單細胞測序幫助文檔(科技代表)

1、華穴基因單細胞DNA測序幫助文檔人類群體與疾病研究業(yè)務線2011.11.15聲明：由于單細胞技術處于研發(fā)狀態(tài)，請注意保密，不要將資料外傳。一、技術概述2007年至今，以Illumina公司GenomeAnalyzer（GA）為代表的第二代測序平臺已經(jīng)大規(guī)模普及。同時，人類單倍型計劃、千人基因組計劃、癌癥基因組計劃、Meta-Hit計劃等重大國際合作項目也將基因組研究日漸推向高潮。然而，迄今為止使用的測序材料無一例外都是大量細胞的混合DNA樣本。在微生物生態(tài)學、癌癥基因組、法醫(yī)學、微量診斷、遺傳印記等研究中，這樣的材料顯然是無法滿足要求的，而單細胞微量測序為解決以上難題打開了一扇嶄新的大門。單細

2、胞測序是指在單個細胞水平上對全基因組進行擴增與測序的一項新技術。該技術的建立需要兩個必備條件：（1）高質量的全基因組擴增技術（WholeGenomeAmplification,WGA）（2）高通量低成本的測序技術（NextGenerationSequencing,NGS）、技術應用根據(jù)老師的樣本情況，可以針對性的選擇不同的研究方向，具體的樣品選擇和研究方案也有所不同。具體分為以下5種情況：微量、珍貴樣品（非單個細胞）：如胰腺癌、外周血循環(huán)腫瘤細胞CTC、冰凍切片研究癌癥轉移機制（分部位）研究治療前、后或不同時期癌癥變異情況（分時間點）針對有明顯亞型的癌癥研究（分區(qū)取樣）胚胎移植前診斷（PGD）

3、,主要用于遺傳性疾病的基因檢測其他需要在單個細胞水平研究的疾病三、技術詳解單細胞外顯子測序單細胞DNA測序目前只能做SNP或者CNV檢測，當然一個細胞量太少，是不能同時檢測SNP和CNV的。單細胞外顯子測序是目前BGI做的比較多的，項目經(jīng)驗比較豐富。其WGA技術擴增錯誤率僅為10-610-7,擴增片段長（10kb）,因此全基因組覆蓋度比較好（細胞保存狀態(tài)好的情況下，可以達到85%甚至90%以上）。因此，該方法常用于SNP檢測。1）流程Agilent或Nimhlegen外顯子捕獲*SNP測及注秤卷變頻率各細屜的ilt化盤岳單細胞分離報解單細胞處理冷基因組擴增-iH-DNA擴増技術SOAP比對高通

4、顯測序序技術圖2單細胞外顯子測序流程2）測序策略91PE30 x（3）樣本量根據(jù)研究疾病不同，例如癌癥，一般取3-4個病灶（病灶數(shù)目隨樣品情況確定），每個病灶取30-50個單細胞。一個mixDNA作對照。（3）信息分析內(nèi)容基本信息分析：1）去除接頭污染和低質量數(shù)據(jù)2）比對，產(chǎn)出數(shù)據(jù)的統(tǒng)計（基于第1條）3）SNP識別、注釋、統(tǒng)計（基于第1、2條）高級信息分析：根據(jù)疾病或樣品類型不同，高級信息分析內(nèi)容也不同，風險大，需要合作雙方商議確定。以癌癥為例：1）成對樣本（normal-tumor）SomaticSNP檢測、注釋及統(tǒng)計2）成對樣本（normal-tumor）SNV檢測、注釋及統(tǒng)計3）篩選出的

5、突變與已有數(shù)據(jù)庫的比較（cosmic,dbSNP等）4）氨基酸置換預測（SIFT，Polyphon-2）5）篩選出的基因的GO富集分析，Pathway富集分析6）識別drivergene刀癌癥亞細胞群群體分析（high-risk）華穴基因華穴基因4）案例CollaborativeprojectofBGIonsinglecellsequencingofseveralcancertypes（ongoing）Theresearcherssequencedtheexomesofseveralcommoncancerstoabout20-to40-foldcoverage,andrecoveredaro

6、und85%ofthetargetedregion.Theresearchersfoundthatthemajorityofmutationsinonecancertypewereofmediumfrequencyandlow-frequencymutationstendtoappearinkeycancergenesthatareassociatedwithresistancetotherapy.Builduptheprogressionmodeloftumorcellsandtracekeygenesforvarioussubpopulations.2.單細胞CNV檢測單細胞CNV檢測主要

7、用于：（1）客戶關注或與疾病相關的變異是CNV（2）細胞之間存在異質性。與單細胞外顯子測序中使用的WGA技術相比，該WGA技術能夠對全基因組進行比較均勻的擴增，因此適合CNV檢測，其缺點在于全基因組覆蓋度低（20%50%）。BGI有做過該方法的擴增，但目前還沒有形成案例，因此以CSHL發(fā)表在nature上的文章作為案例說明一下這方面的應用。案例（原文及具體解讀請見附件資料）：冷泉港實驗室CSHL運用單細胞測序的新技術，研究兩例乳腺癌病人的癌細胞群體關系NicholasNavinetal.Tumourevolutioninferredbysingle-cellsequencing.Nature（

8、2011）.012345.容U2.SPucp=QnLU/100個polygenomic癌細胞研究顯示：乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了三個亞群，并且這三個亞群是連續(xù)的克隆進化關系ByUElM一p一urUJ100個monogenomic乳腺癌細胞研究表明：原發(fā)癌與轉移癌來自同一個非整倍體的細胞克隆，該克隆轉移到其他部位，分化形成轉移癌二、送樣建議樣品鑒定：至少通過2個專業(yè)的病理學者對組織切片或細胞涂片進行鑒定，同時對患者進行確診。需照片記錄保存樣品收集：取樣量：所取實質瘤樣品大?。?.1-0.5cm3（過大的樣品很可能不利于樣品的凍存，過小則不能滿足取樣用量）；血樣：10ml凍存：將組織和血樣直接放入-80C保存

9、，并在運輸過程中使用干冰?？蛻艨筛鶕?jù)自己的需要使用不同的保護劑和凍存方法，同時給出保護劑成分和在有特殊要求時的解凍說明（保護劑成分可能影響測序），否則一律按照37度5分鐘水浴快速解凍處理運輸將樣品保存于凍存管內(nèi)，用干冰運輸。在運前，請計算好路程和時間，放入足量的干冰，以免樣品損毀。由于液氮屬危險品，快遞公司不允許運輸，因此請勿在用液氮運輸樣品。新鮮組織取樣后，凍存寄送所花費時間盡量不超過3天。三、單細胞項目風險說明單細胞項目以合作為主。第一，單細胞測序屬于新技術，很多技術和信息分析還處于待完善階段，也沒有建立起完善的評價體系。因此，無法完全像商業(yè)化項目一樣。第二，單細胞測序以單個細胞為研究對象，個體是由大量細胞組成的，因此單細胞項目是以一群細胞為研究對象（30-50個單細胞/部位，需要選取多個不同部位），因此費用大。第三，細胞和組織保DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD人類群體與疾病研究業(yè)務線口華穴基因華夭基因存的情況直接影響全基因組擴增的效率，保存條件越好、越新鮮的單細胞其