呼吸道病毒檢測在兒科臨床中的應(yīng)用

1、呼吸道病毒抗原檢測在兒科臨床中應(yīng)用孝感市中心醫(yī)院 李正第1頁主要內(nèi)容兒童小區(qū)取得性肺炎CAP基礎(chǔ)知識兒童CAP病毒病原學(xué)常見診療方法七項呼吸道病毒抗原檢測回顧性分析臨床微生物標(biāo)本選擇和采集病例分析第2頁小區(qū)取得性肺炎（CAP）概述流行病學(xué)：美國感染性疾病中居首位，年發(fā)病400萬，住院100萬，平均病死率12%，重癥CAP病死率達20%-50%，美國第三大死因；WHO統(tǒng)計每年2,000,000五歲以下兒童死于肺炎，第二大死因，僅次于心血管疾?。恢袊谖宕笏酪?，5歲以下嬰幼兒死亡首因，每年死亡率占總?cè)丝谒劳雎?%1-2 1 Williams, B. G., E. Gouws, et al. Lan

2、cet Infectious Diseases. 2中國醫(yī)師協(xié)會急診分會中國急診小區(qū)取得性肺炎臨床實踐指南3 Ruuskanen, O; Lahti, E, Jennings, et al. Lancet. 4中華醫(yī)學(xué)會兒科分會兒童小區(qū)取得性肺炎管理指南(修訂)病原學(xué)：常見病原包含病毒、細菌、支原體、衣原體等，幼兒超出50%CAP由病毒引發(fā)，兒童有45%病毒與細菌混合感染，而成人中為15%3-4。第3頁小區(qū)取得性肺炎CAP病原學(xué)病毒病原：通常引發(fā)急性呼吸道感染，感染率兒童隨年紀(jì)增加而下降，常見包含呼吸道合胞病毒（首位）、副流感病毒、流感病毒、腺病毒、鼻病毒，其它還包含EB病毒、人偏肺病毒、巨細

3、胞病毒等。細菌病原：肺炎鏈球菌（首位）、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、軍團菌屬、結(jié)核分枝桿菌等非經(jīng)典病原：肺炎支原體（常見于學(xué)齡期），肺炎衣原體（學(xué)齡期和青少年），嗜肺軍團菌（重癥CAP）第4頁常見病原少見病原28天-3月齡細菌肺炎鏈球菌大腸埃希菌肺炎克雷伯桿菌金黃色葡萄球菌非發(fā)酵革蘭陰性桿菌百日咳桿菌流感嗜血桿菌（b型、不定型）卡他莫拉菌非經(jīng)典微生物沙眼衣原體病毒呼吸道合胞病毒副流感病毒I型、II型、III型巨細胞病毒流感病毒A型、B型腺病毒人類偏肺病毒不一樣年紀(jì)兒童CAP病原特征第5頁不一樣年紀(jì)兒童CAP病原特征常見病原少見病原3月齡-5歲細菌肺炎鏈球菌流感嗜血桿菌(b型、不定型)卡他莫拉

4、菌金黃色葡萄球菌肺炎克雷伯桿菌大腸埃希菌結(jié)核分歧桿菌非經(jīng)典微生物肺炎支原體嗜肺軍團菌肺炎衣原體病毒呼吸道合胞病毒腺病毒副流感病毒I 、II 、III型流感病毒A型、B型鼻病毒人類偏肺病毒腸道病毒人禽流感病毒、新型冠狀病毒EB病毒、麻疹病毒第6頁不一樣年紀(jì)兒童CAP病原特征常見病原少見病原5歲-15歲細菌肺炎鏈球菌化膿性鏈球菌金黃色葡萄球菌結(jié)核分歧桿菌流感嗜血桿菌（b型、不定型）非經(jīng)典微生物肺炎支原體肺炎衣原體嗜肺軍團菌病毒流感病毒A型、B型腺病毒EB病毒新型冠狀病毒人禽流感病毒第7頁病原學(xué)檢驗主要任務(wù)研究感染性疾病病原體特征提供快速、準(zhǔn)確病原學(xué)診療指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，提出合理用藥提議對醫(yī)院

5、感染及疾病大規(guī)模傳染進行監(jiān)控第8頁怎樣診療？常見呼吸道病毒試驗室診療美國兒科學(xué)會(AAP)及CDC推薦的呼吸道病毒診斷方法抗原檢測實時熒光定量PCR（RT-PCR）病毒分離培養(yǎng)不推薦使用血清學(xué)檢測（抗體）流感診療指南指出：病毒抗原和核酸檢測能夠用于早期診療1 ；抗體檢測能夠用于回顧性調(diào)查，但對病例早期診療意義不大1 單一血清標(biāo)本流感血清學(xué)試驗數(shù)據(jù)不可信 2。配正確急性和恢復(fù)期血清標(biāo)本用于測定抗體滴度，適合用于回顧性診療和科研目標(biāo)2 。1 中國衛(wèi)生部頒布流行性感冒診療與治療指南（）2 Harper SA, Bradley JS, Englund JA, et al. Clin Infect Di

6、s. Apr 15;48(8):1003-32.第9頁我國指南推薦病毒抗原檢測方法參考文件：中華醫(yī)學(xué)會兒科分會兒童小區(qū)取得性肺炎管理指南(修訂)第10頁抗原檢測與血清學(xué)檢測本質(zhì)區(qū)分抗原檢出時間最早！第11頁抗原檢測優(yōu)勢1、早期診療病毒治療針對性強：不一樣病毒用藥不一樣病毒治療有時效性： 越早用藥效果越佳防止抗生素不合理使用（細菌耐藥性問題）2、抗原檢測可極大程度防止漏診及誤診病毒名稱IgM檢出日期檢出率IgM連續(xù)時間流感病毒0-7天8-14天61-112天10%78%71%2-20周副流感病毒平均6.7天2-11周呼吸道合胞病毒5-6天2-10周腺病毒0-7天50%2個月漏診誤診第12頁陽性：

7、展現(xiàn)果綠色陰性：無綠色，只展現(xiàn)背景色七項呼吸道病毒抗原檢測試劑 （D3 Ultra DFA）試驗原理：直接免疫熒光法DFA檢測項目：甲、乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒和副流感病毒1、2和3型樣本類型：鼻咽拭子、鼻腔灌洗液等一步法染色，快速、靈敏，整個操作2小時內(nèi)完成CAP常見呼吸道病毒抗原檢測第13頁呼吸道病毒抗原檢測原理第14頁甲型流感病毒乙型流感病毒甲型流感病毒乙型流感病毒甲型流感病毒第15頁呼吸道合胞病毒腺病毒第16頁副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型第17頁檢驗特異性: 用D3 Ultra DFA 呼吸道病毒篩查和判定試劑對各種細胞和微生物進行交叉反應(yīng)測試。對64種病毒、

8、18種細胞、19種細菌均沒有交叉反應(yīng)。檢驗靈敏度也被評定過用以確定檢測最低限。熒光單抗平均能檢測出病毒最低濃度約為1.0 PFU。靈敏度&特異性第18頁Pollock NR, Duong S, Cheng A, et al. Ruling out novel H1N1 influenza virus infection with direct fluorescent antigen testing. Clin Infect Dis. Sep 15;49(6):e66-8.在這篇報道中，作者結(jié)論是：經(jīng)過采集高質(zhì)量標(biāo)本（單孔樣本中柱狀上皮細胞數(shù)達60個以上），從而使檢測靈敏度和特異性均靠近PCR，

9、所以DFA試劑能非常有效地對甲型流感病毒進行排查檢測。The DFA was calculated to have a sensitivity of 93% (95% confidence interval CI, 8%), specificity of 97% (95% CI, 4%), negative predictive value 96% (95% CI, 5%), and positive predictive value of 95% (95% CI, 7%) relative to PCR.臨床驗證1：與PCR相比第19頁DFA、ELISA和IFA檢測結(jié)果陽性率分別為67.6

10、、57.5 和39.6 。ELISA和IFA與DFA檢測結(jié)果符合率分別為21.7 和31.4 。ELISA和IFA與DFA檢出病毒相符患兒采血時發(fā)病天數(shù)平均值從高到低依次分別為ADV(12.0 d)、PIV2(9.6 d)、IFV(9.5 d)、RSV(5.3 d)和PIV3(15.0 d)、ADV(9.2 d)、RSV(7.4 d)。臨床驗證2：與血清學(xué)檢測相比第20頁呼吸道病毒抗原檢測回顧性分析第21頁我院兒童呼吸道病毒感染流行病趨勢第22頁第23頁第24頁DFA用于對不一樣呼吸道感染早期診療第25頁第26頁第27頁南平市一七項呼吸道病毒抗原檢測回顧性分析第28頁南平市一七項呼吸道病毒抗原

11、檢測回顧性分析正確取樣對試驗成功至關(guān)主要！ 第29頁臨床微生物標(biāo)本選擇和采集第30頁參考文件：中華醫(yī)學(xué)會兒科分會兒童小區(qū)取得性肺炎管理指南(修訂)第31頁中國某三甲醫(yī)院數(shù)據(jù)：使用抗菌藥品治療病人中，病原學(xué)標(biāo)本送檢率為49.25，送檢率最高是兒科97.00，最低是五官科6.67；病原學(xué)送檢時機不合理占27.26；采樣操作合格率34.78；臨床醫(yī)護人員對微生物標(biāo)本采集和運輸存在不一樣程度認知缺點，對病原學(xué)檢驗結(jié)果滿意度為68.18。送檢率低結(jié)果陽性率低取材有缺點過早經(jīng)驗用藥吳曉英,宋敏,郭滿書等.臨床病原學(xué)送檢現(xiàn)況調(diào)查及管理對策J.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,22(20):4586-4588.臨床微生物標(biāo)

12、本選擇和采集第32頁疾病標(biāo)本類型運輸要求流感鼻腔沖洗、鼻/咽拭子、鼻咽抽吸物、洗鼻液、氣道抽吸物、支氣管肺泡灌洗液72小之內(nèi)檢測應(yīng)在4C運輸不然應(yīng)在-70C冷凍直至檢測麻疹鼻咽抽吸物、咽拭子、尿、血咽拭子及鼻咽抽吸物需要病毒保留液室溫或置于濕冰上2小時內(nèi)流行性腮腺炎腮腺分泌物拭子，CSF拭子置于病毒保留液中室溫或濕冰上2小時內(nèi)風(fēng)疹鼻咽拭子或沖洗液、痰、尿除尿液外其它標(biāo)本應(yīng)置于病毒保留液冷凍或快速運輸?shù)皆囼炇曳乐箻?biāo)本干燥輪狀病毒胃腸炎大便無菌并帶螺旋蓋容器，快速運輸?shù)皆囼炇一蛘呃鋬鲞\輸注意防止重復(fù)屢次融凍EBV/CMV 全血、外周血淋巴細胞、血漿、CSFEDTA抗凝管取血室溫下2小時內(nèi)各種病毒血

13、清促凝管取血，室溫2小時內(nèi)或者4C保留運輸，或者冷凍第33頁合格標(biāo)本：單孔樣本中柱狀上皮細胞數(shù)達20個以上采樣部位：鼻咽部耗 材：鼻咽拭子（專利進口呢絨植絨拭子）正確拭子采樣手法：無創(chuàng)！安全！第34頁相關(guān)取樣Q&AQ：取樣是否會給嬰幼兒帶來傷害？A：不會，鼻咽拭子取樣刷取是鼻咽部柱狀上皮細胞，無創(chuàng)，無交叉感染；另外采取拭子為特制，絨毛十分柔軟，絕不會傷害孩子鼻腔上皮。Q：可否采取咽拭子？A：咽部主要是鱗狀上皮細胞，咽拭子樣本陽性率約為鼻咽拭子二分之一*，為了更加好檢測，提議使用鼻咽拭子。 Evaluation of the Quidel QuickVue Test for Detection

14、Influenza A and B Viruses in the Pediatric Emergency Medicine Setting by Use of Three Specimen Collection Methods，Journal of Clinical Microbiology,July 第35頁病例分析第36頁女，1歲10月咳嗽1周，發(fā)燒4天 查體：T40.6，HR124次/分，RR 32次/分 W：13.55Kg ，SpO293%神志清，反應(yīng)可，兩側(cè)頰部皮膚可見散在紅色皮疹，壓之褪色。皮膚彈性好，口唇紅潤。咽紅，未見發(fā)紺或吸凹，雙肺呼吸音粗，未及干濕羅音， 顏面、口唇紫紺，右

15、肺呼吸音略低；心音有力。-01-02（我院）血常規(guī)WBC5.33109/L ，RBC4.721012/L ，N 48.7，L40.4， HB119g/L，Plt232109/L。-01-04（我院）血常規(guī)WBC5.28109/L ，RBC4.561012/L ，N 41.3，L51.5， HB117g/L，Plt245109/L，CRP7.1mg/L血氣分析乳酸：1.16(mmol/L)，氧飽和度：91.0(%)，二氧化碳分壓：32.00(mmHg)，pH：7.35，氧分壓：65.00(mmHg)。病例分析1第37頁胸部X線檢測-01-10 肺部CT：右側(cè)胸腔積液伴右肺下葉部分肺不張，右肺下葉

16、炎癥，雙側(cè)支氣管炎癥改變第38頁試驗室檢驗-01-04，血細胞分析(五分類)(樣本:血液)：白細胞數(shù)3.82X109/L ，中性粒細胞#1.83X109/L，中性粒細胞%.48.20%，淋巴細胞%.44.20%，紅細胞. 4.14X1012/L，血紅蛋白.106.0g/L，血小板總數(shù) 212X109/L；異常白細胞形態(tài)檢驗(樣本:血液)：淋巴細胞%.44.2.00%，單核細胞%.7.80%，中性粒細胞%.48.2.00% ；C-反應(yīng)蛋白 6.5mg/L；降鈣素原檢測(化學(xué)發(fā)光法)0.509ng/ml；-01-04，小兒生化常規(guī)(樣本:血液)：間接膽紅素 4.10umol/L，尿素 4.20mm

17、ol/L，血糖 6.42mmol/L，白蛋白 35.40g/L，總蛋白 54.10g/L，總膽紅素 5.60umol/L，直接膽紅素1.5umol/L，肌酐28.80umol/L，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 63.6U/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶19.5U/L，肌酸激酶113.0U/L，乳酸脫氫酶524.00U/L -01-04，免疫球蛋白組套(樣本:血液)：免疫球蛋白A 1.15g/L，免疫球蛋白E 35.85IU/mL，免疫球蛋白G 3.71g/L，免疫球蛋白M 0.78g/L；-01-04，電解質(zhì)(樣本:血液)：鉀 3.39mmol/L，鈉 134.00mmol/L，氯 99.00mmol/L；-01

18、-04，紅細胞沉降率測定(ESR)(樣本:血液)：血沉（魏氏法）33.0MM/H；-01-04，-01-05，血清鐵蛋白測定(樣本:血液)：鐵蛋白 186.00ug/L；-01-04，呼吸道七聯(lián)：抗原直接免疫熒光法(DIF)：腺病毒（+）-01-05，肺炎支原體血清學(xué)試驗(樣本:血液)：肺炎支原體抗體檢測 陰性； 第39頁診療支氣管肺炎（重癥）（腺病毒肺炎）患兒咳嗽1周，發(fā)燒4天入院入院查體咽紅，雙肺呼吸音粗，右肺呼吸音低試驗室檢驗:腺病毒（+）胸片示右下肺可見斑片狀密度影第40頁腺病毒肺炎多見于2歲以下嬰幼兒發(fā)病有一定季節(jié)性，表現(xiàn)為連續(xù)高熱，肺炎鏈球菌性肺炎等嚴(yán)重細菌感染不一樣是，多伴有喘鳴，以精神萎靡、面色不佳、肺部密集濕噦音為突出表現(xiàn)經(jīng)典胸部影像學(xué)表現(xiàn)為大片肺實變。第41頁CAP嚴(yán)重度評定第42頁治療單純病毒性肺炎無使用抗菌藥品指征B但必須注意細菌、病毒、MP、衣原體等混合感染可能性c病毒性CAP支持療法、對癥療法和加強護理等仍居主要地位參考文件：中華醫(yī)學(xué)會兒科分會兒童小區(qū)取得性肺炎管理指南(修訂)第43頁病例分析2男，10月咳嗽2天，呼吸困難半天T 39，P 180bpm，R 70-80bpm，Bp 90/65mmHg，SpO270%煩躁不安，顏面、口唇紫紺，左肺呼吸音低；心音有力。第44頁病原及針對性治療感染指標(biāo)：WBC、CRP、PC