ELISA方法二、流式細(xì)胞分析法三、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)四

1、第十六章細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附因子的測(cè)定免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)第一節(jié)、生物學(xué)測(cè)定方法促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞增殖測(cè)定法1=1細(xì)胞毒活性測(cè)定法抗病毒活性測(cè)定法趨化活性測(cè)定法五、生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)第二節(jié)免疫測(cè)定方法一、ELISA方法二、流式細(xì)胞分析法酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)Rd第三節(jié)細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用一、臨床應(yīng)用原則:、特定疾病診斷的輔助指標(biāo)三、評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后思考題小結(jié)細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞及某些基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)并分泌的活性物質(zhì)，其主要生物學(xué)功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。細(xì)胞粘附因子是介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間粘附作用的分子，其化

2、學(xué)本質(zhì)為糖蛋白，可以細(xì)胞膜表面表達(dá)和可溶性兩種形式存在。第一節(jié)生物學(xué)測(cè)定方法生物學(xué)測(cè)定法分類1基于DNA檢測(cè)的分子生物學(xué)測(cè)定法:DNA擴(kuò)增法*RNA印跡法*原位雜交法核酸酶保護(hù)分析生物活性測(cè)定法生物活性測(cè)定法原理根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比測(cè)定，從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平，一般以活性單位(U/ml)表示刺激細(xì)胞增殖或集落形成的活性有助于細(xì)胞因子維持細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的特性檢測(cè)的活性作用抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或破壞細(xì)胞的效應(yīng)J促進(jìn)細(xì)胞趨化或抗病毒作用一、促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制測(cè)定法以細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞株為靶向，通過(guò)觀察特定的細(xì)胞因子刺激或抑制依賴性細(xì)胞株增殖來(lái)評(píng)估細(xì)

3、胞因子的活性水平O細(xì)胞增殖檢測(cè)方法分類A直接計(jì)數(shù)法簡(jiǎn)便、直觀，但費(fèi)時(shí)、主觀因素影響大、難以標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化A細(xì)胞代謝活性測(cè)定方法3H-TdR、125UdR摻入法或MTT等比色法A細(xì)胞代謝產(chǎn)物測(cè)定法代謝產(chǎn)物熒光強(qiáng)度測(cè)定法和指示細(xì)胞表面標(biāo)記或可溶性分子測(cè)定法(1)放射性核素?fù)饺敕ㄍㄟ^(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA合成的增加或減少來(lái)判斷細(xì)胞增殖的方法。在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，DNA合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核昔或堿基的需求增多，若將核昔標(biāo)記上可以示蹤的同位素(羽/1呵),通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細(xì)胞增殖的程度。結(jié)果客觀易于自動(dòng)化;方法的特異性受依賴細(xì)胞適用于大標(biāo)本量的測(cè)定株影響；放射性污染常見(jiàn)細(xì)胞因子陽(yáng)-TdR

4、摻入檢測(cè)法所需細(xì)胞及參考試驗(yàn)條件所需濃度（細(xì)胞數(shù)/ml）3H-TdR前培養(yǎng)時(shí)間3H-TdR后培養(yǎng)時(shí)間檢測(cè)細(xì)胞因子D10G4.12X1054818-20IL-1L9292X1055616IL-1CTLL-2105244-6IL-2FDC-P1,32DCL-275X104244-8IL-3CT.4S1052446IL-4CH125X103486IL-5B135X1043612IL-5T88-M1X1052412IL-5BCL1105726IL-5Clone-K,IXN/2bx105244-6IL-7TS13X10666IL-9T10105726IL-11UT-71.5X105726SCF（干細(xì)胞因

5、子）CCL-64*5X108728TGF-PDA3.15,IF5X104244-8GM-CSFM14/NES60.45X104244-8M-CSF/G-CSF(2)MTT比色法特點(diǎn)：不使用放射性核素，以細(xì)胞代謝變化為增殖指征指示細(xì)胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān)與同位素?fù)饺敕ㄏ啾葴y(cè)定步驟類似摻入物：MTT而非3H-TdR；反應(yīng)條件：選用的細(xì)胞及其濃度、培養(yǎng)時(shí)間不同細(xì)胞增殖或抑制活性檢測(cè)的MTT比色法常用靶細(xì)胞細(xì)胞株/原代細(xì)胞細(xì)胞終濃度（細(xì)胞數(shù)/ml）加入MTT前溫育時(shí)間（h）檢測(cè)細(xì)胞因子B9,MH60,BSF2,TTD15X10V2X10596/48IL-6B9-115X10496IL-11B

6、9-1-35X10496IL-13KYM-1D42X10372MV-3D95X103120TGF-BWEHI-164/clonel32X10372TNF32D/MpllOS1X10344L9292X1O556TNFCTLL-210522-24IL-2小鼠基質(zhì)細(xì)胞，32DCL-271.5X10572IL-3二、細(xì)胞毒活性測(cè)定法基本原理對(duì)指示細(xì)胞具有破壞作用的細(xì)胞因子，若與細(xì)胞共育將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，待測(cè)細(xì)胞因子作一系列稀釋后加至指示細(xì)胞培養(yǎng)體系，以檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的死細(xì)胞數(shù)作為判斷指標(biāo)，死細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞因子的活性呈正比。試驗(yàn)時(shí)，與細(xì)胞增殖或抑制方法一樣，以已知活性的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。死、活細(xì)

7、胞情況可用同位素5iCr釋放法判斷，或應(yīng)用臺(tái)盼蘭染色死細(xì)胞后直接計(jì)數(shù)。也可通過(guò)結(jié)晶紫、蔡酚藍(lán)黑、MTT、NBB等著染活細(xì)胞，再用脫色液脫出染料后酶標(biāo)儀比色測(cè)定吸光值。死細(xì)胞數(shù)、釋放量越高或比色測(cè)定的吸光值越低，表明待測(cè)細(xì)胞因子的細(xì)胞毒活性則越高。應(yīng)用系列稀釋的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，制作其活性與劑量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此作為待測(cè)品活性的定量測(cè)定的基礎(chǔ)。本法常用于TNF等的測(cè)定/Wish、Hep2/c/L929/Ratec/A549人干擾素小鼠干擾素大鼠干擾素/MDBK多種族的IFN-a和IFNy常用于攻擊細(xì)胞的病毒VSV、EMCV及Sindbisvims等A細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、A抑制病毒蝕斑形成或抑

8、制病毒的產(chǎn)量本法常用于IFN等的測(cè)定，IFN可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。細(xì)胞病變抑制法結(jié)果判斷舉例*/細(xì)胞病變程度分為5個(gè)等級(jí)，即:“0”，表示無(wú)明顯CPE；CPEW25%；CPE為2550%；“3+”，CPE為5075%；“4+”，CPE為75100%。根據(jù)病變程度找出CPEI50的標(biāo)本稀釋范圍,并以此計(jì)算出距離比例和確定IFN效價(jià)。標(biāo)本稀釋度log4兩孔平均CPE細(xì)胞病變抑制程度細(xì)胞病變抑制積累細(xì)胞病變積累細(xì)胞病變抑制率30416016/16(100%)40412012/12(100%)504808/8(100%)61.5

9、2.541.54/5.5(73%)72.51.51.541.5/5.5(27%)800080/8(0%)該法操作復(fù)雜、影響因素較多，在試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)所用的病毒進(jìn)行滴定。結(jié)果：CPEI50稀釋度介于4-6-4-7之間，距離比例為(73-50)/(73-27)=0.50,效價(jià)為46.5；同法計(jì)算IFN標(biāo)準(zhǔn)品的CPEI50稀釋度,將IFN效價(jià)換算成國(guó)際單位，IFN國(guó)際單位二樣品CPEL50的稀釋度/標(biāo)準(zhǔn)品CPEI50稀釋度X標(biāo)準(zhǔn)品的單位。四、趨化活性測(cè)定法趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)的方式A趨化性(chemotaxis)：誘導(dǎo)細(xì)胞向由固的國(guó)殍曜底冏趨化因子高濃度處作定向移動(dòng)的特性，可釆用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)

10、?；瘜W(xué)增活性(chemokinesis)：細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力的特性，可釆用瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)。五、生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾第二節(jié)免疫學(xué)測(cè)定法細(xì)胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過(guò)同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體）的水平。、ELISA方法ELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成ELISA的基本步驟,可作定性或定量分析。ELISA法不僅可以用于細(xì)胞因子檢測(cè),也可用于可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘附因子的測(cè)定根據(jù)抗

11、體性質(zhì)和特異性不同，夾心法ELISA可分為:1.PcAb與McAb夾心法2McAb與PcAb夾心法3.雙McAb夾心法4細(xì)胞、McAb夾心法ELISA特異、簡(jiǎn)便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理細(xì)胞因子測(cè)定的首選方法敏感性偏低不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。、流式細(xì)胞分析法流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附分子的檢測(cè)，通過(guò)特異性的熒光抗體染色，能簡(jiǎn)單、快速地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè),精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。1.分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞基本步驟2.細(xì)胞

12、固定封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)染色與分析使用流式細(xì)胞分析法，可以:區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群:Thl細(xì)胞IFN-丫Th2細(xì)胞IL-4A細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體:單克隆抗體技術(shù)直接或間接熒光抗體染色無(wú)需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉待測(cè)細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)三、聲聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT或ElisaSpot)基在包被有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，經(jīng)在有或無(wú)刺激物存本在的條件下培養(yǎng)，待測(cè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子于其周圍，原并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISA,理即在洗去細(xì)胞后視用于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法

13、。一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量相關(guān)四、免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：特異性高操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴細(xì)胞株影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。A缺點(diǎn)：所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系敏感性相對(duì)較低標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合第三節(jié)細(xì)胞因子與細(xì)胞粘附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用細(xì)胞因子的測(cè)定主要應(yīng)用于:A特定疾病的輔助診斷A機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)估A臨床疾病治療效果的監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)用藥一、臨床應(yīng)用原則細(xì)胞因子和粘附分子的異質(zhì)性、功能交叉性和多樣性、來(lái)源的復(fù)雜性和組織細(xì)

14、胞的非特異性，決定了在進(jìn)行這些分子檢測(cè)時(shí)，必須對(duì)方法選擇和結(jié)果判斷作出綜合考慮。（一）方法的聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子的檢測(cè)方法多種多樣,各有利弊。高敏感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理活性測(cè)定方法：定性試驗(yàn)基因分析法：利于細(xì)胞內(nèi)定位分析、操作煩瑣（二）標(biāo)本的適當(dāng)選取A常用臨床標(biāo)本：抗凝全血，并分離獲得單個(gè)核細(xì)胞A炎癥局部細(xì)胞因子的水平：局部分泌液A細(xì)胞因子或粘附分子的細(xì)胞內(nèi)定位檢測(cè)：相應(yīng)細(xì)胞A相應(yīng)細(xì)胞因子的基因和mRNA表達(dá)：相應(yīng)細(xì)胞A療效觀察和預(yù)后判斷：疾病急性期和恢復(fù)期雙份標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)A免疫熒光染色和流式細(xì)胞分析：注意待檢細(xì)胞的活性和狀態(tài)，以保證結(jié)果的特異性（三）細(xì)胞因子的聯(lián)合檢測(cè)細(xì)胞因子具

15、有網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的狀調(diào)節(jié)的特點(diǎn)級(jí)聯(lián)效應(yīng)或相互抑制作用的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。有助于提供有效的疾病診斷和機(jī)體免疫狀態(tài)信息T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的功能：IL-1、IL-2、IFN-丫和GM-CSFThl/Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)：IL-2、IL-4、IL-10和IFN-丫二、特定疾病診斷的輔助指標(biāo)（一）細(xì)胞因子檢測(cè)在特定疾病診斷中的意義.許多疾病過(guò)程均可出現(xiàn)粘附分子和細(xì)胞因子表達(dá)的異常改變，高表達(dá)、低表達(dá)或是缺陷均可與某些特定疾病密切關(guān)聯(lián)，同時(shí)還可反映疾病的進(jìn)程（二）粘附分子檢測(cè)在特定疾病診斷中的意義粘附分子有可溶性和膜結(jié)合性兩種形式，均與機(jī)體的免疫狀態(tài)和疾病的發(fā)生有關(guān)，在炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移和器官移植排

16、斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用0相關(guān)粘附分子的檢測(cè)有助于此類疾病的診斷。三、評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后|=:機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱可通過(guò)細(xì)胞因子或粘附分子的表達(dá)水平來(lái)反映，其過(guò)高或過(guò)低表達(dá)均系免疫調(diào)節(jié)異常的結(jié)果細(xì)胞因子和粘附分子的水平，作為觀察治療效果和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)接受治療的患者進(jìn)行細(xì)胞因子水平的監(jiān)測(cè)，對(duì)保證治療效果具有指導(dǎo)意義思考題1.細(xì)胞因子和細(xì)胞粘附分子的特性是什么？可分為幾類?2基于促進(jìn)細(xì)胞增殖生物學(xué)活性，檢測(cè)IL-l、IL-2、IL-3、TNF等方法所使用的細(xì)胞依賴株與檢測(cè)原則是什么？細(xì)胞因子生物活性測(cè)定法的種類，各用于哪些細(xì)胞因子的檢測(cè)，主要優(yōu)缺點(diǎn)?ELISA法在細(xì)胞因子和粘附分子檢測(cè)可應(yīng)用于哪些方?ELISPOT的原理、用途、與ELISA的異同是什么?在應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞因子時(shí)，需要哪些靶細(xì)胞活化劑？各自的作用是什么？與細(xì)胞因子的生物活性測(cè)定法相比，免疫測(cè)定法的優(yōu)勢(shì)是什么？如何看待其現(xiàn)有的劣勢(shì)？試推測(cè)解決現(xiàn)存的不足和