植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-浙江農(nóng)林大學(xué)

1、植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)主編胡君艷陳國(guó)娟張汝民浙江農(nóng)林大學(xué)植物學(xué)科2013年8月實(shí)驗(yàn)一植物組織水勢(shì)的測(cè)定水勢(shì)與滲透勢(shì)的測(cè)定方法可分為3大類：液相平衡法，包括小液流法、重量法測(cè)水 勢(shì)，質(zhì)壁分離法測(cè)滲透勢(shì)；壓力平衡法（壓力室法測(cè)水勢(shì)）；（3）氣相平衡法，包括熱電 偶濕度計(jì)法、露點(diǎn)法等。I小液流法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私獠捎眯∫毫鞣y(cè)定植物組織水勢(shì)的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】水勢(shì)表示水分的化學(xué)勢(shì)，像電流由高電位處流向低電位處一樣，水從水勢(shì)高處流向低處。 植物體細(xì)胞之間，組織之間以及植物體和環(huán)境間的水分移動(dòng)方向都由水勢(shì)差決定。當(dāng)植物細(xì)胞或組織放在外界溶液中時(shí)，如果植物的水勢(shì)小于溶液的滲透勢(shì)（溶質(zhì)勢(shì)）， 則組織吸水而使溶液濃

2、度變大；反之，則植物細(xì)胞內(nèi)水分外流而使溶液濃度變?。蝗糁参锝M 織的水勢(shì)與溶液的滲透勢(shì)相等，則二者水分保持動(dòng)態(tài)平衡，所以外部溶液濃度不變，而溶液 的滲透勢(shì)即等于所測(cè)植物的水勢(shì)?？梢岳萌芤旱臐舛炔煌浔戎匾膊煌脑韥?lái)測(cè)定試驗(yàn) 前后溶液的濃度變化，然后根據(jù)公式計(jì)算滲透勢(shì)?！緦?shí)驗(yàn)器材與試劑】實(shí)驗(yàn)材料：八角金盤、大葉黃楊等。實(shí)驗(yàn)試劑：0.05、0.10、0.15、0.20、0.30molL-i蔗糖溶液、甲烯藍(lán)溶液。實(shí)驗(yàn)儀器：試管10支、微量注射器、鑷子、打孔器、墊板?！緦?shí)驗(yàn)步驟】取干燥潔凈的試管5支為甲組，標(biāo)記15，各支中分別加入0.050.30molL-1蔗糖溶 液5mL。另取5支干燥潔凈的試管為

3、乙組，標(biāo)記15，各試管中分別加入0.050.30moLL-1 蔗糖溶液2ml。取待測(cè)樣品的功能葉數(shù)片，用打孔器打取小圓片約50片（避開(kāi)葉脈），混合均勻。用 鑷子分別夾入10個(gè)小圓片到乙組試管中。并使葉圓片全部浸沒(méi)于溶液中。放置約3060min， 為加速水分平衡，應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)試管。到時(shí)間后，在乙組試管中加入甲烯藍(lán)溶液12滴，并用微量注射器取各試管糖液少許， 將注射器插入對(duì)應(yīng)濃度甲組試管溶液中部，小心地放出一滴藍(lán)色溶液，并觀察藍(lán)色小液流的 升降動(dòng)向。若小液流上升，說(shuō)明浸過(guò)小圓片的蔗糖溶液濃度變?。粗参锝M織失水），表明葉片 組織的水勢(shì)高于該濃度糖溶液的滲透勢(shì);如果藍(lán)色液流下降則說(shuō)明葉片組織的水勢(shì)低于

4、該糖 溶液的滲透勢(shì)；若藍(lán)色液流靜止不動(dòng)，則說(shuō)明葉片組織的水勢(shì)等于該糖溶液的滲透勢(shì)，此糖 溶液的濃度即為葉片組織的等滲濃度。計(jì)算：記錄液流不動(dòng)的試管中蔗糖溶液的濃度。如無(wú)，則以小液流向上、向下移動(dòng)的 兩個(gè)臨界濃度的平均值代入下列公式計(jì)算組織的水勢(shì)。Ww=Wn=CRTi式中：Ww植物組織的水勢(shì)（單位MPa）Wn溶液的滲透勢(shì)C等滲濃度（mol-L-i）R氣體常數(shù)（0.008314LMPamol-iK-i）T絕對(duì)溫度，即273C+t，t為實(shí)驗(yàn)溫度i解離系數(shù)（蔗糖=1，CaCl2=2.60）【注意事項(xiàng)】所取材料部位，組織大小要一致，不要取有傷口的葉片。蔗糖溶液用前要搖勻，因?yàn)闀r(shí)間放長(zhǎng)的蔗糖溶液會(huì)分層，影

5、響結(jié)果。微量注射器的針頭從試管抽出時(shí)要緩慢，以免溶液振動(dòng)，影響藍(lán)色液流的運(yùn)動(dòng)?！舅伎碱}】測(cè)定同一植物上部及下部葉片的水勢(shì)有何差別？了解測(cè)定植物組織水勢(shì)的其他方法，請(qǐng)簡(jiǎn)單描述一種？實(shí)驗(yàn)二植物葉片葉綠素含量的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹咳~綠素是光合作用的主要色素，其含量與光合作用密切相關(guān)，是反映葉片生理狀態(tài)的重 要指標(biāo)，葉綠素含量也是指導(dǎo)作物栽培生產(chǎn)和選育作物品種的重要指標(biāo)。葉綠素a、b含量 測(cè)定在植物光合生理、發(fā)育生理和抗性生理研究中有重要意義。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握葉綠素含 量的測(cè)定和計(jì)算方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其光 密度，即可用公式計(jì)算出提取液

6、中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的光密 度D與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：D=kCL式中：k為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，k為該物質(zhì) 的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì) 在不同波長(zhǎng)下的光密度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總光密度等于各組分在相應(yīng)波 長(zhǎng)下光密度的總和，這就是光密度的加和性。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和 類胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的光密度D，并根據(jù)葉綠素a、b 及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠

7、素a、b時(shí)為了排除類 胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又 知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27,在波長(zhǎng)645nm 下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式： TOC o 1-5 h z D663= 82.04Ca+9.27CbD645 = 16.75Ca+45.60Cb（2）式（1）、（2）中的D663和D645為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm時(shí)的光密度，Ca、 Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg.L-

8、1為單位。解方程組（1）、（2），得：Ca = 12-72D663 - 2-59D645Cb = 22.88D645 - 4.67D663將Ca與Cb相加即得葉綠素總量（CT）：CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5）， 也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次光密度（D652）而求出葉綠素a、b總量： TOC o 1-5 h z CT=(D652 x 1000)/ 34.5(6)在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測(cè)定出溶液中類胡蘿卜素的含量。Lichtenthaler等對(duì)Arnon法進(jìn)行

9、了修正，提出了 80%丙酮提取液中三種色素含量的計(jì)算 公式：Ca= 12-21D663 - 2-81D646Cb = 20-13D646 - 5.03D663( 8)Cx.c= (1000D470 - 3.27Ca - 104Cb) / 229(9)式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cx.c為類胡蘿卜素的總濃度；D663、D646和 D470分別為葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)663nm、646nm和470nm下的光密度。由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)， 計(jì)算公式也有所不同。葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm， 類

10、胡蘿卜素為470nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式： TOC o 1-5 h z Ca = 13-95D665 - 6.8叫49(10)Cb = 24-96D649 - 7.32D665(11)Cx.c= (1000D470 - 2.05Ca - 114.8Cb) / 245(12)最后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量：葉綠素的含量mg.g-i)=葉綠 素的濃度x提取液體積x稀釋倍數(shù)/樣品鮮重(或干重)?！緦?shí)驗(yàn)器材與試劑】實(shí)驗(yàn)材料：新鮮綠色植物葉片。實(shí)驗(yàn)試劑：95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉末。實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平、研缽、試管、量筒、漏斗、分光光度計(jì)?！緦?shí)驗(yàn)步驟】取新鮮植物葉片，擦凈表面污物并去掉

11、中脈。用電子天平稱取0.51g葉片剪碎放入研缽中，加少量石英砂及碳酸鈣粉末及23mL 95%乙醇，研磨至勻漿，再加1015mL 95%乙醇，提取35min。上清液用濾紙過(guò)濾到25mL容量瓶中，用少量95%乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)詈?連同殘?jiān)黄疬^(guò)濾(直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止)，最后用乙醇定容至25mL，搖勻。把葉綠體色素提取液(可根據(jù)溶液濃度適當(dāng)稀釋)倒入光徑1cm的比色杯中。以95% 乙醇為空白，用分光光度計(jì)分別測(cè)定D665和D649值，并根據(jù)公式計(jì)算葉綠素a、b含量及葉 綠素總含量，及每克鮮重(或干重)的含量。【注意事項(xiàng)】光合色素在光下容易分解，操作時(shí)應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，并且研磨時(shí)間

12、應(yīng)盡量短。提取液不能混濁，否則要用離心機(jī)離心后才能比色。注意在用不同的提取液提取光合色素時(shí)，要選用不同的吸收波長(zhǎng)及對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式， 不能混用，否則計(jì)算結(jié)果會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重偏差?！舅伎碱}】測(cè)定葉綠素含量時(shí)為什么要選用紅光區(qū)的吸收峰而不選用藍(lán)紫光區(qū)的吸收峰？試比較陰生植物和陽(yáng)生植物的葉綠素a、b的比值有何不同？用不含水的有機(jī)溶劑如無(wú)水乙醇、無(wú)水丙酮等提取植物材料特別是干材料的葉綠體色 素往往效果不佳，原因何在？實(shí)驗(yàn)三高低溫脅迫對(duì)質(zhì)膜透性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沼秒妼?dǎo)儀法測(cè)定植物質(zhì)膜透性的原理及方法;根據(jù)質(zhì)膜透性大小判斷植物遭受傷害 的程度?！緦?shí)驗(yàn)原理】植物細(xì)胞質(zhì)膜具有獨(dú)特的選擇透性，正常情況下，植物細(xì)胞與

13、外界環(huán)境之間的一切物質(zhì) 交換都必須經(jīng)過(guò)質(zhì)膜。測(cè)定質(zhì)膜透性最常用的方法是測(cè)定細(xì)胞外液的電導(dǎo)率變化。當(dāng)植物處 于逆境（高溫、低溫、干旱、鹽漬、病害等）下時(shí)，不良環(huán)境因素首先作用于質(zhì)膜，使質(zhì)膜 受到損傷，膜透性增大。將受脅迫的植物組織浸入去離子水中，電解質(zhì)外滲，水的電導(dǎo)率增 大。因此可用電導(dǎo)儀通過(guò)測(cè)定細(xì)胞外液的電導(dǎo)率變化來(lái)測(cè)定質(zhì)膜透性的變化?！緦?shí)驗(yàn)器材與試劑】實(shí)驗(yàn)材料：女貞、茶梅等植物葉片。實(shí)驗(yàn)試劑：去離子水實(shí)驗(yàn)儀器：電導(dǎo)儀、電子天平、打孔器、小燒杯、真空干燥器、真空泵、電爐、量筒 等?！緦?shí)驗(yàn)步驟】選取植株上相同部位的葉片，用紗布擦凈后分別進(jìn)行以下處理：低溫處理將帶葉枝條置于-18C冰箱中冷凍30m

14、in。高溫處理將帶葉枝條置于50C的人工氣候箱中處理30min。常溫處理將帶葉枝條插在水中，置于室溫作為對(duì)照。分別取出處理材料，吸去表面水分后用打孔器打下葉圓片20枚，放在干凈燒杯中， 加去離子水20mL，使葉圓片浸于水中（盡量勿使葉片疊在一起）。將燒杯放入真空干燥箱中，用真空泵抽氣10min，抽出細(xì)胞間隙的空氣，然后緩緩放 入空氣，水滲入細(xì)胞間隙，葉片變成半透明狀下沉（此步可省略）。將燒杯取出于室溫放置0.51h，期間注意多次搖動(dòng)。用電導(dǎo)儀測(cè)定各組的初電導(dǎo)率（S）。將燒杯再放入100C沸水浴中處理15min殺死植物組織。取出后冷卻至室溫，分別測(cè) 定其終電導(dǎo)率（s2）。同時(shí)測(cè)定去離子水的電導(dǎo)率

15、作為空白電導(dǎo)率（S0）。根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。相對(duì)電導(dǎo)率表示與質(zhì)膜完全通透（細(xì)胞被煮沸殺死）相比，質(zhì)膜受破壞的程度（質(zhì)膜相對(duì)透性）。相對(duì)電導(dǎo)率（%） =（S-S0）/ （S2-S0）X100%由于在室溫（或正常生長(zhǎng)溫度）下，植物細(xì)胞（對(duì)照）也有少量電解質(zhì)外滲。與對(duì)照相 比，質(zhì)膜受破壞的程度通常以組織細(xì)胞的傷害度（電解質(zhì)滲出率）來(lái)表示。傷害度（%） = （Lt-Lck）/ （1-Lck）X100%式中：Lt脅迫處理的相對(duì)電導(dǎo)率；Lck一對(duì)照的相對(duì)電導(dǎo)率?！咀⒁馐马?xiàng)】整個(gè)過(guò)程中，葉片接觸的用具必須絕對(duì)潔凈，也不要用手直接接觸葉片，以免污染。使用電導(dǎo)儀時(shí)每測(cè)完一個(gè)樣液后，應(yīng)用蒸餾水清洗電極，再用濾

16、紙擦干，然后進(jìn)行下 一個(gè)樣液的測(cè)定?！舅伎碱}】試比較不同處理的植物細(xì)胞透性的變化情況，記錄結(jié)果，并加以解釋。在采用電導(dǎo)儀法測(cè)定質(zhì)膜透性過(guò)程中，哪些因素會(huì)影響測(cè)定結(jié)果？實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意哪些 問(wèn)題？質(zhì)膜透性變化的大小與抗逆性的強(qiáng)弱有何關(guān)系？質(zhì)膜透性變化與脅迫程度有何關(guān) 系？實(shí)驗(yàn)四植物葉片光合速率的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私饧t外線CO2分析法測(cè)定葉片光合速率的原理;掌握用LI-6400光合儀測(cè)定葉片光合 參數(shù)的步驟和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】光合速率測(cè)定是植物生理學(xué)的基本研究方法之一，在作物生理生態(tài)、新品種選育、光合 作用基本理論研究方面都有著廣泛的用途。最常用的方法有：改良半葉法，紅外線CO2分 析法和氧電極法。植

17、物葉片的光合速率可以用單位葉面積單位時(shí)間里同化CO2的數(shù)量來(lái)表 示。根據(jù)光合作用的總反應(yīng)式：CO2+2H2O一（CH2O）+02。光合速率原則上可以用任何一 反應(yīng)物消耗速度或生成物的產(chǎn)生速度來(lái)表示。但由于植物體內(nèi)水分含量很高，而且水參與的 生化反應(yīng)又特多，所以體內(nèi)水分含量經(jīng)常變動(dòng)，不適于用水的含量變化來(lái)測(cè)定光合速率。因 此，我們?cè)趯?shí)際測(cè)定中常常通過(guò)測(cè)定CO2的減少（紅外線CO2分析法）或O2增加（氧電極 法）來(lái)表示光合速率。紅外線CO2氣體分析儀（IRGA）工作原理：許多由異原子組成的氣體分子如CO2、H2O 等對(duì)紅外線都有特異的吸收帶CO2的紅外吸收帶有4處，其吸收峰分別在2.69、2.77

18、、4.26|im 和14.99pm處，其中只有4.26pm的吸收帶不與H2O的吸收帶重疊，紅外儀內(nèi)設(shè)置僅讓4.26pm 紅外光通過(guò)濾光片，當(dāng)該波長(zhǎng)的紅外光經(jīng)過(guò)含有CO2的氣體時(shí)，能量就因co2的吸收而降 低，降低的多少與C02的濃度有關(guān)，并服從朗伯-比爾（Lambert-beer）定律。紅外儀的檢測(cè) 器便可通過(guò)檢測(cè)紅外光能量的變化而輸出反應(yīng)C02濃度的電信號(hào)。把植物葉片放入葉室， 通過(guò)測(cè)定照光（或遮光）條件下葉室進(jìn)出口之間的C02濃度差，根據(jù)葉片面積，就可以計(jì)圖10-1 LI-6400光合作用測(cè)定系統(tǒng)算光合（呼吸）速率。LI-6400系列光合儀（圖10-1） 是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最多、穩(wěn)定性最好的

19、便攜式光合作 用測(cè)量系統(tǒng)。其開(kāi)路式系統(tǒng)，保證了葉室內(nèi)外環(huán)境條 件的一致與同步變化，同時(shí)保證了被測(cè)量葉片的環(huán)境 因子的穩(wěn)定；可自動(dòng)或手動(dòng)控制葉室內(nèi)部的環(huán)境條件， 具有多個(gè)自動(dòng)測(cè)量程序，如光響應(yīng)曲線、C02響應(yīng)曲 線、光誘導(dǎo)曲線、光呼吸曲線、熒光co2響應(yīng)曲線、 熒光光響應(yīng)曲線、熒光動(dòng)力學(xué)曲線、熒光循環(huán)曲線等。多年的實(shí)踐表明，即使在野外惡劣的環(huán)境條件下，LI-6400系列光合儀的分析器和傳感器依 然能夠保持強(qiáng)大的功能和高可靠性?！緦?shí)驗(yàn)器材與試劑】實(shí)驗(yàn)材料：植物連體葉片。實(shí)驗(yàn)試劑：干燥劑、CaCl2。實(shí)驗(yàn)儀器：LI-6400光合作用測(cè)定儀。【實(shí)驗(yàn)步驟】硬件連接用電纜管線將主機(jī)和分析器頭連接，除去外置

20、光量子傳感器紅色蓋帽，在進(jìn)氣口 （Inlet） 連接上緩沖瓶。開(kāi)機(jī)打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)啟動(dòng)LI-6400，儀器初始化后，顯示配置選擇界面，請(qǐng)選擇相應(yīng)的葉室配 置，按enter進(jìn)入。隨后儀器顯示Ts the Chamber/IRGA connected? （Y/N）”，選擇Y，系統(tǒng)即 進(jìn)入主界面。儀器預(yù)熱10min或更長(zhǎng)時(shí)間按F3進(jìn)入測(cè)量子菜單（New Measurement）。檢查h行參數(shù)溫度（Tblock、Tair和Tleaf） 數(shù)值是否正常，檢查光源、g行（Parlnm和ParOutm）數(shù)值是否正常，檢查流量控制（1行 菜單下按F2），設(shè)定1000，檢查是否能升到700以上。預(yù)熱后檢查及調(diào)零保證空葉室且關(guān)閉，使用新鮮的堿石灰和干燥劑，將化學(xué)管全部旋轉(zhuǎn)到完全Scrub狀態(tài)。 檢查是否漏氣（在葉室周圍吹氣，CO2_S變化是否超過(guò)1Mmol-mol-1）o檢查a行CO2是否能 降到土5pmolmol-1、H2O是否能降到0.5mmolmol-1。如達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，按F3進(jìn)入Calib Menu 界面，按上下箭，選擇IRGA Zero，enter。按Y繼續(xù)。只校準(zhǔn)CO2，則按F1（Auto CO2）； 只校準(zhǔn)H2O，則按F2（Auto H2O）；兩個(gè)都校準(zhǔn)，則按F3（Auto All），當(dāng)CO2穩(wěn)定在1以 內(nèi)，H2O穩(wěn)定在0.1以內(nèi)