內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡途徑在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)MUTZ1細(xì)胞凋亡過(guò)程中的

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相干的凋亡途徑在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡歷程中的胡潔何冬花高良楊春虎蔡真【摘要】本研究探究高三尖杉酯堿(Hharringtnine,HHT)誘導(dǎo)人DS細(xì)胞株UTZ-1細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。以HHT處置懲罰骨髓增生非常綜合征細(xì)胞株UTZ-1DS-RAEB,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和線粒體膜電位變革，應(yīng)用RT-PR檢測(cè)HHT處置懲罰前后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)的基因HP,BIP,XBP1的表達(dá)環(huán)境。效果表白：0.05g/lHHT作用UTZ-1細(xì)胞的凋亡率隨著時(shí)間的延伸而增長(zhǎng)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.01；激光共聚焦效果表現(xiàn)，0.05g/lHHT作

2、用后4小時(shí)胞漿內(nèi)a2+濃度增高，12小時(shí)達(dá)岑嶺，厥后開始落落；HHT作用后線粒體膜電位連續(xù)落落；HP以及BIP,XBP1基因表達(dá)加強(qiáng)，12小時(shí)到達(dá)岑嶺，厥后開始落落。結(jié)論:HHT可以誘導(dǎo)DS細(xì)胞株UTZ-1凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相干的凋亡途徑在此中發(fā)揮了緊張的作用?！娟P(guān)鍵詞】高三尖杉酯堿；DS細(xì)胞株UTZ-1；細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激RlefEndplasiRetiuluPathayinApptsisfDSellsInduedbyHharringtnineKeyrdshharringtnine;UTZ-1ell;apptsis;ERstress骨髓增生非常綜合征DS是一組異質(zhì)性的造血干細(xì)胞疾病，病理生理學(xué)改

3、變?yōu)樵煅绑w細(xì)胞成熟停滯和過(guò)分增殖，易于向白血病轉(zhuǎn)化1,2,其發(fā)病和治療機(jī)制是如今臨床研究的熱門。高三尖杉酯堿(HHT)是我國(guó)自主研制樂(lè)成的高效抗白血病藥物3，臨床上用來(lái)治療DS獲得必然的療效，本研究組前期事情表白HHT重要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗白血病作用4,我們進(jìn)一步研究表白，在此歷程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮了緊張的作用。質(zhì)料和要領(lǐng)重要試劑HHT(1g/l)購(gòu)自杭州民生藥廠，在利用之前用RPI1640RPI1640干粉購(gòu)自Gib公司稀釋至所需濃度。Flu3/A購(gòu)自美國(guó)Bitu公司，J-1購(gòu)自Siga公司，Annexin-V/PI,it-traker,ER-traker購(gòu)自leularprbe公司，鼠抗人

4、熒光二抗購(gòu)自ellsignal公司。細(xì)胞造就人DS細(xì)胞系UTZ-1引自德國(guó)BraushEig細(xì)胞中央5;在5%2、37條件下,于含10%胎牛血清、100U/l青霉素、100g/l鏈霉素的RPI1640造就液中造就傳代,實(shí)行用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生恒久。細(xì)胞凋亡的測(cè)定接納流式細(xì)胞術(shù)舉行AnnexinV/PI雙標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟測(cè)定。取經(jīng)HHT處置懲罰后的各組細(xì)胞，調(diào)解濃度為2.0105/l，參加AnnexinV/FIT5l和PI0.5l，室溫避光30分鐘，用PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變革的共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)6網(wǎng)絡(luò)處置懲罰后的各組細(xì)胞，用奇怪造就液調(diào)解細(xì)胞密度為2106/l，參加fl

5、u3/A終濃度為5l/L,37下避光溫育35分鐘，Hanks液洗滌2次。用Laia-TSSP激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣舉行檢測(cè)，引發(fā)波長(zhǎng)為488n,發(fā)射光為527n。線粒體膜電勢(shì)變革的共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)7J-1為一種特異性的陽(yáng)離子熒光染料,可定位在線粒體膜上,其引發(fā)光為490n,單體發(fā)射光為527n,多聚體發(fā)射光為590n,其聚攏程度與膜電位成正比。當(dāng)線粒體膜電位增高時(shí),赤色熒光加強(qiáng),赤色熒光和綠色熒光的比值可代表膜電位的凹凸。網(wǎng)絡(luò)差異處置懲罰組的細(xì)胞,用奇怪造就液調(diào)解細(xì)胞密度為2106/l，然后與10g/lJ-137負(fù)載30分鐘,PBS洗2次后用共聚焦顯微鏡檢測(cè)。以赤色熒光值與綠色

6、熒光值的比值的巨細(xì)來(lái)表現(xiàn)膜電位的凹凸。凋亡前因子HP基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊卵白質(zhì)基因BIP,XBP1RNA表達(dá)程度的RT-PR檢測(cè)引物：HP357bp上游5-AGTATTGTTT-TTTG-3，卑劣5-GGTGAGATTAATTGG-3；BIP(231bp)上游5-ATAGGTTATGTG-3；卑劣5-TTTTTTAT-3；XBP1(441bp)上游5-TTGTAGTTGAGAAAGG-3，卑劣5-GGGGTTGGTATATATGTGG-3；-atin(619bp)上游:5-GTGGTGGTGTGAA-3，卑劣:5-GTAGAGATTTGT-3。反響條件：943分鐘；9430秒;5830秒;724

7、5分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72延伸10分鐘。PR產(chǎn)物用1.5%的凝膠電泳，紫外燈下不雅察并照相。統(tǒng)計(jì)學(xué)處置懲罰數(shù)據(jù)用SD表現(xiàn),用SPSS12.0闡發(fā)，P0.05表現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P0.01表現(xiàn)有明顯意義。效果細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)效果0.05g/lHHT作用后0，6,12及24小時(shí)UTZ-1細(xì)胞的凋亡率別離為0.630.59，5.071.38，10.215.79，22.526.55，凋亡率隨著時(shí)間的延伸而增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.01(圖1A、B)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變0.05g/lHHT作用4小時(shí)后,UTZ-1造就細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度即顯著增長(zhǎng)，12小時(shí)達(dá)岑嶺，厥后開始落落。統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)資料表

8、白,參加HHT后的UTZ-1造就細(xì)胞內(nèi)的a2+i與空缺比擬組比擬有明顯性差異(P0.01)(表1，圖2)。Table1.Flu-3/AfluresenefUTZ-1ellstreatedithHHT(略)細(xì)胞膜電位的變革正常UTZ-1細(xì)胞的外貌大多呈勻稱的橙赤色,表現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞較少;而顛末HHT處置懲罰的細(xì)胞胞體增大、綠色熒光加強(qiáng),表白細(xì)胞受到損傷其線粒體膜電位有所落落。HHT處置懲罰后細(xì)胞紅、綠熒光值的比值和正常比擬組比力4小時(shí)后開始落落，8小時(shí)后較為顯著，48小時(shí)后細(xì)胞凋亡測(cè)不出。統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)表白0.05g/lHHT作用8小時(shí)后的UTZ-1造就細(xì)胞與空缺比擬組比擬差異具有明顯性意義(P0

9、.01)(表2，圖3)。Table2.Dynaihangefithndrialebraneptential()inUTZ-1ellstreatedithHHT(略)凋亡相干基因RT-PR效果UTZ-1細(xì)胞靜息狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相干基因HP基因不表達(dá)，BIP,XBP1基因少量表達(dá)，0.050g/lHHT作用4小時(shí)后即開始表達(dá)加強(qiáng)，12小時(shí)達(dá)岑嶺，24小時(shí)表達(dá)量落落，48小時(shí)測(cè)不出，各組與空缺比擬組比擬力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.01(圖4A、B)。討論高三尖杉酯堿(HHT)是我國(guó)自主研制樂(lè)成的高效抗白血病藥物，重要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,其確切機(jī)制是如今研究的熱門。本實(shí)行應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U

10、TZ-1細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，且HHT引起UTZ-1細(xì)胞凋亡是時(shí)間依靠性的。我們進(jìn)一步研究創(chuàng)造內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在其凋亡歷程中也發(fā)揮了緊張的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相干細(xì)胞凋亡是差異于受體介導(dǎo)(TNFR,Fas)或線粒體介導(dǎo)DNA損傷的另一種新的細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞凋亡相接洽表如今兩個(gè)方面；一是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)a2+的調(diào)控，二是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反響。大量實(shí)行表白，許多細(xì)胞在凋亡早期會(huì)出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)a2+濃度敏捷連續(xù)的升高，這種濃度升高泉源于細(xì)胞外a2+的內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(kù)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的開釋。相對(duì)高濃度的a2+一方面可以激活胞質(zhì)中的鈣依靠性卵白酶如鈣卵白酶alpain，另一方面可以作用于線粒體，影響其通透性的改變，進(jìn)而促進(jìn)凋亡9，10。本研究以

11、Flu-3/A為指示劑,接納激光掃描共聚焦顯微鏡法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離a2+,效果創(chuàng)造人UTZ-1細(xì)胞受HHT作用后4小時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度開始增長(zhǎng),8小時(shí)后增高更為明顯,12小時(shí)達(dá)岑嶺，厥后開始落落，但仍高于靜息狀態(tài)，表白HHT作用后出現(xiàn)鈣超載。本研究同時(shí)也以J-1作為指示劑，用激光掃描共聚焦顯微鏡法測(cè)定用藥前后細(xì)胞線粒體膜電位的改變，效果表現(xiàn)用藥后，線粒體膜電位連續(xù)落落。因此我們推測(cè)HHT作用于UTZ-1細(xì)胞，引起UTZ-1細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的早期升高，但終極導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭，線粒體膜電位的連續(xù)落落，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊卵白質(zhì)聚攏就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子朋友基因表達(dá)激活，當(dāng)未折疊卵白質(zhì)過(guò)分聚攏釀成有毒性時(shí)就會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。信號(hào)重要通過(guò)aspase-12下傳。鈣卵白激酶HP(/EBPhlgusprtEin)基因也到場(chǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反響誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡11-12。我們的效果表白，0.05