分泌蛋白的追蹤

1、分泌蛋白的追蹤第1頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一目錄一.研究背景二.實驗過程三.討論第2頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一1 9 4 5年 ， 克 勞 德 和 泡特 ( Ke i t h Ro b e r t s P o r t e r ， 1 9 1 2 1 9 9 7 )發(fā) 表 了培 養(yǎng) 細 胞 的 第 一 張 電 子 顯 微 鏡照 片 ， 首 次 發(fā) 現(xiàn) 了 一 些 新 的 細 胞 亞 顯 微結(jié) 構(gòu)一 線 粒 體 和 內(nèi)質(zhì) 網(wǎng) ， 這 次 重 大 突破 開啟 了 現(xiàn) 代 細 胞 生 物 學(xué) 的 一 扇 大 門 ，為 隨 后 全 面 深

2、入 研 究 細 胞 精 細 結(jié) 構(gòu) 奠定 了基 礎(chǔ) 。帕 拉 德 對 細 胞 電子 顯 微 鏡 研 究 的 一 項 重 大 貢 獻 是 改 進了細 胞 固 定 技 術(shù) 。當(dāng) 時 鋨 酸 ( O s 0 4 ) 由于 可 快 速 高 效 保 持 培 養(yǎng) 細 胞 內(nèi) 部 的 精細 結(jié) 構(gòu) 而 被 廣 泛 應(yīng) 用 于 電 子 顯 微 鏡 研究 ， 但 鋨 酸 對 生 物 組 織 內(nèi) 的細 胞 研 究 卻存 在 很 大 困 難 。帕 拉 德 認 為 這 是 由 于鋨 酸 酸性 難 以控 制 的 原 因 ， 因此 引 入 緩沖液 方 法 以 保 證 相 對 穩(wěn) 定 的 p H， 這 種改進 使 組 織

3、細 胞 結(jié) 構(gòu) 研 究 成 為 可 能 ， 這種 固 定 液 也 被 稱 為 帕 拉 德 固 定 液 5 。帕拉 德 還 對 電子 顯 微 鏡 研 究 的 其 他 方面進 行 了 革新 ， 如 塑 料 包 埋 材 料 的 應(yīng) 用和超 薄 切 片 技 術(shù) 的 完 善 ， 這 使 2 O世 紀5 O 年 代 早 期 細 胞 電 子 顯 微 鏡 照 片 清 晰度 得 到 極 大 提 高 ， 從 而 發(fā) 現(xiàn) 了 更 多 的 細胞 內(nèi)細 節(jié) 。第3頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一將細胞與放射性標記的合成底物(屬于某些途徑或大分子)一起培養(yǎng)，則標記結(jié)果將在下一步與非標記底物共培養(yǎng)

4、中延續(xù).脈沖標記實驗：用放射性同位素標記的前體化合物對細胞或個體進行短時間的標記，以研究代謝合成動態(tài)的生物技術(shù)。 放射自顯影術(shù)（radioautography；autoradiography）用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標本中標記物的準確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標

5、記上放射性的化合物進行定位或相對定量測定。 第4頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一研究背景除了合成蛋白質(zhì)來行使細胞功能，許多細胞還必須產(chǎn)生和分泌其他蛋白到細胞外履行職責(zé)。蛋白分泌的機制迷住了許多細胞生物學(xué)家，包括帕拉德。在分泌的研究的早期，細胞被破壞，各種細胞器被離心分離。這些細胞分級分離的研究表明，分泌的蛋白是存在于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)聯(lián)的膜結(jié)合的囊泡細胞和質(zhì)膜，在那里它們被合成，并被最終從釋放. 為了進一步闡明的途徑，帕拉德轉(zhuǎn)向了新開發(fā)的技術(shù)，高分辨率放射自顯影，放射性標記的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)移動時, 使他可以跟蹤它們。他的工作產(chǎn)生深遠意義的發(fā)現(xiàn)是該分泌蛋白在囊泡內(nèi)的移

6、動是從ER到高爾基復(fù)合體，然后到質(zhì)膜。第5頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一帕 拉 德 由于 對 現(xiàn) 代 細 胞 生 物 學(xué) 誕生 和發(fā) 展做 出 了 許 多 奠 基 性 貢 獻 而 被生 物學(xué) 界譽 為 “ 現(xiàn) 代 細胞 生 物 學(xué) 之 父 ”第6頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一帕拉德想要確定哪些細胞結(jié)構(gòu)和細胞器參與蛋白質(zhì)的分泌？1.給豚鼠注射3H亮氨酸 2.從4分鐘到15小時的時間點，將動物處死，并且固定胰腺組織.（ 因 為 帕拉 德 發(fā) 現(xiàn)該 器 官 擁 有 大 量 分泌 細 胞 ， 這些 分 泌 細胞 存 在 大 量 粗 糙 內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)

7、， 并 且 還 發(fā) 現(xiàn) 胰 腺 分 泌 細胞 中 的 酶原 顆 粒 可 作 為 消 化 酶 的 暫 時 儲 存 位 點 。 第7頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一為了徹底解決這一細胞器的蛋白分泌的作用 ?（為 了 闡 明 蛋 白分 泌 過 程 ， 帕 拉 德 再 一 次在技 術(shù) 上 做 出 了 重 大 革 新 他 改 進了適 合 蛋 白質(zhì) 研 究 的 細 胞 內(nèi) 同 位 素 示蹤 體 系 ， 同時 還 發(fā) 展 了放 射 自顯 影 的 電子顯 微 鏡 方 法 ）體外脈沖追蹤實驗 細胞暴露于放射性標記的前體 .這種情況下,H3亮氨酸,短時間內(nèi)被稱為“脈沖”。 隨后的“追”的

8、時期,放射性前體用未標記的形式取代.1.通過削減豚鼠胰腺切成厚片，2.將其培養(yǎng)含有3H亮氨酸的媒體中3分鐘。 3.加入過量未標記的亮氨酸(在脈沖結(jié)束時 )。4.組織切片5.然后固定為放射自顯影或用于細胞分離 第8頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一電子顯微鏡放射自顯影所揭示的是豚鼠胰腺分泌蛋白的合成和移動。（a）在一個3分鐘的時間標記與3 H亮氨酸結(jié)束時，組織被固定，切片電子顯微鏡，并進行放射自顯影。大多數(shù)標記的蛋白質(zhì)（放射自顯影顆粒）是在粗糙的急診室。 （二）經(jīng)過7分鐘的追逐與內(nèi)未標記的亮氨酸，大多數(shù)標記的蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到高爾基體囊泡。 （三）有37分鐘的追逐后，大部分

9、的蛋白質(zhì)是在不成熟的分泌囊泡。 （四）一個117分鐘的追逐后，大部分蛋白質(zhì)是在成熟的酶原顆粒。第9頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一第10頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一技 術(shù) 上 的 改 進 使 研 究進 程 大 大 加 快 ， 帕 拉 德 和 同 事 首 先 為 哺乳 動 物 注 射 放 射 性 同位 素 標 記 的 氨 基 酸 ( H 標 記 亮 氨 酸 ) ， 然 后 分 離 亞 細 胞成 分 ， 以 觀察 新 合 成 的 帶 有 放 射 性 標 記的蛋 白質(zhì) 動 力 學(xué) 特 征 。借 助 這 些 方 法 ，帕 拉 德 最 終 發(fā) 現(xiàn)

10、分 泌 蛋 白 首 先 在 粗 面內(nèi)質(zhì) 網(wǎng) 表 面 的 核 糖 體 上 合 成 ， 隨 后 被 運 輸 到 高 爾 基 體 ， 在 這 里 合 成 的 多 肽鏈 折疊 成 為 適 宜 分 泌 的 蛋 白結(jié) 構(gòu) ， 最 后 進 入分 泌 囊 泡第11頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一為了確保他的結(jié)果是蛋白分泌在體內(nèi)的準確反映，帕拉德精心設(shè)計系統(tǒng) ?用3H亮氨酸脈沖標記組織切片3分鐘 用未標記的亮氨酸追逐的標簽7，17，37，57，和117分鐘.第12頁，共14頁，2022年，5月20日，10點58分，星期一拉德的實驗給了生物學(xué)家首先明確一下蛋白質(zhì)通過分泌途徑移動。他對胰腺外分泌細胞的研究結(jié)果產(chǎn)生了兩個開創(chuàng)性的看法。1.該分泌蛋白穿過他們的方式進出細胞的高爾基復(fù)合體2.分泌蛋白它們在整個通路分隔成囊泡 帕拉德的