項(xiàng)目12病原性真菌的檢測

1、項(xiàng)目12：病原性真菌的檢測【目的要求】了解真菌接種、培養(yǎng)的一般程序；掌握單細(xì)胞真菌和多細(xì)胞真菌的菌絲、孢子的形態(tài)特點(diǎn)；掌握真菌不染色標(biāo)本直接檢查方法。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、真菌的菌落觀察（示教）觀察真菌菌落的形態(tài)特點(diǎn)及顏色有助于病原性真菌的鑒定。一般觀察真菌的菌落必需將真菌培養(yǎng)于沙保弱氏培養(yǎng)基（俗稱大培養(yǎng)），經(jīng)數(shù)日致十?dāng)?shù)日的培養(yǎng)后才可看到典型菌落?！静?料】1臨床標(biāo)本（可疑真菌感染）：毛發(fā)或皮屑 2真菌菌種：新生隱球菌，白假絲酵母菌，絮狀表皮癬菌。3沙保弱氏葡萄糖斜面培養(yǎng)基（含青、鏈霉素）4其它：70%酒精 、無菌生理鹽水 、平皿等。【方 法】1臨床標(biāo)本用70%酒精浸泡數(shù)分鐘，殺死表面雜菌，以無菌生

2、理鹽水洗滌。2將處理過的臨床標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)室保存菌種分別接種于23只含有青、鏈霉素的沙保弱氏葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，對臨床標(biāo)本直接將數(shù)根毛發(fā)或數(shù)塊皮屑接種。真菌菌種則用滅菌接種環(huán)按斜面培養(yǎng)基接種法接種。 3置2228培養(yǎng)23w或37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)37d4一周觀察12次，臨床標(biāo)本連續(xù)培養(yǎng)3w無菌落生長者可報告陰性，如長出菌落，應(yīng)逐日觀察菌落形態(tài)及顏色變化。 【結(jié)果觀察】真菌的菌落從形態(tài)上可分三大類：酵母菌落、酵母樣（型）菌落及絲狀菌落。1.酵母菌落（觀察新生隱球菌培養(yǎng)物）：菌落為圓形、較白色，邊緣整齊表面光滑、濕潤，假菌絲不伸入到培養(yǎng)基內(nèi)，和表皮葡萄球菌菌落相似。 2.酵母樣（型）菌落（觀察白假絲酵母菌）

3、：表面和酵母菌落相似，但生成的假菌絲伸入培養(yǎng)基內(nèi)。 3.絲狀菌落：觀察各種皮膚絲狀菌斜面培養(yǎng)物,菌落表面大都有氣生菌絲,肉眼觀察呈絨毛狀、粉狀、棉花樣等，故稱絲狀菌落，色澤多種多樣，紅色毛菌呈紫紅色，鐵銹色毛菌呈鐵銹色或棕色等，菌落底層有營養(yǎng)菌絲伸入培養(yǎng)基內(nèi)。二、真菌的形態(tài)觀察 【原 理】單細(xì)胞真菌形態(tài)觀察：酵母菌是不運(yùn)動的單細(xì)胞真核微生物,其大小通常比常見細(xì)菌大幾倍甚至幾十倍。大多數(shù)酵母以出芽方式進(jìn)行無性繁殖。本實(shí)驗(yàn)用美蘭染液水浸片觀察白色念珠菌和酵母菌的形態(tài)和出芽生殖方式。由于美蘭是一種無毒性染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型呈無色。用美蘭對酵母的活細(xì)胞染色時，由于其新陳代謝，細(xì)胞具有較強(qiáng)的還

4、原能力，因此可將氧化型的美蘭轉(zhuǎn)化為還原型的美蘭，而衰老細(xì)胞或死細(xì)胞其還原能力弱或無，因此，仍呈淡藍(lán)色或藍(lán)色。故可借此可對酵母菌的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行鑒別。多細(xì)胞真菌是由菌絲和孢子構(gòu)成的。其中菌絲相互交織成團(tuán)，形成復(fù)雜的菌絲體，俗稱霉菌。菌絲按其功能不同可分為營養(yǎng)菌絲、氣中菌絲和生殖菌絲三種。孢子由生殖菌絲產(chǎn)生，分無性孢子和有性孢子二種。霉菌的菌絲體和孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。直接制片觀察法：是將真菌的培養(yǎng)物置于美蘭染色液中，制成霉菌制片觀察。1菌絲的形態(tài) 梳狀菌絲：菌絲一側(cè)有多數(shù)短的分枝，間距不等，形如梳子，故名梳狀菌絲常見于許蘭氏毛菌。螺旋狀菌絲：某些菌絲呈螺旋狀彎曲，常見于

5、石膏樣小孢子菌和許蘭氏毛菌。 球拍樣菌絲：在菌絲分節(jié)處一端膨大，如網(wǎng)球拍樣，常見于小孢子菌（microsporum）及表皮癬菌(epidermophyton)。結(jié)節(jié)狀菌絲：菌絲纏繞成結(jié)節(jié)樣，常見于奧杜盎小孢子菌等。鹿角狀菌絲：菌絲末端膨大成鹿角狀，多見于許蘭氏毛菌。假菌絲：酵母菌（如：白假絲酵母菌）的菌體細(xì)胞延長分枝后并不脫落，形成類似菌絲的結(jié)構(gòu)。2孢子的形態(tài)芽生孢子（blastospore）：從母細(xì)胞發(fā)芽而產(chǎn)生，如新生隱球菌（墨汁染色）。厚膜孢子(chlamydospore)：是從菌絲產(chǎn)生的一種大而圓形的孢子，于毛癬菌（trichophyton）及小孢子菌中常見。小分生孢子（miclocon

6、idia）:孢子為單細(xì)胞性孢子，常直接或由小側(cè)枝連接而生長于菌絲的側(cè)面。毛癬菌中?？梢姷叫》稚咦尤杭性诜种z末端，呈葡萄狀。也有圓形小分生孢子位于菌絲的旁側(cè)。 大分生孢子（macroconidia）：是一種多細(xì)胞性孢子，常為梭形或棒形，多數(shù)大分生孢子具有數(shù)個橫隔，每個橫隔即為一個細(xì)胞。如絮狀表皮癬菌的大分生孢子為粗棍型或卵圓形，末端較粗而鈍圓，單一或簇生于菌絲端，大小孢子菌則為梭形大分生孢子。 關(guān)節(jié)孢子（althrospore）：由菌絲細(xì)胞分化成幾個長方形的節(jié)段而成，胞壁也稍厚些，在陳舊培養(yǎng)物中?？沙霈F(xiàn)。【材 料】菌種：腳癬病人皮屑、白色念珠菌、酵母菌、黑曲霉培養(yǎng)物染色液：0.1%的美蘭

7、染液封固液：10%NaOH【方 法】1不染色標(biāo)本的檢查： （l）標(biāo)本制作：取少量標(biāo)本于載玻片上，滴加一滴封固液，上覆蓋玻片，將載玻片放在火焰上方微加熱，使組織或角質(zhì)溶解，但切勿過熱以免產(chǎn)生氣泡或烤干也可將蓋片稍加按壓，使溶解的組織分散并使其透明，吸去周圍溢液避免沾污蓋玻片。 （2）檢查先用低倍鏡檢查有無真菌菌絲或孢子，再以高倍鏡檢查菌絲、孢子的特征。鏡檢時用稍弱的光線使視野稍暗為宜、低倍鏡下菌絲呈折光性較強(qiáng)、綠色纖維分枝絲狀體；高倍鏡下，菌絲呈分隔或呈節(jié)孢子，有時菌絲末端有較粗短的關(guān)節(jié)孢子。2單細(xì)胞真菌的美蘭浸片觀察（1）在載玻片的中央加一滴0.1%美蘭染色液,然后按無菌操作用接種環(huán)挑取少量白色念珠菌或酵母菌的菌苔放在染液中,混合均勻。（2）用鑷子取一塊蓋玻片，先將蓋玻片的一邊與染液接觸，然后緩慢將蓋玻片放下，使其蓋在菌液上。（3）將制片靜置3min后鏡檢，分別用低倍鏡和高倍鏡觀察其形態(tài)和出芽情況，并繪圖記錄結(jié)果。3多細(xì)胞真菌的直接制片觀察（1）在載玻片的中央加一滴0.1%美蘭染色液,然后按無菌操作用接種環(huán)挑取菌落邊緣處少