原代細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定方法

1、1、大鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞原代培養(yǎng)并鑒定：脫頸法處死SD大鼠（體重約200g）, 75%酒精浸泡消毒3min。轉(zhuǎn)入超凈工 作臺(tái)內(nèi)操作，剪開(kāi)后肢皮膚，去除腿部肌肉，暴露出股骨，盡可能將股骨外部肌 肉剝離干凈，剪下股骨。剪去股骨兩端的股骨頭，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基后將骨髓吹打出來(lái)，吹打過(guò)程中盡可能將骨髓沖洗干凈。使用 巴氏吸管將骨髓吹打成單細(xì)胞懸液，1000rmp/min離心5min收集細(xì)胞如發(fā)現(xiàn)收 集的細(xì)胞中有大量紅細(xì)胞時(shí)需使用紅細(xì)胞裂解液處理。使用肥大細(xì)胞專用培養(yǎng)基 重懸細(xì)胞，接種至T25瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中每2-3天換液一次，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞 變圓脫落時(shí)，收集脫落細(xì)胞至新

2、的T25瓶?jī)?nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)四周時(shí)肥大細(xì)胞誘 導(dǎo)成熟，取成熟的肥大細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色鑒定;取脫落細(xì)胞培養(yǎng)一周、二周、 三周、四周的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行組胺含量檢測(cè)。2、小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定：小鼠經(jīng)脫頸椎處死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取無(wú) 菌PBS從股骨一端刺入，將骨髓細(xì)胞洗出，直到骨髓腔變白。離心收集細(xì)胞， 加入3mL紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解3min之后，用PBS漂洗2次。采用現(xiàn)配的 原代細(xì)胞培養(yǎng)工作液（含青、鏈霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL， SCF 10ng/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液）將細(xì)胞重懸，按照106個(gè)/m

3、L接種 于六孔板中，每孔加3mL培養(yǎng)液，置于37C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每7d 將懸浮細(xì)胞按照106個(gè)/mL轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，4-6周細(xì)胞分化成 熟。四周后收集懸浮細(xì)胞，部分細(xì)胞用于流式檢測(cè)純度，部分用含10% FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)基重新接板。純度檢測(cè)：向誘導(dǎo)分化細(xì)胞中按1： 200加入 肥 大 細(xì) 胞表面 標(biāo)志物APC-CD117，F(xiàn)ITC- FceRI，o4C孵育60min，無(wú)菌PBS 漂洗3次，流式檢測(cè)肥大細(xì)胞純度。（SCF： Stem cell factor，干細(xì)胞因子；又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子 MGF）3、大鼠腹腔肥大細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：選用體重220-25

4、0g的SD大鼠。頸椎脫臼法處死，置于75%酒精中浸泡約2min后取出，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)完成后續(xù)操作。無(wú)菌注射器向腹腔內(nèi)注射15 MlRPMI 1640培養(yǎng)基（含10U/mL肝素）,輕柔按摩大鼠腹部約90s；打開(kāi)腹腔，盡可能多地抽取腹腔液與50 mL離心管，4C, 150g，離心10min,棄去上清；PBS 清洗，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞，4C, 150g，離心10min，棄去上清，PBS 重懸細(xì)胞；配制90% Percoll溶液，將細(xì)胞懸液與90% Percoll溶液（淋巴細(xì)胞分 離液）按1： 4的比例充分混合，后在其上輕輕覆蓋1mLPBS，4C，150g，離 心25min，棄去上清；PBS清

5、洗2次，4C，150g，離心6min；將細(xì)胞重懸于含 10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（加入1%青霉素、鏈霉素），接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。肥大細(xì)胞表面標(biāo)志物APC-CD117，F(xiàn)ITC- FcsRIa，4C孵育 60min，無(wú)菌 PBS 漂洗 3 次，流式檢測(cè) 肥大細(xì)胞純度。（肥大細(xì)胞的激活：C48/80刺激細(xì)胞脫顆粒，20pg/mL； IgE刺激細(xì)胞脫顆粒，1g/mL Purifird Rat IgE。文獻(xiàn)：溫度對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞和RBL-2H3細(xì)胞活力和功能的影響。）4、小鼠BMSCs的原代培養(yǎng)與鑒定脫頸法處死C57小鼠，在75%乙醇中浸泡5

6、min，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌 條件下分離出小鼠的長(zhǎng)骨（股骨和脛骨），浸泡于PBS溶液中。對(duì)股骨和脛骨進(jìn)行 深層次解剖，去除附著的肌肉組織，剪掉長(zhǎng)骨兩端的十骺端，用10%FBS，DMDM 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白，收集洗滌液，用移液槍輕輕吹散分離 為單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞接種于六孔板中培養(yǎng)，輕微搖勻，使細(xì)胞在孔中均勻分布，放 置于37C、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使BMSCs充分貼壁。培養(yǎng)48h后換液，用 預(yù)熱的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，添加新鮮培養(yǎng)基，之后每隔48h換液1次， 原代培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿80 %進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待原代細(xì)胞傳代至P3代時(shí)，進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，流式標(biāo)記對(duì)BM

7、SCs 進(jìn)行鑒定。BMSCs成脂誘導(dǎo)分化：、對(duì)照組：BMSCs不作處理、成脂組：BMSCs+成脂誘導(dǎo)劑上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組三個(gè)重復(fù)孔，BMSCs鋪于六孔板（細(xì)胞爬片），細(xì) 胞融合達(dá)80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成脂組加入成脂誘導(dǎo)劑 （成脂肪誘導(dǎo)劑成分為10 -6 mol/L地塞米松+ 5x10 -4 mol/L IBMX+ 2x10 -4 mol/L 吲噪美辛+10四g/ml胰島素）3d換液1次，分化18d。待脂滴形成后，PBS緩沖液清 洗3次，10%中性甲醛固定10min，再用PBS緩沖液清洗2次，進(jìn)行油紅O染色，拍 照記錄。BMSCs成骨誘導(dǎo)分化：、對(duì)照組：BMSCs不作處理

8、、成骨組：BMSCs+成骨誘導(dǎo)劑上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組三個(gè)重復(fù)孔，BMSCs鋪于六孔板（細(xì)胞爬片），細(xì) 胞融合達(dá)80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成骨組加入成骨誘導(dǎo)劑 （成骨誘導(dǎo)劑成分為10-8mol/L地塞米松+50四g/ml維生素C+ 10mmol/L。-甘油磷 酸鈉）。3d換液1次，分化21d，21d后用茜素紅染色，觀察結(jié)果并拍照。BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化：、對(duì)照組：BMSCs不作處理、成軟骨組：BMSCs+成軟骨誘導(dǎo)劑上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6個(gè)重復(fù)孔，每組3孔用于ICC，另3孔用于甲苯胺藍(lán) 染色。BMSCs鋪于六孔板（細(xì)胞爬片），細(xì)胞融合達(dá)80%以上后，棄去原培養(yǎng) 基，更換新鮮培

9、養(yǎng)基，成軟骨組加入成軟骨誘導(dǎo)劑（50四g/ml維生素C +100nmol/L 地塞米松+100四g/mL丙酮酸鈉+50mg/mL ITS +5.35四g/mL亞油酸+ 10ng/mLTGF-pi + 1.25ng/mL BSA），培養(yǎng)3周后進(jìn)行II型膠原免疫組化（ICC）， 取另3孔進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。流式細(xì)胞儀鑒定：收集P3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用PBS （含1% BSA）清洗細(xì)胞3次，計(jì)數(shù)細(xì) 胞，重懸細(xì)胞后流式檢測(cè)表面標(biāo)記CD34、CD29、CD45、CD90的表達(dá)情況。5、大鼠PMVEC細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定：取成年SD大鼠（體重約200g），靜脈注射麻醉同時(shí)注入肝素鈉，麻醉成功 后用體積分

10、數(shù)75%乙醇浸泡全身（頭部以下）消毒5 min，將大鼠固定于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用外科剪、鑷逐層剪開(kāi)胸腔，切下心肺并放入盛有含200IU/ml青霉素 和200ug/ml鏈霉素的D-Hanks液的培養(yǎng)皿內(nèi)。用D-Hanks液沖洗心肺組織的血 跡，用眼科剪、鑷去除肺組織表面的臟層胸膜，剪取胸膜下肺組織，將組織剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種T25瓶（需先用1%明膠進(jìn)行包被）， 放入37C, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，更換使用ECM培養(yǎng)液 （微血管內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基、含內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)約需3瓶， 500ml/瓶）進(jìn)行篩選純化，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2-3d更換一次

11、培養(yǎng)液，細(xì)胞匯合 度達(dá)到85-90%時(shí)進(jìn)行傳代。PMVEC細(xì)胞傳代至P3代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞爬片，以 六孔板計(jì)，每孔接種5*105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞爬滿玻片后，使用CD31抗體進(jìn)行免 疫熒光鑒定，每個(gè)抗體檢測(cè)三孔，陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到90%方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。6、大鼠破骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)：薄骨磨片的制備及處理：取新鮮成年牛股骨皮質(zhì)（市售）-20 C貯存。臨用前 鋸成1 cm寬條后，用磨片機(jī)磨成厚50pm的Icmxlcm骨片，蒸餾水清洗10次， 置于75%的乙醇浸泡24 h,自然晾干，紫外線照射消毒骨片的兩面，放于DMEM 培養(yǎng)基中4C備用。玻片的制備：將玻片切成1 cmx1cm大小，泡酸過(guò)夜，自來(lái)水沖洗干凈，蒸

12、餾水洗3遍,，烤箱烤干，高壓消毒滅菌后備用。破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)：大鼠麻醉后斷頸處死，無(wú)菌取其四肢長(zhǎng)骨，在磷酸鹽 緩沖液中盡可能去除附著在其表面的全部軟組織。將骨干置于DMEM培養(yǎng)基（10% 的胎牛血清，4 pmol/L谷氨酰胺）中，然后縱行剖開(kāi)，刮骨髓腔及靠近干骺端處 內(nèi)表面直至骨干成為極微小的碎片，300目篩網(wǎng)過(guò)濾，吸管反復(fù)吹洗篩網(wǎng)上殘?jiān)?吸取濾過(guò)懸液，置入離心管內(nèi)，4 C 1 000 r/min離心10 min，棄上清，加4mL DMEM培養(yǎng)基吹打均勻，接種于24孔板，24孔板內(nèi)分別放置制備的玻片和骨 片，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后（時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行確定）進(jìn)行 TRAP染色與

13、噬骨能力檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)三個(gè)重復(fù)。（取蓋 玻片進(jìn)行TRAP染色，取培養(yǎng)液中的骨片檢測(cè)噬骨能力檢測(cè)，用掃描電鏡觀察骨 片上的陷凹情況，以判定噬骨能力）7、大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：SD大鼠除頭部以外浸入75%的乙醇?xì)⒕?，隨后移入無(wú)菌操作臺(tái)，剖開(kāi)胸腹 腔，取胸主動(dòng)脈，置于預(yù)冷的無(wú)菌PBS液，去掉外結(jié)締組織，反復(fù)重洗管腔，清 除殘留的血細(xì)胞。清除細(xì)小的動(dòng)脈分支，更換培養(yǎng)皿與PBS，將動(dòng)脈一端輕輕提起，注意不損傷到內(nèi)膜。將動(dòng)脈剪成厚度約為1.5mm的動(dòng)脈環(huán)，將動(dòng)脈環(huán)移入T25 培養(yǎng)瓶、每瓶接種15-20個(gè)動(dòng)脈環(huán)，加入DMEM培養(yǎng)基（20%FBS、青鏈霉素）， 使培養(yǎng)液剛剛沒(méi)過(guò)動(dòng)脈環(huán)

14、，動(dòng)脈環(huán)需均勻分布于瓶底，將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 培養(yǎng)60小時(shí)，棄去動(dòng)脈環(huán)。更換新鮮培養(yǎng)液，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2-3d更換一次 培養(yǎng)液，細(xì)胞匯合度達(dá)到85-90%時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代至P3代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞 爬片，以六孔板計(jì)，每孔接種5*105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞爬滿玻片后，使用Factor VIII （vwf）抗體、CD31抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定，每個(gè)抗體檢測(cè)三孔，陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到 90%方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法一致）8、大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定：SD大鼠經(jīng)頸椎脫臼致死,75%乙醇浸泡消毒3min，固定后依次剪開(kāi)胸腹部皮 膚，肌肉及胸骨，暴露胸腔，緊靠脊柱右前方，從主動(dòng)脈弓至

15、膈面處剪下胸主動(dòng)脈，并 放入盛有PBS緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，迅速轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)室的超凈工作臺(tái)。眼科直 鑷和彎鑷去除血凝塊和血管外膜層，然后轉(zhuǎn)移入另一盛有PBS緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng) 皿中,剪去血管外的小分支。再轉(zhuǎn)移入含20%胎牛血清和DMEM混合液的細(xì)胞培 養(yǎng)皿中,眼科直剪剪開(kāi)血管腔，內(nèi)膜面向上，以眼科彎鑷或手術(shù)刀片輕輕擦拭內(nèi)膜 層，以去除內(nèi)皮細(xì)胞。最后轉(zhuǎn)移入另一含20%胎牛血清和DMEM混合液的細(xì)胞培 養(yǎng)皿中，用眼科剪將血管段剪成1mm X 1mm大小的組織塊，用吸管把組織塊轉(zhuǎn)入 T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并均勻貼壁于培養(yǎng)瓶底面，組織塊的間距為0.5cm。蓋好瓶蓋， 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上，并向瓶?jī)?nèi)注

16、入適量20%胎牛血清和DMEM混合液以 及相應(yīng)比例的青鏈霉素混合液，置于37C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置35h，使得組織 塊干涸，并與瓶底貼附，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放,使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù) 靜置3天，切勿移動(dòng),45天會(huì)有細(xì)胞從組織塊周圍游離出，即可換液進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì) 胞傳代至P3代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞爬片，以六孔板計(jì)，每孔接種5x105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞爬 滿玻片后，使用o-SM-actin抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定，每個(gè)抗體檢測(cè)三孔，陽(yáng)性細(xì) 胞達(dá)到90%方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)9、人正常角質(zhì)形成細(xì)胞與成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)：取健康兒童包皮環(huán)切手術(shù)后的殘余皮膚組織，經(jīng)dispase酶消化后，分離表 皮與真皮、再經(jīng)Typ

17、sin-EDTA （0.25%）分別消化，表皮消化后形成的角質(zhì)形成 細(xì)胞接種于W型膠原包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)（角質(zhì)形成細(xì)胞專用培養(yǎng)基，Keratinocyte Medium-defined），真皮消化后形成的成纖維細(xì)胞接種于Fibroblast Medium serum free 培養(yǎng)基（成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基）中進(jìn)行培養(yǎng)。傳代至 P5代時(shí)，進(jìn)行免疫熒光鑒定，其中原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞用pan-Cytokeratin 抗體進(jìn)行鑒定，成纖維細(xì)胞用vimentin與cytokeratin15抗體進(jìn)行鑒定。10、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定：臍帶血間充質(zhì)十細(xì)胞的分離培養(yǎng)：從胎盤臍靜脈穿

18、刺抽取15 mL臍帶血，肝 素抗凝，加等量磷酸緩沖液稀釋，取 50 mL離心管，先加入 15 mL密度 1.077g/mL的Percoll梯度分離液，小心加入稀釋后的臍帶血，2 000 r/min離心 25 min后，用吸管吸取分層界面的白色環(huán)形絮狀物（富含單個(gè)核細(xì)胞），800 r/min 離心洗滌2次，5min/次，沉積細(xì)胞用含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1X109/L，接種于25 T的培養(yǎng) 瓶?jī)?nèi)，放置在37C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育72 h后更 換培養(yǎng)基，去除紅細(xì)胞及其他未貼壁細(xì)胞，以后視

19、細(xì)胞生長(zhǎng)情況平均三四天換液 1次。BMSCs成脂誘導(dǎo)分化：、對(duì)照組：BMSCs不作處理、成脂組：BMSCs+成脂誘導(dǎo)劑上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組三個(gè)重復(fù)孔，BMSCs鋪于六孔板（細(xì)胞爬片），細(xì) 胞融合達(dá)80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成脂組加入成脂誘導(dǎo)劑 （成脂肪誘導(dǎo)劑成分為10 -6 mol/L地塞米松+ 5x10 -4 mol/L IBMX+ 2x10 -4 mol/L 吲噪美辛+10g/m胰島素）3d換液1次，分化18d。待脂滴形成后，PBS緩沖液清 洗3次，10%中性甲醛固定10min，再用PBS緩沖液清洗2次，進(jìn)行油紅O染色，拍 照記錄。BMSCs成骨誘導(dǎo)分化：、對(duì)照組：BMS

20、Cs不作處理、成骨組：BMSCs+成骨誘導(dǎo)劑上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組三個(gè)重復(fù)孔，BMSCs鋪于六孔板（細(xì)胞爬片），細(xì) 胞融合達(dá)80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成骨組加入成骨誘導(dǎo)劑 （成骨誘導(dǎo)劑成分為10-8mol/L地塞米松+50四g/ml維生素C+ 10mmol/L。-甘油磷 酸鈉）。3d換液1次，分化21d，21d后用茜素紅染色，觀察結(jié)果并拍照。BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化：、對(duì)照組：BMSCs不作處理、成軟骨組：BMSCs+成軟骨誘導(dǎo)劑上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6個(gè)重復(fù)孔，每組3孔用于ICC，另3孔用于甲苯胺藍(lán) 染色。BMSCs鋪于六孔板（細(xì)胞爬片），細(xì)胞融合達(dá)80%以上后，棄去原培養(yǎng) 基

21、，更換新鮮培養(yǎng)基，成軟骨組加入成軟骨誘導(dǎo)劑（50四g/ml維生素C +100nmol/L 地塞米松+100四g/mL丙酮酸鈉+50mg/mL ITS +5.35四g/mL亞油酸+ 10ng/mLTGF-pi + 1.25ng/mL BSA），培養(yǎng)3周后進(jìn)行II型膠原免疫組化（ICC）， 取另3孔進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。（參考文獻(xiàn)：人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及向軟骨細(xì)胞的分化）11、人黑素細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定取健康兒童包皮環(huán)切術(shù)標(biāo)本，經(jīng)75%乙醇浸泡10min后，用含高濃度青霉素/ 鏈霉素的生理鹽水反復(fù)沖洗，剪去皮下組織，修剪為5mmX10mm的細(xì)條。用 Dispase II酶37 C消化12h，分離表、真皮。獲取的表皮加入0.1%胰酶（含 0.53mmol/L EDT