超聲提取草莓莖葉中原花青素的工藝研究(共11頁(yè))

1、超聲提取草莓莖葉中原(zhngyun)花青素的工藝研究劉厚祿(hu l),楊雪,顏梅,伍春游四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(xuyun) 四川 成都摘 要：優(yōu)化草莓莖葉中原花青素超聲波輔助提取工藝。方法：采用超聲輔助法，從料液比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時(shí)間、提取次數(shù)五個(gè)方面進(jìn)行比較,在這些單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果：影響原花青素得率的因素是: 提取次數(shù) 乙醇濃度 料液比溫度提取時(shí)間；結(jié)論：超聲波提取法的適宜提取條件為:乙醇濃度40%、提取時(shí)間15min、提取溫度30、料液比1:15、提取次數(shù)3次，原花青素的得率最高。關(guān)鍵詞：草莓；莖葉；超聲提取；原花青素 St

2、udy on Ultrasonic Extraction Technology of Procyanidin from Strawberry Stem and Leaf Liu Hou- lu,Yang Xue,Yan Mei,Wu Chun-youCollege of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu SichuanAbstract: Objective To optimize the ultrasonic assisted extraction technology of procyanidin from Strawberry

3、 Stem and Leaf. Methods Using ultrasonic assisted extraction method, we compared the solid-liquid ratio, ethanol concentration , extraction temperature, ultrasound time and extraction times. Based on the single factor test, extraction technology was optimized by orthogonal testResults The influence

4、factors of yield rate of procyanidin were as follows: extraction times ethanol concentration solid-liquid ratio extraction temperature extraction time. Conclusion The optimum conditions were as follows: the ethanol concentration was 40%, solid-liquid ratio was 1:15, extraction temperature was at 30，

5、extracted for 15min and each for 3 timesKey words: strawberry; stem and leaf; ultrasonic extraction; procyanidin原花青素(Proanthocyanidins,簡(jiǎn)稱(chēng)PC)是植物界中廣泛存在的聚多酚類(lèi)混合物, 主要是由不同數(shù)目的兒茶素、表兒茶素（黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇）等聚合而成1。 經(jīng)多年藥理學(xué)研究和臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)：原花青素的抗氧化特性極強(qiáng)，具有降血壓、降血脂、消炎、抗癌、治療心血管疾病、抗輻射、抗突變、促進(jìn)骨和抑制齲齒發(fā)生等功效。目前在食品、保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域已有所應(yīng)

6、用，在歐美等國(guó)家享有“皮膚維生素”和“口服化妝品”的美譽(yù)2。研究表明PC一般存在于植物的果實(shí)、種子、花和皮中, 在葡萄、山楂、草莓、花生、銀杏(ynxng)、白樺樹(shù)、松樹(shù)等植物中的含量都很豐富3。草莓為薔激科草莓屬的常綠草本植物,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是世界七大水果之一,經(jīng)過(guò)(jnggu)30年的發(fā)展，我國(guó)草莓的栽培面積和產(chǎn)量均己躍居世界第一位4。關(guān)于草莓果實(shí)原花青素的研究已有報(bào)道，但還未見(jiàn)對(duì)草莓莖葉的研究。目前在草莓的栽培(zipi)過(guò)程中，對(duì)摘取果實(shí)后所剩的草莓莖葉直接丟棄未加利用，為了提高草莓種植的綜合經(jīng)濟(jì)價(jià)值，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廢物排放，促進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)環(huán)境友好型發(fā)展，因此研究草莓莖葉原花青素提取工藝

7、并分析其成分具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。由于PC組成和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性, 其在植物組織中的提取及組分含量的準(zhǔn)確表征始終是困擾市場(chǎng)的一個(gè)技術(shù)難題。天然原花青素的提取方法包括有機(jī)溶劑提取、微波提取、超聲波提取、 超臨界 CO2萃取以及酶法等5，其中超聲波空化可以從穩(wěn)態(tài)空化轉(zhuǎn)化成瞬態(tài)空化，吸收的能量在極短的時(shí)間和極小的空間內(nèi)釋放出來(lái)，從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其在瞬間破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)的有效成分，提高提取效率，縮短提取時(shí)間，在提取原花青素之類(lèi)的熱敏性物質(zhì)顯示出了優(yōu)越的性能6-8，原花青素的分析方法有Bate-Smith 法、香草醛分析法、鎢鉬酸法、HPLC法、示波極譜分析法等9。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取方式,

8、采用正交優(yōu)化試驗(yàn)優(yōu)化草莓莖葉中的原花青素的提取工藝，以?xún)翰杷刈鳛闃?biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用香草醛-濃鹽酸法測(cè)定原花青素的含量，為草莓莖葉的綜合開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。材料(cilio)與設(shè)備一、材料(cilio)與試劑草莓莖葉（采自雙流(shun li)草莓基地），洗凈，40烘干至恒重后，粉碎過(guò)20目篩，備用?；瘜W(xué)對(duì)照品：兒茶素標(biāo)品（購(gòu)于四川天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司）；香草醛(分析純) 、鹽酸(分析純乙醇(分析純)、甲醇(分析純)（購(gòu)于成都科龍有限公司)。二、儀器與設(shè)備FW8 0型粉碎機(jī)天津泰斯特儀器有限公司；IOTAVATO12-124 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó) Buchi 公司；HWS-24 型恒溫水浴鍋上海一恒科

9、技有限公司；HZF-211 型真空干燥箱上海弘越實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2450 型紫外分光光度計(jì)日本島津公司。實(shí)驗(yàn)方法一、原花青素的含量測(cè)定方法采用香草醛-濃鹽酸法測(cè)定原花青素類(lèi)物質(zhì)的總含量10。（一） 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制精確稱(chēng)量20.00mg標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品用50%乙醇定容至20ml制成1000ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)母液；精確量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml標(biāo)準(zhǔn)母液在10ml的容量瓶，依次各加入6ml 1%香草醛甲醇溶液和3ml濃鹽酸，并用50%乙醇定容，分別得到10、20、30、40、50、60、70ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，避光反應(yīng)30min；以體積比VA:VB:VC=

10、6:3:1(其中A為1%香草醛甲醇溶液；B為濃鹽酸；C為50%乙醇溶液)為空白對(duì)照測(cè)定在500nm處的光吸收值11；以標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素的濃度為縱坐標(biāo)y，500nm處吸光度值為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=1.8839x 0.0223，R2=0.9997。（二）樣品(yngpn)測(cè)定分別吸取1ml待測(cè)樣品提取液于10ml容量瓶，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品相同方法(fngf)顯色，依次移取6ml1%（m：v）香草醛-甲醇溶液、3ml濃鹽酸溶液遮光顯色反應(yīng)30min，取出顯色后的溶液測(cè)定在500nm處的光吸收值。每個(gè)處理樣設(shè)三次平行試驗(yàn)。原青花素含量(hnling)A=XV10-3 1/M 式中：原青花素含量

11、A W(%)； X根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的測(cè)量樣品中原花青素濃度(g/ml)；V 為樣品提取液定容以后的體積（ml）；M提取樣品質(zhì)量（g）二、單因素試驗(yàn)（一）提取溫度的影響 稱(chēng)取1.000g草莓莖葉樣品3份，以40%乙醇作為提取溶劑，按115（g/ ml）的料液比加入，超聲波功率200W，溫度分別為20、30、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 ，在超聲波提取器中震蕩提取30min，重復(fù)提取三次，合并提取液，4000r/min冷凍離心10min，過(guò)濾，定容至100ml；按照樣品測(cè)定方法得A500nm值。（二）乙醇濃度對(duì)原花青素含量的影響 稱(chēng)取1.000g草莓莖葉樣品3份，分別選擇20%、

12、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 的乙醇溶液，按115（g/ml）的料液比加入，超聲波功率200W，溫度30 ，在超聲波提取器中震蕩提取30min，重復(fù)提取三次，合并提取液，4000r/min冷凍離心10min，過(guò)濾，定容至100ml，按照樣品測(cè)定方法得A500nm值。（三） 料液比對(duì)原花青素含量的影響 稱(chēng)取1.000g草莓莖葉樣品3份，以40%乙醇作為提取溶劑，分別按1:5、1:10、1:15、1:20、1:25的料液比加入，超聲波功率200W，溫度30 ，在超聲波提取器中震蕩提取30min，重復(fù)提取三次，合并提取液，4000r/min冷凍離心10min，過(guò)濾，定容至1

13、00ml；按照樣品測(cè)定方法得A500nm值。（四）提取時(shí)間(shjin)對(duì)原花青素含量的影響 稱(chēng)取1.000g草莓莖葉樣品3份，以40%乙醇作為提取溶劑(rngj)，料液為比1:15，超聲波功率200W，溫度30 ，分別在超聲波提取器中震蕩提取15、30、45、75min，重復(fù)提取三次，合并提取液，4000r/min冷凍(lngdng)離心10min，過(guò)濾，定容至100ml；按照樣品測(cè)定方法得A500nm值。（五）提取次數(shù)對(duì)原花青素含量的影響 稱(chēng)取1.000g草莓莖葉樣品3份，以40%乙醇作為提取溶劑，料液為比1:15，超聲波功率200W，溫度30 ，在超聲波提取器中震蕩提取30min，分別提

14、取1、2、3、4次，合并提取液，4000r/min冷凍離心10min，過(guò)濾，定容至100ml；測(cè)量A500nm值，按照樣品測(cè)定方法得A500nm值。三、草莓莖葉原花青素提取條件的優(yōu)化根據(jù)單因素考察的乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)原花青素原花青素含量的綜合影響，選取對(duì)其影響最大的4個(gè)因素提取溫度、提取次數(shù)、乙醇濃度和料液比，采用L8（27）正交表設(shè)計(jì)正交優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平安排見(jiàn)表1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表因素A料液比B乙醇濃度C提取次數(shù)D提取溫度水平11:1520%2次30水平21:2040%3次50表2正交試驗(yàn)L8(27)設(shè)計(jì)表實(shí)驗(yàn)編號(hào)ABA*BCA*C誤

15、差D1111111121112222312211224122221152121212621221217221122182212112結(jié)果(ji gu)與分析一、 單因素試驗(yàn)對(duì)草莓莖葉中原(zhngyun)花青素原花青素含量的影響（一） 提取(tq)溫度對(duì)原花青素含量的影響圖1 提取溫度對(duì)原花青素含量的影響影響對(duì)不同溫度條件下的提取液進(jìn)行原花青素含量測(cè)定可知， 隨著溫度的上升，原花青素含量也隨之增大，在30達(dá)到最大值且趨于平衡，隨著溫度進(jìn)一步升高，原花青素含量呈下降趨勢(shì)，這因?yàn)樵ㄇ嗨卦诟邷匾妆谎趸?，溫度越高可能原花青素的結(jié)構(gòu)越容易被破壞，活性成分損失很大，因此提取溫度不宜超過(guò)70。結(jié)果見(jiàn)圖。（

16、二）乙醇濃度對(duì)原花青素含量的影響圖2 乙醇濃度對(duì)原花青素含量的影響由圖2可知，隨著乙醇濃度的增大，原花青素的原花青素含量也逐漸(zhjin)升高，在乙醇濃度為40% 時(shí)達(dá)到最大值，隨后(suhu)隨著乙醇濃度的增大原花青素含量趨于平緩(pnghun)，這是因?yàn)樗谌軇┲衅鸬酱┩讣?xì)胞壁的作用，在提取過(guò)程中有利于原花青素的析出，若溶劑中含水量過(guò)低時(shí)溶劑對(duì)細(xì)胞壁的穿透作用下降導(dǎo)致原花青素含量不在上升，因此最佳體積分?jǐn)?shù)為40%。（三）料液比對(duì)原花青素含量的影響 由圖3可知，隨著料液比的減小原花青素原花青素含量逐漸增加，在料液比為1:20后，原花青素含量呈穩(wěn)定的趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)原花青素已經(jīng)接近析出完全，繼

17、續(xù)減小料液比會(huì)造成后續(xù)步驟加壓蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)和溶劑的浪費(fèi)，因此最佳料液比為1 :20。圖3 料液比對(duì)原花青素含量的影響（四） 提取時(shí)間對(duì)原花青素含量的影響圖4 提取時(shí)間對(duì)原花青素含量的影響由圖4可知，原花青素含量(hnling)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，但增加趨勢(shì)不明顯，在30min以后，原花青素含量幾乎保持不變，可能(knng)原因是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原花青素被空氣中的氧氣氧化從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。（五）提取(tq)次數(shù)對(duì)原花青素含量的影響由圖5可知，原花青素含量隨提取次數(shù)的增加逐漸增大，在提取次數(shù)為2次前原花青素原花青素含量急速增大，隨著提取次數(shù)的增多，其浸出率增大速率逐漸減慢，在提取3次時(shí)

18、大部分已經(jīng)被浸出，繼續(xù)增加提取次數(shù)，儀器和試劑的損耗大于原花青素含量升高帶來(lái)的價(jià)值，因此，最佳提取次數(shù)為3次。圖 提取次數(shù)對(duì)原花青素含量的影響二、正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過(guò)(jnggu)極差及偏差平方和等分析(表4)得知：擬誤差項(xiàng)的極差及偏差(pinch)平方和均小于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中所有考察因素的極差及偏差平方和，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得結(jié)果可靠；通過(guò)各因素極差的大小比較可知，對(duì)原花青素提取率的影響程度為CBAD,即：提取次數(shù) 乙醇濃度 料液比提取溫度；比較各個(gè)因素的F比值和 F臨界值，其中乙醇濃度和提取次數(shù)兩個(gè)因素的F比 F臨界值,因此這兩個(gè)因素對(duì)原花青素的提取具有影響顯著(xinzh)；通過(guò)各實(shí)驗(yàn)組的提取率

19、的比較，最佳條件是A1B1C2D1，即料液比1:15、乙醇濃度20%、提取次數(shù)為3次、提取溫度30。但綜合考慮乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)原花青素提取率影響顯著，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇乙醇濃度為40%時(shí)提取率最大，因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇A1B2C2D1，即提取工藝參數(shù)為提取溫度30、乙醇濃度40%、提取次數(shù)為3次、料液比為1:15。在該條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次后測(cè)定原花青素含量為3.88%、3.82%、3.85%， RSD值為0.779%，驗(yàn)證了正交優(yōu)化條件的可靠性。表3正交試驗(yàn)結(jié)果分析表實(shí)驗(yàn)編號(hào)ABA*BCA*C誤差D原花青素含量實(shí)驗(yàn)111111112.05%實(shí)驗(yàn)211112223.16%實(shí)驗(yàn)31122112

20、3.03%實(shí)驗(yàn)411222213.48%實(shí)驗(yàn)522121213.08%實(shí)驗(yàn)622122123.15%實(shí)驗(yàn)722211223.28%實(shí)驗(yàn)822212113.36%偏差平方和8.21014.7040.50914.8232.7420.0894.050F比92.247165.2136.697166.55130.80945.506F臨界值161.00161.00161.00161.00161.00161.00161.00顯著性*均值114.65514.31315.39614.30715.08315.56314.957均值216.68117.02415.94117.03016.25415.77416.38

21、0極差2.0262.7110.5452.7231.7710.2111.423結(jié)語(yǔ)(jiy)本實(shí)驗(yàn)以草莓莖葉為原材料，采用超聲輔助法，從料液比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時(shí)間、提取次數(shù)(csh)等五個(gè)方面進(jìn)行比較,在這些單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明影響原花青素提取率的因素是: 提取次數(shù) 乙醇(y chn)濃度 料液比溫度提取時(shí)間；最佳超聲波提取法提取條件為:乙醇濃度40%、提取時(shí)間15min、提取溫度30、料液比1:15、提取次數(shù)3次；在該條件下原花青素平均提取含量為3.85%。由文獻(xiàn)可知草莓果實(shí)中的原花青素含量為1.93%11，遠(yuǎn)低于草莓莖葉中的原花青

22、素含量，同時(shí)與其他文獻(xiàn)比較可知，草莓莖葉的原花青素含量也高于松樹(shù)皮12、野生粉葉爬山虎種子果梗部位13等材料，因此，草莓莖葉可以作為一種新的的原花青素生產(chǎn)原料。至今還未見(jiàn)對(duì)草莓莖葉利用的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)優(yōu)化所得原花青素的提取工藝方法簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)，為今后草莓莖葉中原花青素的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)，對(duì)草莓的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)1 丁麗, 王敏, 杜連祥. 荔枝核中黃烷 - 3- 醇的鑒定及原花青素的提取J. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（7）：67-682 劉振春,鮑曉亮. 超聲波協(xié)同微波提取黑米原花青素的工藝研究J. 當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè) 2013，（2）:62-663李鳳英，崔蕊靜，李春華采用微波輔助法提取葡萄籽中的原花青素J 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2005,31(1)：39-42 4 花秀鳳.草莓種質(zhì)資源鑒定和種質(zhì)創(chuàng)