蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)研究

1、蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)研究【摘要】目的認(rèn)識(shí)蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用活性的影響及蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用的熒光性質(zhì)。方法用酶活性法觀察蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性的影響；用紫外光譜和熒光光譜研究蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用的光譜性質(zhì)。結(jié)果蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性可產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制劑常數(shù)K1=6.1310-5l/L；蘇木素對(duì)胰蛋白酶的熒光猝滅效應(yīng)為靜態(tài)猝滅；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。結(jié)論蘇木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，使胰蛋白酶分子構(gòu)象發(fā)生變化?！娟P(guān)鍵詞】蘇木素胰蛋白酶熒光光譜紫外光譜酶活性中藥蘇木的主要成分蘇木素(Haeatrylin)是組織、病理實(shí)驗(yàn)室中最常用的染

2、色劑，可用于細(xì)胞核染色1。蘇木素具有收縮血管、中樞抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消腫、止痛的成效2。胰蛋白酶(trypsin)是人和動(dòng)物腸道中一種重要的蛋白水解酶，從該酶被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們對(duì)其進(jìn)展了一定的研究，如用胰蛋白酶為催化劑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)展降解的研究35。藥物對(duì)胰蛋白酶作用的性質(zhì)6及蘇木素與DNA作用的性質(zhì)的研究已引起重視7。本文主要通過(guò)紫外和熒光光譜法研究蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)，從而獲得蘇木素與胰蛋白酶作用時(shí)構(gòu)造變化、所處微環(huán)境等信息，討論蘇木素與胰蛋白酶互相作用的機(jī)制，并對(duì)蘇木素與胰蛋白酶作用活性的影響也進(jìn)展了研究。1器材1.1儀器熒光分光光度計(jì)，美國(guó)aryElipse瓦里安產(chǎn)品；

3、雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TU1901，北京普析產(chǎn)品；pH3型酸度計(jì)，上海精細(xì)科學(xué)儀器產(chǎn)品。1.2藥品牛胰蛋白酶生化試劑，上海海洋生物技術(shù)產(chǎn)品；蘇木素生物染色劑BS，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品；硼酸分析純，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。2方法2.1蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性影響在恒溫水浴箱中將酪蛋白、胰蛋白酶和蘇木素預(yù)熱，按酶活性的測(cè)定方法，在胰蛋白酶與酪蛋白的酶解反響體系中參加不同體積的蘇木素溶液，測(cè)定蘇木素對(duì)酶活性的影響。胰蛋白酶活性及抑制常數(shù)測(cè)定參照文獻(xiàn)8方法操作。2.2蘇木素對(duì)胰蛋白酶紫外光譜的影響配制pH7.5的硼酸緩沖溶液內(nèi)含0.1l/Lal2維持離子強(qiáng)度；用硼酸緩沖溶液配制1.010-4l/L的胰

4、蛋白酶溶液，再用3次蒸餾水分別配制2.010-3l/L和1.010-3l/L的蘇木素溶液。室溫條件下，在11的石英比色皿中準(zhǔn)確參加1.010-4l/L的胰蛋白酶溶液3.0l，掃描190350n的吸收光譜。然后用微量注射往其中準(zhǔn)確參加1.010-3l/L的蘇木素溶液10l，混勻，靜置2in后掃描190350n的吸收光譜。掃描1.010-3l/L蘇木素溶液190350n的吸收光譜。2.3蘇木素對(duì)胰蛋白酶熒光光譜影響在11的石英比色皿中準(zhǔn)確參加1.010-4l/L的胰蛋白酶溶液3.0l，用微量注射器分別參加2.010-3l/L的蘇木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70l。每次參加后混勻

5、，放置5in，分別在20，25，30，35下，測(cè)定其熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為280n，繪制288450n的熒光光譜。2.4蘇木素對(duì)胰蛋白酶作用的同步熒光將“2.3項(xiàng)下所配的溫度為298K的溶液，固定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)間隔分別為20n和60n，同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)并記錄同步熒光光譜。3結(jié)果3.1蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性的影響蘇木素對(duì)胰蛋白酶有抑制作用，當(dāng)蘇木素濃度為4.510-4l/L時(shí)，蘇木素使胰蛋白酶的相對(duì)活性下降到70.2%，抑制率為29.8%。在不同的底物濃度40，30，20，10g/L酪蛋白溶液下，按酶活性的測(cè)定方法測(cè)定酶的反響速度，其結(jié)果以1/v對(duì)抑制劑量用Dixn作圖法求出Ki=6.1310

6、-5l/L，抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。3.2蘇木素對(duì)胰蛋白酶紫外吸收光譜影響圖1為T(mén)298K，pH7.4時(shí)的吸收光譜。蛋白質(zhì)分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基均有紫外吸收，蛋白質(zhì)的吸收波長(zhǎng)一般在280n附近。從圖1可以看出，當(dāng)往胰蛋白酶中參加蘇木素后，混合溶液在280n附近的吸收峰均明顯增高，說(shuō)明蘇木素與胰蛋白酶之間發(fā)生了作用，改變了胰蛋白酶的構(gòu)象,而這種作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基的*電子躍遷。3.3熒光光譜以ex280n，胰蛋白酶在354n附近有很強(qiáng)的熒光峰；而以同樣激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)蘇木素溶液，在354n附近那么沒(méi)有熒光峰，證明蘇木素不會(huì)產(chǎn)生與胰蛋白酶干擾的熒光。固定胰

7、蛋白酶的量，隨著體系中蘇木素濃度的增加，胰蛋白酶的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，其最大發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生明顯的變化見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.4熒光猝滅常數(shù)及猝滅機(jī)理3.4.1蘇木素對(duì)胰蛋白酶的猝滅效應(yīng)一般情況下，可根據(jù)不同溫度下的結(jié)果區(qū)別是動(dòng)態(tài)猝滅，還是靜態(tài)猝滅。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，隨著溫度升高，將增加離子有效碰撞的數(shù)目，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大。而對(duì)于靜態(tài)猝滅那么溫度升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)減校本文以一樣的實(shí)驗(yàn)條件，分別測(cè)定了在20，25下胰蛋白酶的熒光猝滅光譜，以F0/F1對(duì)作SternVler圖見(jiàn)圖3。從圖3可以看出蘇木素在溫度低于25時(shí)猝滅常數(shù)隨溫度

8、的升高而降低，即符合靜態(tài)猝滅機(jī)理。當(dāng)猝滅體分子和熒光物質(zhì)分子之間形成新的復(fù)合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí)，服從Lineeaver-Burk方程。20，25時(shí)以F0F1對(duì)1擬合Lineeaver-Burk方程，由圖4可見(jiàn)該雙倒數(shù)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，再次確定在20，25時(shí)為靜態(tài)猝滅。3.4.2結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及結(jié)合常數(shù)KA的計(jì)算設(shè)蘇木素與胰蛋白酶形成n個(gè)結(jié)合點(diǎn)位的復(fù)合物那么有：LgF0F/FlgKA+nlg分別作不同溫度下LgF0F/Flg的雙對(duì)數(shù)擬合，得到不同溫度下的KA和n見(jiàn)表1。表1蘇木素與胰蛋白酶的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)略3.4.3作用力類(lèi)型確實(shí)定猝滅體與生物大分子之間的互相作用力主要有氫

9、鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力。根據(jù)以下公式計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表2。表2蘇木素與胰蛋白酶作用的熱力學(xué)參數(shù)略ln(K2/K1)=H(1/T1-1/T2)/RG=-RTlnKS=(H-G)/T由上可知，H0和S0，可以說(shuō)明蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力9。3.4.4蘇木素對(duì)胰蛋白酶構(gòu)象的影響固定激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的間距，掃描同步熒光光譜，這種光譜可用于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析,由(a)20n所得到的同步熒光光譜圖僅顯示的是酪氨酸殘基的熒光，(b)60n時(shí)僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光，由圖5可以看出在此實(shí)驗(yàn)條件下，酪氨酸和色氨酸殘基熒光同時(shí)被猝滅，使其熒光強(qiáng)度下降，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波

10、長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生改變，但色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了藍(lán)移，說(shuō)明色氨酸基所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，引起了胰蛋白酶的構(gòu)象變化。4結(jié)論蘇木素對(duì)胰蛋白酶活性可產(chǎn)生非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制劑常數(shù)Ki=6.1310-5l/L；蘇木素對(duì)胰蛋白酶的熒光猝滅效應(yīng)為靜態(tài)猝滅，說(shuō)明蘇木素能與胰蛋白酶形成復(fù)合物；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力；蘇木素與胰蛋白酶可發(fā)生作用，改變了胰蛋白酶的構(gòu)象，而色氨酸所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)顯著?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1鄭偉.蘇木素染液中媒染劑用量的討論J.解剖學(xué)雜志，2022，291：21.2江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典S上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1988：10843朱少娟，施用暉，樂(lè)國(guó)偉.

11、超聲波對(duì)胰蛋白酶水解酪蛋白的影響J.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2022，242:50.4IZERKinetianalysisfenzyeinativatinundersend-rdernditinsbyusefsubstrate-t-prdutprgressurves：Appliatintinhibitinftrypsinby-1prteaseinhibitrJAnalytialBiheistry，1998，264：199.5AIQing，SHIGui-xin，BEiJian-zhng，eta1Enzyatidegradatinbehavirandehanisfply(1atide-glylide)fasbytrypsinJBiaterials，2022，24：629.6刁家志，陸珊，趙巍，等.葛根素與胰蛋白酶互相作用研究J.化學(xué)研究與應(yīng)用，2022，183：280.7王興明，黎泓波，胡亞敏，等.蘇木素與DNA互相作用的光譜研究J.化學(xué)學(xué)報(bào)，202