離子交換層析實驗報告

1、離子交換層析實驗報告實驗目的和要求：1、學習離子交換層析的基本原理2、學習離子交換層析別離蛋白質的基本方法和技術3、學習蔗糖酶活性檢測的基本原理和方法實驗內容和原理：1、離子交換層析由于蔗糖酶的pi偏酸性，所以在ph7. 3緩沖液的環(huán)境中，粗別離純化樣品 蔗糖酶帶負電荷，因此我們用陰離子交換劑可以先與蔗糖酶樣品可逆交換吸附， 然后通過用鹽離子強度逐漸提高的洗脫液，使蔗糖酶和其他雜蛋白質的電荷被中 和，與離子交換劑的親和力降低，把不同的蛋白質按所帶電荷的強弱逐一被洗脫 下來，從而到達別離蔗糖酶的目的。2、酶活力檢測實驗材料和主要儀器：1、實驗材料蔗糖酶粗別離純化(溶解即為樣品注2、實驗試劑(1)

2、deae-sepharose fast flow(220mmol/l tris-hcl ph7. 3 緩沖液(3)20mmol/l tris-hcl (lmol/1 nacl) ph7. 3 緩沖液(4) 0. 2mol/l 乙酸 緩沖液,ph4.5(55%蔗糖溶液(6)3, 5-二硝基水楊酸試劑3、實驗儀器(1)高速冷凍離心機(2)層析柱(1. 0X20cm (1 支/組(3) aktatm start (1 套/組)(4)局部收集器及收集試管(4ml/管)(1臺/組)(5) 20冰箱保存樣 品用)(6)微量移液槍200ul、lOOOul(7) 1.5ml離心管1留樣品出和樣品iv用(8)

3、7nli離心管(留樣品iv用)(9)恒溫水浴(50、100)(10)試管、移液管、試管架等實驗方法和步驟：1、儀器連接(1)接通各儀器電源，將a, b泵頭分別放置a, b兩個溶液瓶中。注意b為 含nacl溶液。(2)點擊電腦桌面上unicorn軟件圖標，翻開軟件。選擇system control，點擊ok,進入操作界面。點擊connect(3)在操作界面的工具欄，點擊mannual runo出現(xiàn)flowrate窗口，調節(jié) flowrate 為 Iml/min,確定。2、裝柱與平衡(1)檢查層析柱的兩端接頭，底端有膜的置于下方。(2)程序暫停。將層析柱放入卡槽，上端接頭與混合器(mixer)相連

4、，下端 接頭與樣品閥(sample valve)相連。(3) buff era 平衡一個柱體積(約 20nli=20min)3、加樣停止加入20mmol/l tris-hcl ph7. 3緩沖液。待緩沖液液面與膠體外表相切 時，程序暫停pause。旋開柱上方接頭，用膠頭滴管緩慢將5ml蔗糖酶蛋白樣品 溶液樣品道)加入層析柱中，注意順著柱壁滴加，盡可能保持膠面平整。程序 繼續(xù)continue,使樣品溶液進入膠體，待樣品溶液完全進入膠體后，程序暫停 pause,用少量洗脫緩沖液將剩余在層析柱壁上端的樣品洗下，并完全進入膠體 后，再加緩沖液至一定高度。4、洗脫(梯度洗脫法)(1)加樣后，先用buff

5、era進行洗脫，洗去未被凝膠吸附的雜蛋白(20min 左右)；(2)待層析柱流出液在儀器上繪出的基線穩(wěn)定，在程序主界面的工具欄 manual -* executemanual instruction - pumps f gradient, 在兩個框內均 填入100,點擊insert,最后點擊一次execute,開始梯度洗脫。每2min接一 管，當conductivity上升至8 ms/cm時，開始測定各管的蔗糖酶活力；(3)將蔗糖酶活力高的假設干管酶液(2-3管)合并，測量總體積v4 (樣品iv), 樣品用7ml離心管一 20c保存。5、蔗糖酶活力檢測實驗數(shù)據(jù)記錄和處理：上次實驗粗提取的蔗糖酶

6、蛋白溶液v3=12. 3ml本次實驗加樣的蔗糖酶蛋白溶液v3 =5. oml蔗糖酶活力高的兩管酶液合并 后 v4=4. oml實驗結果和分析：1、洗脫曲線(1) uv曲線在55-70min時，uv曲線有兩個峰值，這是未被凝膠吸附的雜蛋白的表達。 85-95min的峰值性狀較為“規(guī)準”，但經(jīng)過活性檢測發(fā)現(xiàn)為雜蛋白。3105-120min有一個峰值較小的峰，經(jīng)過活性檢測其中含有活性較高的蔗糖 酶。(2)在73min左右，buffervalvc b的值瞬間上升，這是由于操作失誤導致 的。當時直接把buffer valve的閥門由a轉換到b,而沒有一個梯度的上升。但好在及時止 損，開始了正確的操作。正

7、確操作：”在程序主界面的工具欄manual -* execute manual instruction pumps gradient,在兩個框內均填入 100,點擊 insert,最后 點擊一次execute,開始梯度洗脫?！?3 ) conductivity的值隨著buffer b濃度的增長而增長導電性增加。2、蔗糖酶活力檢測比照圖如圖示，從左到右，第3管和第5、6管都分別有較深的顏色(由于手機、 光線等原因，圖示顏色比實際顏色要淺，實際顏色更深)，說明在對應的兩個時 間段內洗脫出活性較高的蔗糖酶。實驗討論和心得:1、如上所述，在層析柱流出液在儀器上繪出的基線穩(wěn)定后進行buffer b 的梯度洗脫時，進行了錯誤的操作(直接將buffer valve的閥門由a轉換到b), 這導致了 buffer b濃度的突然上升，在之后一段時間內，較高濃度的buffer b 可能將柱上局部蔗糖酶與雜蛋白一起洗脫下去，導致之后的第一個峰沒能夠檢測 出目標蛋白。2、什么是梯度洗脫？梯度洗脫(gradient elution)又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析 周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。在同一個分析 周期中，按一定程度不斷改