藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn) 2020年版中國(guó)藥典四部 微生物限度檢查及無(wú)菌檢查

1、2020年版中國(guó)藥典四部微生物限度檢查及無(wú)菌檢查 微生物限度檢查培養(yǎng)基適用性檢查無(wú)菌檢查答疑實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求概要一、微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求 總體要求：各功能區(qū)域應(yīng)明確標(biāo)識(shí)，特別是菌種儲(chǔ)藏室、污染物處理區(qū)、陽(yáng)性菌室等存在生物安全危害的區(qū)域。一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求 潔凈室要求：潔凈室作為藥品微生物實(shí)驗(yàn)室的核心區(qū)域，應(yīng)遠(yuǎn)離交通干道、廁所及污染區(qū)，應(yīng)選上、下水道及其他安裝適宜的位置。潔凈室與各配套功能區(qū)，包括清洗、培養(yǎng)基配制、消毒/滅菌、滅菌物品存放和傳輸、培養(yǎng)區(qū)域、結(jié)果觀(guān)察、試驗(yàn)菌實(shí)驗(yàn)和辦公室等，要集中，減少污染，便于管理和使用?？諝鈾C(jī)組或空氣凈化

2、系統(tǒng)：潔凈或無(wú)菌室應(yīng)配備獨(dú)立的空氣機(jī)組或空氣凈化系統(tǒng)，定期更換并保存記錄。潔凈區(qū) 、活菌操作區(qū)：在時(shí)間或空間上有效分隔不相容的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)?；罹僮鲄^(qū)：配備生物安全柜；病原微生物的分離鑒定工作在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求潔凈實(shí)驗(yàn)室（環(huán)境監(jiān)測(cè)）：各潔凈級(jí)別空氣懸浮粒子的標(biāo)準(zhǔn) （通則9205表3）潔凈度級(jí)別懸浮粒子最大允許數(shù) / 立方米靜態(tài)動(dòng)態(tài)0.5m5.0m0.5m5.0mA 級(jí)352020352020B 級(jí)3520293520002900C 級(jí)3520002900352000029000D 級(jí)352000029000不作規(guī)定不作規(guī)定一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理

3、功能區(qū)域要求無(wú)菌檢查應(yīng)在B級(jí)背景下的A級(jí)單層流潔凈區(qū)域或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級(jí)背景下的B級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行潔凈度級(jí)別表面微生物A級(jí)1111B級(jí)10555C級(jí)1005025D級(jí)20010050一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求各潔凈級(jí)別物理參數(shù)建議標(biāo)準(zhǔn)（通則9205表1）潔凈度級(jí)別過(guò)濾完整性氣流組織空氣流速換氣次數(shù)壓差溫度相對(duì)濕度A級(jí)檢漏試驗(yàn)監(jiān)測(cè)周期24個(gè)月單向流監(jiān)測(cè)周期24個(gè)月0.25-0.50 m/s監(jiān)測(cè)周期12個(gè)月-潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間壓差不小于10Pa;不同級(jí)別潔凈區(qū)之間的壓差不小于10Pa監(jiān)測(cè)周期每周一次20-24監(jiān)測(cè)周期每次實(shí)驗(yàn)45-65%監(jiān)測(cè)周期每次

4、實(shí)驗(yàn)B 級(jí)單向流 （靜態(tài)）監(jiān)測(cè)周期24個(gè)月非單向流 -單向流(靜態(tài) )0.25-0.50m/s監(jiān)測(cè)周期12個(gè)月非單向流 - 單向流-非單向流 -140-60h監(jiān)測(cè)周期12個(gè)月C 級(jí)非單向流 - -120-40h監(jiān)測(cè)周期12個(gè)月D 級(jí)非單向流 - -16-20 h監(jiān)測(cè)周期12個(gè)月一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求推薦的藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測(cè)頻次及監(jiān)測(cè)項(xiàng)目通則（9205表2）受控區(qū)域采樣頻次監(jiān)測(cè)項(xiàng)目無(wú)菌隔離系統(tǒng)內(nèi)部每次實(shí)驗(yàn)空氣懸浮粒子 、浮游菌或沉降菌 、表面微生物（含手套）外部每半年一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物微生物潔凈實(shí)驗(yàn)室A 級(jí)每次實(shí)驗(yàn)空氣懸浮粒子 、浮游菌、沉降菌 、表

5、面微生物（含手套及操作服）B 級(jí)每周一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（含手套及操作服）C 級(jí)每季度一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物D 級(jí)每半年一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-2)：一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立潔凈室（區(qū)）和隔離系統(tǒng)的驗(yàn)證、使用和清潔維護(hù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對(duì)可能影響檢測(cè)結(jié)果的工作（如潔凈度驗(yàn)證及監(jiān)測(cè)、消毒、清潔維護(hù)等）能夠有效地控制、監(jiān)測(cè)并記錄。實(shí)驗(yàn)室對(duì)所用的消毒劑應(yīng)進(jìn)行效力驗(yàn)證并定期更換，消毒劑在使用前應(yīng)盡可能使用0.22m的無(wú)菌濾膜進(jìn)行除菌過(guò)濾。一、實(shí)驗(yàn)室

6、的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求無(wú)菌取樣的環(huán)境無(wú)菌取樣應(yīng)在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，特別是采用無(wú)菌生產(chǎn)的產(chǎn)品，應(yīng)有非常嚴(yán)格的無(wú)菌防護(hù)措施，避免在抽樣過(guò)程中造成微生物的污染。如果可能，所有的樣品包括非滅菌樣品均應(yīng)在具有無(wú)菌條件的特定抽樣間進(jìn)行無(wú)菌抽樣。一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求無(wú)菌潔凈室的運(yùn)行 建立使用登記制度 按潔凈室管理規(guī)范的要求制立SOP（開(kāi)啟運(yùn)行、人員進(jìn)入程序、日常監(jiān)測(cè)、UV燈與過(guò)濾器定期更換等） 定期再驗(yàn)證管理與環(huán)境監(jiān)測(cè)計(jì)劃一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求環(huán)境的清潔、消毒所用清潔、消毒劑的種類(lèi)和使用規(guī)定規(guī)定清潔、消毒的頻次、方法；（每次試驗(yàn)/或每日、每周、每月等）建立清潔、

7、消毒記錄；實(shí)驗(yàn)室對(duì)所用的消毒劑種類(lèi)應(yīng)定期更換，使用的消毒劑應(yīng)無(wú)菌。二、培養(yǎng)基適用性檢查 二、培養(yǎng)基適用性檢查微生物限度檢查1.計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查：驗(yàn)證菌： TSA：金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉、 白色念珠菌 SDA：黑曲霉、白色念珠菌驗(yàn)證菌加入量：不大于100cfu培養(yǎng)基：待檢培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基方法：注皿法培養(yǎng)條件：TSA：3035，不超過(guò)3天 SDA：2025，不超過(guò)5天 促生長(zhǎng)能力： 液體培養(yǎng)基：分別在待檢培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中加入目標(biāo)菌。 固體培養(yǎng)基：涂布法，不大于100cfu抑制能力： 大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)菌對(duì)應(yīng)的對(duì)照菌是金黃色葡萄球菌；金黃色葡萄球菌

8、對(duì)應(yīng)的對(duì)照菌是大腸埃希菌； 溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基和念珠菌顯色的對(duì)照菌是大腸埃希菌控制菌的培養(yǎng)基實(shí)用性檢查指示能力：指示能力：耐膽鹽革蘭陰性菌：紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希菌和銅綠假單胞菌大腸埃希菌：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基沙門(mén)菌：木糖醇賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌：甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和念珠菌顯色培養(yǎng)基 二、培養(yǎng)基適用性檢查無(wú)菌檢查無(wú)菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)抽取5瓶（支），各置相應(yīng)規(guī)定溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)基靈敏度檢查1.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的適用性檢查：驗(yàn)證菌： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌驗(yàn)證菌加入量：不

9、大于100cfu培養(yǎng)基量：12ml方法：直接接種法培養(yǎng)條件：3035，不超過(guò)3天 2.胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的適用性檢查：驗(yàn)證菌： 枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉驗(yàn)證菌加入量：不大于100cfu培養(yǎng)基量：9ml方法：直接接種法培養(yǎng)條件：2025，不超過(guò)5天三、微生物限度檢查 計(jì)數(shù)方法適用性檢查1.供試液的制備 水溶性供試品 非水溶性供試品：可適量加入如聚山梨酯80等表面活性劑，加入量及加入的試劑均需進(jìn)行驗(yàn)證，以證明其無(wú)明顯抑菌性。 油性供試品：十四烷酸異丙酯或其它無(wú)抑菌性的表面活性劑。 腸溶供試品：一般腸溶制劑用pH6.8磷酸鹽緩沖液，結(jié)腸制劑用pH7.6磷酸鹽緩沖液。 膜劑、貼膏劑：浸泡或振

10、搖30分鐘氣霧劑：在-20冷凍1小時(shí)候，將拋射劑完全放出后，再進(jìn)行試驗(yàn)。2.稀釋和接種菌液對(duì)照組稀釋液+菌液菌液的加入體積不超過(guò)1%最終菌液濃度為小于100cfu/ml供試品對(duì)照組供試液+稀釋液稀釋液的加入體積不超過(guò)1%試驗(yàn)組供試液+菌液菌液的加入體積不超過(guò)1%最終菌液濃度為小于100cfu/ml計(jì)數(shù)方法適用性檢查示意圖菌液組 H B K T J 稀釋液0.1ml菌液稀釋液需氧菌總數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌菌總數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)方法適用性檢查示意圖試驗(yàn)組 H B K T J 1:10供試液0.1ml菌液1:10供試液需氧菌總數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌菌總數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂

11、培養(yǎng)基計(jì)數(shù)方法適用性檢查示意圖供試品對(duì)照組 10ml 供試液1:10供試液0.1ml稀釋液需氧菌總數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌菌總數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 稀釋級(jí)的選擇： 固體制劑：1:10的供試液 液體制劑：供試品原液微生物回收的方法： 傾注法：供試液1ml注入平皿中 涂布法：供試液不少于0.1ml3.抗菌活性的消除增加稀釋劑的量： 稀釋倍數(shù)應(yīng)低于該品種微生物限度標(biāo)準(zhǔn)增加培養(yǎng)基的體積： 可采用大皿，例如150mm的平皿加入適量的中和劑： 如聚山梨酯80，硫代硫酸鈉等薄膜過(guò)濾法： 對(duì)于無(wú)抑菌性的供試品，可在供試液中直接加入目標(biāo) 菌后進(jìn)行薄膜過(guò)濾；對(duì)于有抑菌性的供試液，可先進(jìn)行薄膜過(guò) 濾，最

12、后一次沖洗液中加入目標(biāo)菌。每張濾膜每次沖洗量一 般為100ml，沖洗總量不得超過(guò)1000ml. MPN法：僅用于需氧菌總數(shù)沒(méi)有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下 九管法：連續(xù)3個(gè)稀釋級(jí)，取1ml供試液接種于910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，每級(jí)制備3份，置3035培養(yǎng)3天，觀(guān)察是否有微生物生長(zhǎng)，查微生物最可能檢索表，得到供試品需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)?？刂凭椒ㄟm用性供試品組：相當(dāng)于1g或1ml的供試液陽(yáng)性對(duì)照組：相當(dāng)于1g或1ml的供試液+不大于100cfu的目標(biāo)菌陰性對(duì)照組：與供試液同體積的稀釋液耐膽鹽格蘭陰性菌檢查1.供試液制備和預(yù)培養(yǎng)：取供試品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，放置2025培養(yǎng)約

13、2小時(shí)內(nèi)。2.定性試驗(yàn)：取1:10的供試液10ml，加至腸道菌增菌培養(yǎng)基中（加入量應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證），此方法適用于標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出的供試品。3.定量試驗(yàn)：三管法，同上述MPN法，每級(jí)稀釋級(jí)均取1ml加入一管培養(yǎng)基中。4.選擇與分離：取上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上。5.結(jié)果判斷：若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長(zhǎng)，定性試驗(yàn)判斷是否檢出；定量試驗(yàn)則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管，查表確定供試品中含有耐膽鹽格蘭陰性菌的可能菌數(shù)。大腸埃希菌檢查增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物1ml轉(zhuǎn)種至麥康凱液體培養(yǎng)基100ml中，4244培養(yǎng)2448小時(shí)，取此培養(yǎng)物劃線(xiàn)于麥康凱

14、瓊脂平板上。結(jié)果判斷：如有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否檢出大腸埃希菌。沙門(mén)菌檢查增菌培養(yǎng)：供試品10g直接接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物0.1ml轉(zhuǎn)種至RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)基10ml中，3035培養(yǎng)1824小時(shí)，取此培養(yǎng)物劃線(xiàn)于木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上。 木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上沙門(mén)菌菌落形態(tài)：淡紅色或無(wú)色，透明或半透明，中心有或無(wú)黑色。 結(jié)果判斷：如可疑菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑取可以菌落轉(zhuǎn)種于三糖鐵瓊脂培 養(yǎng)基斜面上。若三糖鐵瓊脂斜面出現(xiàn)：斜面為紅色，底層為黃色斜面及底層均為黃色 黑色 應(yīng)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否檢出沙門(mén)菌，如血清學(xué)試驗(yàn)，微生物全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)等。銅

15、綠假單胞菌檢查增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上。溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板菌落形態(tài)：草綠色，扁平，蔓延生長(zhǎng)。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長(zhǎng)，進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，銅綠假單胞菌氧化酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌檢查增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上。甘露醇氯化鈉瓊脂平板菌落形態(tài)：金黃色或黃白色，菌落周?chē)悬S色環(huán)。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否金黃色葡萄球菌，常使用血漿凝固酶試驗(yàn)。梭菌檢查供試液熱處理：取1:10的供試液2份，其中

16、一份置80保溫10分鐘后迅速冷卻。增菌培養(yǎng)：將2份1:10的供試液分別接種至梭菌增菌培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物少量分別涂布于哥倫比亞瓊脂平板上。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行過(guò)氧化酶試驗(yàn)，如過(guò)氧化酶試驗(yàn)陰性，再進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否檢出梭菌。白色念珠菌增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)于沙氏葡萄糖瓊脂平板上。沙氏葡萄糖瓊脂平板菌落形態(tài)：白色，偶見(jiàn)淡黃色，表面光滑，有濃酵母味。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長(zhǎng)，取可疑菌落劃線(xiàn)于念珠菌顯色平板上。四、無(wú)菌檢查 四、無(wú)菌檢查法1.直接接種法2.薄膜過(guò)濾法只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法

17、若需要適用表面活性劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒性。無(wú)菌檢查(直接接種法）原理示意圖 供試液硫乙醇酸鹽 1支硫乙醇酸鹽10支 TSB 10支培養(yǎng)基30-35 培養(yǎng)3天20-25 培養(yǎng)14天陽(yáng)性對(duì)照菌小于100CFU30-35 培養(yǎng)14天無(wú)菌檢查(薄膜過(guò)濾法）原理示意圖 供試液硫乙醇酸鹽硫乙醇酸鹽 TSB沖洗液培養(yǎng)基30-35 培養(yǎng)14天20-25 培養(yǎng)14天陽(yáng)性對(duì)照菌小于100CFU30-35 培養(yǎng)3天1.稀釋液0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液 pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 稀釋液選擇原則：根據(jù)供試品特性，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的適宜溶液 可在稀釋液中加入表面活性劑或中和劑 2.取樣量 四、方法適用性檢查目的 確認(rèn)所采用的方法適合于供試品的無(wú)菌檢查。即確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不計(jì)。 保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。何時(shí)需驗(yàn)證驗(yàn)證時(shí)間 建立方法處方發(fā)生改變工藝發(fā)生改變?cè)瓩z驗(yàn)條件 發(fā)生改變 預(yù)實(shí)驗(yàn)小結(jié)實(shí)驗(yàn)用品方法學(xué)驗(yàn)證 確定的方法 薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證步驟取規(guī)定量直接過(guò)濾(