病毒的研究方法課件

1、病毒學(xué)的研究方法第1頁，共27頁。分離技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)血清學(xué)方法分子生物學(xué)方法第2頁，共27頁。圖1.1 混合物分離原料（混合物）殘余物分離設(shè)備分離劑產(chǎn) 品進(jìn)一步綜合利用一、分離技術(shù)第3頁，共27頁。機(jī)械分離傳質(zhì)分離分類反應(yīng)分離第4頁，共27頁。1、機(jī)械分離過濾分離：過濾介質(zhì) 固體顆粒大小 沉降分離：重力作用 密度差 離心分離：離心力 密度差旋風(fēng)分離：慣性力 密度差靜電除塵：靜電場 使細(xì)顆粒帶電特點(diǎn)：相間無物質(zhì)傳遞第5頁，共27頁。離心常用于病毒的純化第6頁，共27頁。A:等速度沉降，B:等密度沉降第7頁，共27頁。2、傳質(zhì)分離平衡分離過程：蒸發(fā)、蒸餾、吸收、萃取、結(jié)晶、離

2、子交換、吸附、干燥、浸取、泡沫吸附等傳質(zhì)分離速率控制分離過程：氣體擴(kuò)散熱擴(kuò)散電滲析電泳反滲透微濾、超濾和納濾第8頁，共27頁。3、反應(yīng)分離可逆反應(yīng)（如離子交換、反應(yīng)萃?。徊豢赡娣磻?yīng)（反應(yīng)吸收、反應(yīng)結(jié)晶）；分解反應(yīng)（生物分解、電化學(xué)反應(yīng)、光化學(xué)反應(yīng)）等。第9頁，共27頁。二、電子顯微鏡技術(shù)1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（TEM），電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。第10頁，共27頁。技術(shù)方法負(fù)染色法超薄切片技術(shù)免疫電鏡技術(shù)冷凍電鏡技術(shù) 第11頁，共27頁。肌

3、動蛋白纖維的負(fù)染電鏡照片用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色。1、負(fù)染色法第12頁，共27頁。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度2050nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差.萊卡超薄切片機(jī)2、超薄切片技術(shù)第13頁，共27頁。冰凍蝕刻,亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，進(jìn)行冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻。在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu).3、冰凍蝕刻第14頁，共27頁。人冠狀病毒（左）與SARS冠狀病毒病毒粒子三維

4、重構(gòu)模型電鏡觀察發(fā)現(xiàn)痘病毒是整個病毒粒子通過吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的第15頁，共27頁。三、組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)指從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長。第16頁，共27頁。1、組織培養(yǎng)的原理組織培養(yǎng)主要是為病毒易感的組織細(xì)胞提供一個良好的生存環(huán)境，使細(xì)胞對環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性，獲得生長繁殖的能力。第17頁，共27頁。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）群體培養(yǎng): 將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層?？寺∨囵B(yǎng): 將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克隆。第18

5、頁，共27頁。2、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)：分離病毒最為敏感 二倍體細(xì)胞 ：用于病毒分離和疫苗制備 傳代細(xì)胞系 ：用于病毒的分離鑒定和抗病毒藥物篩選研究。病毒基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：用于病毒基因調(diào)控和抗病毒藥物的研究。第19頁，共27頁。第20頁，共27頁。常用的細(xì)胞培養(yǎng)第21頁，共27頁。細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）由病毒增殖引起的細(xì)胞改變，稱細(xì)胞病變效應(yīng)。第22頁，共27頁。第23頁，共27頁。3、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞接種數(shù)：接種傳代細(xì)胞一般為1030萬/ml合成培養(yǎng)液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagles MEM。酸堿度：細(xì)胞生長最適宜的PH范圍是7.07.4。溫度：細(xì)胞培養(yǎng)的最適

6、溫度與細(xì)胞來源的動物體溫一致。無菌條件培養(yǎng)器皿的處理第24頁，共27頁。4、組織培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可提供大量生物性狀相同的細(xì)胞作為研究對象，對疫苗生產(chǎn)來說，其抗原性更接近于自然流行株，可減少宿主蛋白成分，減少變態(tài)反應(yīng)。缺點(diǎn)：病毒復(fù)制后滴度低，不易保存，保存時易使病毒滴度丟失，傳代細(xì)胞含致癌因子，不宜用于疫苗生產(chǎn)。且隨著細(xì)胞代數(shù)增加，對病毒敏感性也隨之下降。第25頁，共27頁。四、血清學(xué)方法中和試驗(yàn)：適用于病毒鑒定，機(jī)體中抗體的檢測，分析病毒抗原的性質(zhì)，疫苗接種效果評估等 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)：常用于正粘病毒和副粘病毒感染的診斷和病毒亞型鑒定及抗原變異的監(jiān)測，如流感病毒的分型 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)放射免疫試驗(yàn)免疫熒光檢測第26頁，共27頁。五、病毒學(xué)研究常用方法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 轉(zhuǎn)印雜交 ：Southe