組合策略提高普魯蘭酶在枯草芽胞桿菌中的表達(dá)

1、PAGE 14 -組合策略提高普魯蘭酶在枯草芽胞桿菌中的表達(dá)普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)屬于-淀粉酶家族,是一種常在工業(yè)上使用的淀粉酶,它可以特異性的水解支鏈淀粉、糊精、普魯蘭糖等的-1,6糖苷鍵1,以達(dá)到脫支的作用。依據(jù)普魯蘭酶水解糖苷鍵原理的不同和生成產(chǎn)物的差異,其主要分為 I 型普魯蘭酶和 II 型普魯蘭酶2。I 型普魯蘭酶負(fù)責(zé)水解-1,6 糖苷鍵,產(chǎn)物是麥芽三糖和一些線性寡糖；II 型普魯蘭酶,是一種雙功能酶,它不僅可以水解 -1,6 糖苷鍵,還能夠隨機(jī)水解淀粉直鏈上的 -1,4 糖苷鍵,生成還原性末端3。因此在糖化過程中,普魯蘭酶常與其他淀粉酶如糖化酶、-淀粉酶、-淀粉酶或環(huán)糊

2、精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)配來快速分解淀粉。此外,普魯蘭酶也被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)果葡糖漿、抗性淀粉、乙醇燃料、啤酒等其他領(lǐng)域4。盡管已有多種生產(chǎn)普魯蘭酶的微生物被發(fā)現(xiàn),但野生型菌的普魯蘭酶產(chǎn)量偏低,難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。隨著基因工程和酶工程的迅速發(fā)展,普魯蘭酶最近在多種模式菌株中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),包括大腸桿菌5、枯草芽胞桿菌6、地衣芽胞桿菌7、短小芽胞桿菌8、畢赤酵母等9。但大腸桿菌和短小芽胞桿菌不是安全菌株,畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)需要甲醇的添加,會導(dǎo)致食品安全問題,且畢赤酵母的發(fā)酵時(shí)間較長。根據(jù)GB 27602022食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,食品級普魯蘭酶生產(chǎn)菌株僅為產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Kle

3、bsiellaaerogenes)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(Bacillusacidopullulyticus)、地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformi)和長野解普魯蘭桿菌(Pullulanibacillusnaganoensis)?？傮w來看,提高普魯蘭酶在B.subtilis中的表達(dá)對于滿足普魯蘭酶工業(yè)應(yīng)用需求具有非常重要的意義。B.subtilis是革蘭氏陽性菌種的模式菌株,其作為表達(dá)宿主被廣泛使用,具有以下諸多優(yōu)點(diǎn)：(1)屬于公認(rèn)的食品級安全菌株(GRAS認(rèn)證)10；(2)無明顯的密碼子偏好性,表達(dá)異源蛋白時(shí)具有天然優(yōu)勢11；

4、(3)分泌能力強(qiáng),其具有Sec、Tat等4條蛋白分泌途徑以及大量鑒定的信號肽,可以有效地分泌蛋白至胞外以及簡化后續(xù)純化過程12；(4)生長速率快,培養(yǎng)、發(fā)酵周期短11；(5)具有透徹的研究背景和豐富的基因改造工具13。本研究中,將融合信號肽AprE14的Bacillusderamificans普魯蘭酶基因在B.subtilisWB600中表達(dá)。先后通過啟動子類型優(yōu)化、培養(yǎng)基組分單因素和響應(yīng)面優(yōu)化,提高了普魯蘭酶的表達(dá)水平,并在5 L罐上進(jìn)行放大培養(yǎng)。1 材料與方法1.1 材料與試劑1.1.1 菌株與質(zhì)粒菌株B.subtilisWB600-E.coliJM109為實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pP43 NMK

5、由實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pUC57-Pul由上海生工公司合成,其含有B.subtilis內(nèi)源信號肽AprE和來源于Bacillusderamificans的普魯蘭酶基因(GenBank:KT897705.1),并根據(jù)B.subtilis密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化。1.1.2 引物本文中的引物如表1所示。表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study1.1.3 試劑Prime STARDNA聚合酶、DNA Ligation Kit 試劑盒、DNA連接酶(solution I)、瓊脂糖,TaKaRa公司(大連)；柱回收試劑盒、膠回收試劑盒,Invitrogen；質(zhì)粒

6、提取試劑盒、氨芐青霉素、卡娜霉素、即用型無縫克隆試劑盒、尿素、硫酸銨、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖,生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨、酵母粉,OXIOD公司；玉米漿,上海源葉生物科技有限公司；SDS蛋白電泳試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)蛋白,Invitrogen；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.4 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,蛋白胨10,氯化鈉10。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2%瓊脂粉。TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油5,蛋白胨12,酵母粉 24,磷酸二氫鉀2.31,磷酸氫二鉀 16.37。5 L罐補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 500,玉米漿 65,酵母浸膏 35,CaCl20.13

7、。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 普魯蘭酶基因的合成與表達(dá)載體的構(gòu)建利用引物Pul-F/R PCR擴(kuò)增普魯蘭酶基因,引物Pul-F/R-plasmid擴(kuò)增pP43 NMK質(zhì)粒骨架,通過無縫克隆試劑盒,將片段融合構(gòu)建質(zhì)粒P43-Pul。質(zhì)粒的提取參考試劑盒說明書。1.2.2 普魯蘭酶重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli109感受態(tài)細(xì)胞中,在含質(zhì)量濃度100 g/mL氨芐西林的LB固定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以Pul-F和Clone-R為引物,對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因測序確認(rèn)。1.2.3B.subtilis轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)與表達(dá)將測序正確后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.subtilis,并在LB固

8、定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將單菌落接種到含有20 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,37 、220 r/min培養(yǎng)8 h活化種子液。接著取1 mL種子液轉(zhuǎn)接至裝有25 mL TB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶內(nèi),37 下發(fā)酵,定時(shí)測量細(xì)胞OD600值和普魯蘭酶酶活力。以上培養(yǎng)基添加卡納霉素(50 g/mL)。1.2.4 啟動子表達(dá)變體的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,選用強(qiáng)組成型啟動子(PlytR,P223,P556和P566和P6366)15-17、誘導(dǎo)型啟動子(PxylA)18、自誘導(dǎo)型啟動子(PsrfA)15分別替換原有組成型啟動子P43(啟動子序列見表2)。P223、P566和P6366均為短啟動子,將其直接設(shè)

9、計(jì)在引物的非同源部分。所用引物對為223-F/223-R、566-F/566-R、6 366-F/6 366-R,PCR產(chǎn)物通過DNA Ligation Kit連接試劑盒,環(huán)化后構(gòu)建啟動子變體。剩余啟動子通過引物對lytR-F/R、xylA-F/R和srfA-F/R擴(kuò)增,通過引物對lytR-plasmid-F/R、xylA-plasmid-F/R、srfA-plasmid-F/R擴(kuò)增質(zhì)粒載體,并通過一步克隆試劑盒構(gòu)建啟動子變體。重組質(zhì)粒的提取和鑒定同上述方法。表2 本研究所選用的啟動子Table 2 The promoters selected in this study1.2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基

10、配方和產(chǎn)酶條件以TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ),選用2種無機(jī)氮源(尿素、硫酸銨)、3種有機(jī)氮源(胰蛋白胨、玉米漿、酵母膏)替換原有蛋白胨；選用2種單糖碳源(葡萄糖、果糖)、2種雙糖碳源(蔗糖、麥芽糖)替代原有甘油；額外添加1 mmol/L金屬離子(MgCl2、ZnCl2、CaCl2、FeCl3、AlCl3)考察金屬離子的影響。1.2.6 重組B.subtilis的5 L罐發(fā)酵接種生長在抗性平板上的單菌落至多個(gè)含有50 mL LB培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中,培養(yǎng)8 h以達(dá)到對數(shù)期,活化種子液。然后將種子液按照5%的體積比接種至含有2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。以50%的氨水和30%的磷酸控制pH在7.

11、0。發(fā)酵溫度控制在37 ,攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián),設(shè)定值為30%(攪拌轉(zhuǎn)速下限300 r/min,上限900 r/min),通氣量為1.5 vvm。實(shí)時(shí)監(jiān)測殘?zhí)侵登闆r,當(dāng)殘?zhí)? g/L時(shí)(底物耗盡,溶氧開始反彈)進(jìn)行補(bǔ)料控制,使殘?zhí)蔷S持在10 g/L左右。實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞生長和酶活力,當(dāng)酶活性數(shù)值連續(xù)2次下降時(shí),終止發(fā)酵。1.2.7 普魯蘭酶酶活力檢測和SDS分析分別取1 mL的底物(1.0%普魯蘭酶溶液)和0.9 mL的0.1 mol/L pH 4.5的醋酸緩沖液于試管中,60 水浴預(yù)熱10 min左右。加入0.1 mL稀釋的酶液樣品,振蕩混勻,反應(yīng)10 min,加入2 mL DNS終止反應(yīng),沸水浴

12、7 min,冰水中冷卻。向上述反應(yīng)體系中加入10 mL的蒸餾水,混勻,在540 nm下測量其吸光值19。蛋白樣品上樣量為 5 L,與4SDS蛋白上樣緩沖液按體積比31混合、煮沸,進(jìn)行SDS凝膠電泳,設(shè)置恒壓120 V。2 結(jié)果分析2.1 重組B.subtilis的構(gòu)建2.1.1 普魯蘭酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶在B.subtilis中的胞外表達(dá),根據(jù)B.subtilis密碼子偏好性合成N-端融合信號肽AprE的普魯蘭酶基因,并克隆至質(zhì)粒pUC57。再以重組質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增AprE-普魯蘭酶基因片段。結(jié)果如圖1-a所示,PCR產(chǎn)物在2 0003 000 bp間有明顯條帶,與目的基因的理論大小

13、(2 259 bp)一致。使用引物對Pul-plasmid-F/R擴(kuò)增pP43 NMK表達(dá)質(zhì)粒骨架。如圖1-b所示,PCR產(chǎn)物在7 500 bp處有明顯條帶,與質(zhì)粒大小吻合。以上片段通過無縫克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒P43-Pul,導(dǎo)入E.coliJM109中,轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證。如圖1-c所示,PCR產(chǎn)物與目標(biāo)條帶的理論大小(2 767 bp)一致。轉(zhuǎn)化子測序正確后,獲得普魯蘭酶表達(dá)質(zhì)粒P43-Pul。a-合成基因片段PCR擴(kuò)增；b-pP43 NMK質(zhì)粒骨架擴(kuò)增；c-重組菌菌落PCRa-M-1 kb Marker,1-Pul合成基因擴(kuò)增片段驗(yàn)證；b-M-15 kb Marker,1-pP43 NM

14、K質(zhì)粒擴(kuò)增片段驗(yàn)證；c-轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證圖1 普魯蘭酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.1 Construction and verification of pullulanase recombinant plasmid2.1.2 普魯蘭酶表達(dá)質(zhì)粒在B.subtilis中的表達(dá)將質(zhì)粒P43-Pul轉(zhuǎn)入B.Subtilis WB600并在含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上生長。將單菌落經(jīng)LB種子液活化后,接種至TB培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程曲線如圖2所示,通過測量取樣,發(fā)酵36 h后普魯蘭酶達(dá)到最高酶活力,為29.6 U/mL。圖2 普魯蘭酶在B.subtilisWB600中的發(fā)酵過程曲線Fig.2 Fer

15、mentation curve of pullulanase inB.subtilisWB600發(fā)酵結(jié)束后,對上清液進(jìn)行SDS,如圖3所示。根據(jù)氨基酸序列預(yù)測該酶的理論分子質(zhì)量為79 kDa,在約79 kDa處檢測出明顯條帶,說明目的基因成功在B.subtilis中異源表達(dá)。M-蛋白質(zhì)marker；1-普魯蘭酶發(fā)酵12 h的粗酶液；2-普魯蘭酶發(fā)酵24 h的粗酶液；3-普魯蘭酶發(fā)酵30 h的粗酶液；4-普魯蘭酶發(fā)酵36 h的粗酶液；5-普魯蘭酶發(fā)酵42 h的粗酶液圖3 重組普魯蘭酶的SDS電泳分析圖Fig.3 SDSanalysis of the recombinant pullulanase

16、2.1.3 普魯蘭酶啟動子的優(yōu)化蛋白的表達(dá)始于靶基因的有效轉(zhuǎn)錄,而轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度直接受啟動子控制20。為進(jìn)一步增強(qiáng)普魯蘭酶表達(dá),選取多種強(qiáng)啟動子替換原有啟動子P43,包括合成組成型P22316,P55616,P56616和P636617,天然組成型PlytR15,誘導(dǎo)型PxylA18和自誘導(dǎo)型PsrfA15(表2)。誘導(dǎo)型啟動子PxylA在菌體OD600值達(dá)到0.4時(shí)添加3%的木糖；其他啟動子發(fā)酵條件同P43一致。搖瓶發(fā)酵后,統(tǒng)一在36 h測定普魯蘭酶酶活力。如圖4所示,除合成啟動子P223和自誘導(dǎo)啟動子PsrfA,其他5株啟動子替換的重組菌酶活力均有明顯提高。在P566啟動子下,重組菌的酶活力在3

17、6 h達(dá)到最高值58.1 U/mL,是優(yōu)化前的1.96倍(圖4)。這說明通過替換強(qiáng)啟動子來提高蛋白表達(dá)是一種有效的策略。然而,P566啟動子是P43啟動子強(qiáng)度的500多倍16,但在普魯蘭酶表達(dá)中效果有所下降。一個(gè)重要原因是蛋白表達(dá)是復(fù)雜過程,既取決于酶基因序列及其表達(dá)元件(如啟動子),也受制于發(fā)酵條件。圖4 啟動子對普魯蘭酶表達(dá)的影響Fig.4 The influence of promoters on the expression of pullulanase2.2 發(fā)酵條件對普魯蘭酶表達(dá)的影響2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化不同種類的培養(yǎng)基對重組菌的生長與產(chǎn)酶影響較大。本研究首先使用單因

18、素優(yōu)化,來確定培養(yǎng)基的最佳組分,發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。圖5 培養(yǎng)基組分對普魯蘭酶表達(dá)的影響Fig.5 Effect of medium components on the expression of pullulanase氮源是微生物生長所必須的基礎(chǔ)物質(zhì)21。本研究使用了2種無機(jī)氮源(尿素和硫酸銨)、3種有機(jī)氮源(胰蛋白胨、玉米漿、酵母膏)來考察對于普魯蘭酶生產(chǎn)的影響。如圖5所示,以玉米漿為氮源時(shí)酶活力最高為66.3 U/mL,其余依此為胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、尿素?？傮w而言,有機(jī)氮源更有利于酶的表達(dá)。碳源是是蛋白中心骨架構(gòu)成的重要元素22。如圖5所示,以葡萄糖為碳源時(shí)酶活力最高,為6

19、1.2 U/mL。金屬離子可以改變細(xì)胞膜通透性以促進(jìn)蛋白分泌23。本研究選擇了5種金屬離子考察對產(chǎn)酶的影響。盡管添加Ca2+時(shí)可提高18%的酶活力,但Zn2+、Al3+添加后卻導(dǎo)致酶活力大幅下降,說明金屬離子并不一定利于普魯蘭酶胞外表達(dá),跟金屬離子價(jià)位也無明顯關(guān)系。此外,不同培養(yǎng)基可使酶活力差異達(dá)到1.7倍,進(jìn)一步了證明發(fā)酵條件對酶表達(dá)的重要性。然而,將各單因素最佳條件直接組合,會陷入局部最優(yōu)的情況,而非全局最佳的情況。2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理,對每個(gè)組分質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化并設(shè)計(jì)了4因素3水平 BBD 實(shí)驗(yàn),因素編碼情況見表3,通過Design Ex

20、pert V8.06設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及分析結(jié)果(表4),模型評價(jià)結(jié)果見表5所示。表3 因素水平編碼表Table 3 Coding table of factors and levels表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken表5 回歸模型方差分析表Table 5 Variance analysis of experimental results根據(jù)BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),建立了酶活力與培養(yǎng)基組分間的回歸方程：酶活力=15.70+1.52A+1.71B-2.61C+101.80D+0.08AB+0.31AC-1.70AD-0.3

21、0BC-0.59BD+1.29CD-0.18A2-0.03B2+1.04C2-39.40D2。由模型顯著性檢驗(yàn)表明,P值和失擬項(xiàng)分別為0.001 3(顯著)和0.294 8(不顯著),說明擬合程度較好。此外,模型R2為0.85,說明能解釋約85%總變異,可信度較好。基于此,軟件預(yù)測培養(yǎng)基的最佳組分為玉米漿14.8 g/L,蛋白胨7.3 g/L,葡萄糖17.5 g/L,Ca2+1.2 mmol/L。在此條件下,發(fā)酵36 h后酶活力達(dá)到129.4 U/mL,相比培養(yǎng)基優(yōu)化前提高了4.4倍。與單因素優(yōu)化相比,基于模型擬合的響應(yīng)面優(yōu)化效果更為明顯；與全因子組合實(shí)驗(yàn)(43)相比,實(shí)驗(yàn)方案僅有29組,顯著減少了實(shí)驗(yàn)工作量。2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L罐培養(yǎng)在5 L罐上進(jìn)行放大培養(yǎng),發(fā)酵過程如圖6所示。接種8 h內(nèi),殘?zhí)墙档?7%為14.1 g/L,OD600達(dá)到12(為最大值的26%)。表明此時(shí)為細(xì)胞生長前期,對營養(yǎng)物質(zhì)需求較少。此后,OD600迅速增加,殘?zhí)菐缀跖cOD600完全呈相反態(tài)勢,快速降低。在24 h左右,OD600首次超過最大值的80%,此后細(xì)胞生長明顯放緩。恰好此時(shí)殘?zhí)且彩状谓档椭裂a(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)(溶氧開始反彈,殘?zhí)菫?.65,5)。由于B.subtilis在營養(yǎng)貧瘠時(shí)會形成芽胞以抵御不良情況,并且芽