臨床pcr檢驗標(biāo)本的采集、處理、保存及核酸

1、臨床PCR檢驗標(biāo)本的采集、處理、保存及核酸提取方法江西省腫瘤醫(yī)院 陳文學(xué)檢驗誤差的發(fā)生率1997年，一位意大利著名檢驗專家對急診檢驗誤差發(fā)生的種類和發(fā)生率進(jìn)行了統(tǒng)計。結(jié)果顯示，約有68.2%的檢驗誤差發(fā)生在檢驗前期，而來自檢驗中期和檢驗后期的誤差率分別為13.3%和18.5%。2007年，這位專家又進(jìn)行了類似的統(tǒng)計，結(jié)果顯示，檢驗前期的誤差發(fā)生率仍高達(dá)61.9%正確采集、運送、保存臨床標(biāo)本的重要性質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一核酸提取的重要性核酸提取是臨床PCR檢驗最為關(guān)鍵的局部核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗的正確與否臨床PCR檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)標(biāo)本采集標(biāo)

2、本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響過早或過晚都可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果 標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備適度消毒 標(biāo)本的類型和采集量 衣原體 上皮細(xì)胞采樣質(zhì)量的評價評價方法：肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化學(xué)分析 采樣及運輸容器一次性無菌器材,防腐劑,抗凝劑 標(biāo)本采集中的防污染一次性無菌容器，防止混入操作者頭發(fā)，表皮等，如玻璃容器要高壓滅菌 標(biāo)本運送 樣本一經(jīng)采集，那么應(yīng)盡可能快的送至檢測實驗室。樣本中如參加了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測定參加GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,那么可在室溫下運送或郵寄。實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。臨床標(biāo)本的處理和保存血清

3、漿全血外周血單個核細(xì)胞痰棉拭子膿液體液乳汁組織血清漿DNA測定，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對測定影響不大。RNA測定，標(biāo)本的獲取和保存方式對測定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴(yán)禁使用肝素，因其對PCR擴增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除)全血標(biāo)本，抗凝后6小時內(nèi)別離血漿，如使用血清標(biāo)本，那么需盡快(2小時內(nèi))別離血清，標(biāo)本的短期12周保存可在-20下，較長期保存應(yīng)在-70下。 全血以全血作為待測標(biāo)本時,必須注意抗凝劑的選擇,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測,可4下短期保存,如用于RNA檢測，那么應(yīng)在取血后，盡快提取RNA

4、 。外周血單個核細(xì)胞 外周血單個核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞別離液別離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液,裂解全血中的紅細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌,即可得到單個核細(xì)胞。外周血單個核細(xì)胞如暫不提取核酸,可保存于-70下.痰痰屬于分泌物,臨床上常用作為結(jié)核桿菌DNA測定標(biāo)本。痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì),故在核酸提取時,需對樣本進(jìn)行初步處理，即用1 mol/L NaOH或變性劑液化。如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取,可保存于-70下

5、。痰標(biāo)本處理的根本模式通用模式簡單模式痰標(biāo)本處理通用模式1通用標(biāo)本處理Universal sample processing, USP溶液： 4-6 mol/L鹽酸胍GuHCl 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸鈉Sarkosyl 0.10.2 mol/L -巰基乙醇。20.05%Tween 80。310%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)一定體積的痰1.5倍體積的USP溶液,震蕩30-40s10-15ml蒸餾水，室溫放置5-10min5000g室溫離心10-15min

6、，棄上清500ul無菌0.05%Tween80溶解或重懸20000g室溫離心10-15min，棄上清加入5倍10%chelex-100，混勻，90溫育40min20000g室溫離心5min取5ul用于PCR擴增痰標(biāo)本處理簡單模式 試劑：1裂解液:含終濃度0.1 mol/L NaOH、50g蛋白酶K和0.05% Triton X-10050ul痰6000g離心10分鐘，棄上清加入裂解液50ul，60溫育30min90溫育30min加入Tris-HCl中和以上反應(yīng)混合物取5ul用于PCR檢測痰標(biāo)本處理中要注意的問題痰標(biāo)本在沒有參加內(nèi)標(biāo)以控制假陰性的情況下，不能采用異硫氰酸胍鹽GuSCN方法提取。采

7、用這種方法提取，有可能會在提取過程中，出現(xiàn)一種可修飾DNA的酶，在最后一步提取中，與核酸一起洗提出來，從而抑制其后的擴增。在PCR主反響混合液中，參加-酪蛋白alpha-casein、白蛋白等，有防止此類抑制物產(chǎn)生的效果。 棉拭子在使用PCR方法檢測性病病原體時,臨床標(biāo)本一般為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置510分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清立即離心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,那么需保存于-70下.膿液膿液的處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測定的標(biāo)本,粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；

8、水樣的膿液那么直接離心,沉淀用生理鹽水洗23次后,即可用于DNA提取。對于用于非分枝桿菌測定的膿液標(biāo)本,如過于粘稠,那么參加適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清立即離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,那么按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標(biāo)本的保存條件同樣為-70。體液臨床體液標(biāo)本包括胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本的保存同上。乳汁 乳汁有時也可作為標(biāo)本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等的PCR檢測。 乳汁中分枝桿菌DNA的提取試劑準(zhǔn)備 裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA, 2%

9、 Triton X-100, 4 mol/L 異硫氰酸胍鹽GITC, 0.3 mol/L 醋酸鈉。 玻璃珠：直徑：425-600um乳汁標(biāo)本離心6000rpm，5min，棄上清脂質(zhì)和沉淀用750ul裂解液重懸重懸液移入含100mg玻璃珠離心管攪拌煮沸5min，離心14000rpm，3min650ul上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，等體積異丙醇沉淀70%乙醇洗滌沉淀，干燥50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR擴增組織 組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，參加生理鹽水后劇烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保

10、存于50%乙醇中,具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm的小片,參加適量的生理鹽水,然后,邊搖邊參加無水乙醇至終濃度為50%.這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日,4可保存6年。石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取。臨床標(biāo)本的濾紙上保存臨床標(biāo)本置于經(jīng)過處理的濾紙片上，如靶核酸為DNA，可室溫保存數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，那么可穩(wěn)定數(shù)周。 保存在濾紙上的標(biāo)本，保存時間長，還可因為標(biāo)本中的PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對后面的擴增檢測造成影響。 不管是全血、血清漿。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。

11、臨床標(biāo)本中PCR反響抑制物內(nèi)源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。 外源性的 :如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。 肝素的作用機理 肝素對MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQ DNA聚合酶均很強的抑制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，那么在核酸純化過程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。對標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。肝素的作用機理每g核酸標(biāo)本中參加0.1U的肝素,即可

12、100%的抑制酶活性。在標(biāo)本中參加肝素酶I 或13 U/g核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 2小時) 可去除肝素的抑制作用。血紅蛋白、乳鐵蛋白血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)的主要PCR抑制物,它們均含有鐵。抑制機制可能是：1與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關(guān)。研究鐵的抑制效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素Hemin等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。21%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性IgG IgG的抑制作用是由于其與單鏈DNA的相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用 使用煮

13、沸作為標(biāo)本處理方法或使用PCR前的熱啟動,將增強IgG對PCR反響的抑制 去除或減輕抑制的一些方法NaOH處理可中和臨床標(biāo)本中的Taq DNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于DNA含量低的標(biāo)本，因為NaOH處理可使DNA大量喪失。去除或減輕抑制的一些方法參加0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白BSA可降低血液對Taq DNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在2%vol/vol血液存在下亦可成功擴增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加Taq DNA聚合酶的擴增能力，使其對糞便和肉類標(biāo)本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20倍。單鏈DNA結(jié)合T4基因32蛋白gp32有類似BSA的增強效應(yīng)。核酸純化

14、核酸別離純化技術(shù)起源于二十世紀(jì)五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)的核酸沉淀溶解別離純化方法得到了普遍的應(yīng)用和推廣。傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。 一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測定的是病原微生物,那么靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,那么靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。 一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。核酸的別離純化 核酸的別離純化就是要將蛋白、

15、脂類等干擾核酸擴增的物質(zhì)去除。 經(jīng)典方法硅吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進(jìn)行評價。 DNA提取的經(jīng)典方法即所謂的酚-氯仿提取法 RNA提取的獨特性臨床標(biāo)本及實驗室環(huán)境中,存在大量對RNA具有強烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。如何防止RNase對標(biāo)本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在。 RNA提取所用器皿的處理經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等根本上無RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA. 實驗室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180干烤8

16、小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品。DEPC是RNase的強烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備 對于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿。可能的話,溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37至少處理12小時,然后于100加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15

17、分鐘。須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反響,因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液。RNA提取中RNase 污染的控制實驗操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。 策略是： 在準(zhǔn)備用于RNA純化的實驗材料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操作過程中,都應(yīng)戴一次性手套。 在RNA提取實驗中，應(yīng)勤換手套。RNA提取的常用方法 外表活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-酚提取法 核酸提取的改進(jìn)方法 旋轉(zhuǎn)離心柱SPIN COLUM

18、N方法玻璃粉吸附法 二氧化硅Se或硅藻吸附法 微量全血核酸提取法 ：NaI 方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自動核酸純化儀旋轉(zhuǎn)離心柱SPIN COLUMN屬于硅吸附方法的一種。在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€局部：1利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來2把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當(dāng)然這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力而對其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類那么不相親和也不吸附3把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來，從而得到純化的核酸。 玻璃粉吸附法 二氧化硅Se或硅藻吸附法 使用NaI的微量全血核酸提取法 全自動核酸純化儀雅培m2000系統(tǒng) 該

19、儀器主要由兩個機械臂和八個單道移液器構(gòu)成，將樣品放入樣品管中后，儀器就可以自開工作，利用磁珠法進(jìn)行核酸DNA/RNA提取。在樣品提取完成后，儀器還可以進(jìn)行PCR試劑混合步驟。根本上沒有手工的操作步驟 ，最大樣本量：96 全自動核酸純化儀美國貝克曼庫爾特 SPRI-TE小型化的自動提取：1-10個樣品 Vidiera NsP大型化的自動提取:96 樣本 全自動核酸純化儀QIAGEN公司生產(chǎn)的 BioRobot MDx Workstation的96通道自動化提取工作站 。全自動核酸純化儀此外還有羅氏推出的MagNA Pure LC 2.0 System ，金麥格自動核酸提取系統(tǒng) 。靶核酸提取的質(zhì)量

20、 純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標(biāo)準(zhǔn)比較測定。 核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測定。核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用病原體含量的溶血和/或脂血標(biāo)本用待評價試劑提取，然后進(jìn)行擴增檢測，比較所得到的結(jié)果 謝謝！一、標(biāo)本收集、運送、保存1、標(biāo)本收集 臨床基因擴增檢測實驗室對各種臨床標(biāo)本的收集應(yīng)按檢測要求建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并對臨床標(biāo)本采集人員培訓(xùn)。標(biāo)本采集的時間，應(yīng)在患者疾病開展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。 1標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備 標(biāo)本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其

21、它雜物，但應(yīng)適度，故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行。 2標(biāo)本的類型和采集量 標(biāo)本的類型 和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。如：定量PCR對結(jié)核分枝桿菌的檢測，應(yīng)選擇患者血腦脊液、胸腹水等標(biāo)本，不宜用痰標(biāo)本，因為痰中結(jié)核分枝桿菌分布不均。PCR檢測衣原體時，由于衣原體感染上皮細(xì)胞，因此取材一定要取到細(xì)胞，無論男女取材均應(yīng)用特制的拭子，男性應(yīng)進(jìn)入尿道2-3cm，女性應(yīng)進(jìn)入子宮頸口2cm并停留片刻后取出，在分泌物或尿沉渣中檢出的陽性率均較低。一般來說，如果樣本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，那么其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增檢測。 3采樣質(zhì)量的評價可通過幾個方面來評價標(biāo)本采集質(zhì)量，即細(xì)胞組成，所需類型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。評價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等。4標(biāo)本采集中的防污染 標(biāo)本采集最好采用一次性無菌器材，采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)