7T-allB-ALL常見白血病CD45設(shè)門、FS/SS設(shè)門分群比較M2M3CD45/SSC輔助設(shè)門的原理 CD45是所有白細(xì)胞的抗原， CD45表達量在成熟淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、早期造血細(xì)胞依次減弱。紅細(xì)胞(中、晚幼

34、紅細(xì)胞、成熟紅細(xì)胞)不表達 CD45。側(cè)向角光散射(SSC)反映細(xì)胞的顆粒性，成熟粒細(xì)胞 SSC最高，依次為單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、 早期造血細(xì)胞、紅細(xì)胞。以 CD45SSC典型圖即可獲得初步印象。若同時加上一個或二個以上其它單抗進行二、三色甚至四色分析，則很容易識別非正常細(xì)胞群的表型，并排除正常細(xì)胞的干擾，當(dāng)標(biāo)本中幼稚細(xì)胞低于50或檢測殘存白細(xì)胞時尤為必要。貝克曼庫爾特公司BBA試劑能同時檢測10種細(xì)胞因子*Human Th1/Th2 Cytokine I KitFL2 (Reporter Parameter)FL4(Differentiator Parameter)Comparison of

35、FlowCytomix and ELISA Standard RangesFlowCytomix Correlation with ELISAs采用的是夾心免疫分析方法，捕捉抗體包被在微球上微球: 直徑4.4 和5.5 m 的兩種聚乙烯小球抗體通過羧基與微球連接檢測不同指標(biāo)的微球其內(nèi)部熒光或大小不同ELISA的原理.Microsphere技術(shù)原理Kit ConfigurationsKit TypesSimplex KitsMultiplex Kits (up to 10)Basic KitsSpecies/ ApplicationHuman Th1/Th2Human Cardio-Vascul

36、arMouse Th1/Th2Rat CytokineHuman Adhesion Main MenuKit ConfigurationsSimplex Kits:Contain reagents for the detection of one individual cytokineUser may combine Simplex kits for custom assay* Basic Kit required Multiplex Kits:Contain reagents for the detection of up to 10 analytes per sample simultan

37、eously Common Sample TypesSerumPlasmaCell culture supernatantsWhole BloodMain MenuProduct CharacteristicsMain MenuSimplex KitsIFN-gIL-8sVCAM-1IFN-gIL-5IL-1bIL-10t-PAGM-CSFIL-6IL-2IL-12p70sP-selectinIL-1aIL-10IL-4TNF-asCD40LIL-2IL-17IL-5TNF-bMCP-1IL-4TNF-aIL-6Up to 10 Simplex Kits can be combined Exc

38、ept for Simplex kits with identical bead populationsHuman AnalytesMouse AnalytesFlowCytomix Multiplex KitsHuman Th1/Th2 10 plexTh1/Th2 Cytokines Multiplex Kit I(IFN-g, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-a, TNF-b) Th1/Th2 Cytokines Multiplex Kit II(IFN-g, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, I

39、L-8, IL-10, IL-12p70, TNF-a)Human Cardiovascular 7 plex(sCD40L, IL-6, IL-8, MCP-1, sP-selectin, t-PA, sVCAM-1)Mouse Th1/Th2 10plex(GM-CSF, IFN-g, IL-1a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-a)Human Adhesion 6 Plex(sE-selectin, sICAM-1, sICAM-3, sPECAM-1, sP-selection, sVCAM-1)Rat Cytokine 6 plex(rGM-CSF, rIFN-g, rIL-1a, rIL-4, rMCP-1, rTNF-a) Cardiovascular 7-plex: DetailsHuman Cardiovascular 7-plex(sCD40L, IL-6, IL-8, MCP-1, sP-selectin, t-PA, sVCAM-1)These analytes are useful in cardiovascular research as well as the study of immune disorders.sCD40