食源性疾實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)要點(diǎn)

1、食源性疾病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)要點(diǎn) 溫州市CDC 李小春概述食物中毒應(yīng)急處理與現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查食源性疾病/食源性致病菌監(jiān)測(cè)預(yù)警現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中的實(shí)驗(yàn)室支持概述食源性疾病 指由攝取食物而進(jìn)入人體內(nèi)各種致病因素引起的通常為感染或中毒的一類(lèi)疾病WHO食物中毒 攝入了含有生物性、化學(xué)性有毒有害物質(zhì)的食品或者把有毒有害物質(zhì)當(dāng)作食品攝入后出現(xiàn)非傳染性(不屬于傳染性)的急性、亞急性疾病.GB14938-94食源性疾病有爆發(fā)和散發(fā)兩種形式，食物中毒是食源性疾病的爆發(fā)形式突發(fā)公共衛(wèi)生事件 是指突然發(fā)生或者可能發(fā)生，直接影響到公眾健康和社會(huì)平安,需要緊急應(yīng)對(duì)的公共衛(wèi)生事件?突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急條例?1、生物病原體所致疾病 2、食物中

2、毒 3、不明原因群體性疾病 4、有毒有害因素污染造成的群體中毒 5、職業(yè)中毒 6、自然災(zāi)害、事故災(zāi)難、突發(fā)社會(huì)平安事件引發(fā)的健康問(wèn)題 7、三恐事件 8、其它嚴(yán)重影響公眾健康事件“食物恐怖的定義為：以化學(xué)性、生物性、放射性等有害物質(zhì)，蓄意污染食品，導(dǎo)致人群傷害或死亡，破壞社會(huì)經(jīng)濟(jì)或政局穩(wěn)定的行動(dòng)或危險(xiǎn)。2002年，世界衛(wèi)生組織召開(kāi)專(zhuān)家會(huì)議，制定了“建立與強(qiáng)化預(yù)防和應(yīng)急反響體系的導(dǎo)那么。世衛(wèi)組織警告，人畜共患疾病、食品恐怖主義、食品污染和食源性疾病等正在威脅全球的食品平安。 食物恐怖食源性疾病的特點(diǎn)分布廣泛，對(duì)開(kāi)展中國(guó)家和興旺國(guó)家都存在嚴(yán)重威脅 WHO資料顯示： 工業(yè)化國(guó)家，每年患病率達(dá)30。 開(kāi)

3、展中國(guó)家的流行狀況難以估計(jì) 2000年210萬(wàn)人死于腹瀉病 腹瀉還是造成嬰幼兒和兒童營(yíng)養(yǎng)不良的 主要原因食源性疾病的特點(diǎn)對(duì)經(jīng)濟(jì)開(kāi)展存在重大威脅 醫(yī)療護(hù)理、爆發(fā)調(diào)查、生意破產(chǎn)、不合格產(chǎn)品的回收、勞動(dòng)力損失、法律索賠等等的形式造成實(shí)際的經(jīng)濟(jì)損失。最主要的危害來(lái)自于生物性污染目前在所有國(guó)家中食源性疾病的發(fā)病率都有上升趨勢(shì) 1.經(jīng)濟(jì)全球化趨勢(shì)，人員交往頻繁，物資交流大幅度增長(zhǎng)，交通興旺，旅游業(yè)開(kāi)展，使世界變小了，傳播更為迅速。 如全球國(guó)際航線(xiàn)旅客從1950年100萬(wàn)人次/年，至2000年到達(dá)1300萬(wàn)人次/年。同期農(nóng)產(chǎn)品貨物貿(mào)易也增長(zhǎng)了五倍。 食源性疾病增長(zhǎng)的原因每 個(gè)人都面臨患食源性疾病的危險(xiǎn)食源性

4、疾病大多數(shù)是可以預(yù)防的。食源性疾病增長(zhǎng)的原因2.經(jīng)濟(jì)開(kāi)展都市化進(jìn)程加快，大量農(nóng)村人口擁向城市，尤其是在城市城鄉(xiāng)結(jié)合部和小城鎮(zhèn)由于供水、排污、住房及有關(guān)公共衛(wèi)生設(shè)施嚴(yán)重超負(fù)荷，環(huán)境污染嚴(yán)重，自?xún)糇饔萌笔Вq如人體“腸梗阻，容易造成各種疾病的傳播與爆發(fā)。 食源性疾病增長(zhǎng)的原因3.農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)和食品加工的規(guī)?；弯N(xiāo)售供給的商品化，如果其中某種食品被污染,其涉及面和受感染人群的范圍，可遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出過(guò)去一家一戶(hù)或某一局部地區(qū)的食源性疾病的傳播擴(kuò)散的范圍。食源性疾病增長(zhǎng)的原因4.人口老齡化，因器官移殖，免疫抑制劑使用和侵襲性操作大量應(yīng)用及抗生素濫用，免疫受損人群和醫(yī)院內(nèi)感染也不斷增加。5.人們生活方式、行為方

5、式的變化。如冰箱的普及，使單抗細(xì)胞增生李斯特菌等嗜冷菌的感染容易發(fā)生。 食源性疾病增長(zhǎng)的原因 我省是自然災(zāi)害較多的省份，經(jīng)濟(jì)開(kāi)展和工業(yè)化、都市化及人口老齡化是國(guó)內(nèi)各省市中最快的省份之一。所以上述因素對(duì)浙江的影響，必須有充分的估計(jì)和防范,尤其是突發(fā)重大疫情的防范應(yīng)有充分的準(zhǔn)備。食源性疾病的分類(lèi)食物中毒急性食源性腸道傳染病食源性寄生蟲(chóng)病變態(tài)反響性疾病食物過(guò)敏暴飲暴食引起的急性胃腸炎等一次大量或長(zhǎng)期低劑量攝入某些有毒、有害物質(zhì)引起的以慢性毒害為主要特征的疾病，食物營(yíng)養(yǎng)不平衡所造成的某些慢性疾病等 食物中毒應(yīng)急處理與現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查 為了及時(shí)準(zhǔn)確掌握食物中毒發(fā)生原因，積極采取有效防范措施，在食物 中毒調(diào)查時(shí)，

6、要按照一定程序開(kāi)展工作。 ?食物中毒事故處理方法? 衛(wèi)生部1999 ?食品衛(wèi)生監(jiān)督程序? 衛(wèi)生部1997年 ?突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急條例? 國(guó)務(wù)院2003年5月7日 相關(guān)法律法規(guī)食物中毒應(yīng)急處理組織與職責(zé) 食物中毒應(yīng)急處理涉及 衛(wèi)生行政部門(mén) 衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu) 疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu) 醫(yī)療救治機(jī)構(gòu) 其他有關(guān)部門(mén)食物中毒報(bào)告、信息管理制度 1.食物中毒一般報(bào)告制度 2.食物中毒緊急報(bào)告制度食物中毒應(yīng)急處理準(zhǔn)備一、應(yīng)急處理準(zhǔn)備原那么要求“預(yù)防為主、常備不懈 二、重大食物中毒應(yīng)急處理準(zhǔn)備與支援一食物中毒監(jiān)測(cè)與預(yù)警二資金儲(chǔ)藏三食物中毒物資準(zhǔn)備三、食物中毒應(yīng)急處理演練四、預(yù)防和控制食物中毒的宣傳和公眾教育 食物中毒應(yīng)

7、急物資準(zhǔn)備1.食物中毒事故應(yīng)急處理專(zhuān)用車(chē)輛2.采樣用物品3.音像取證工具4.現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)、測(cè)量設(shè)備5.法律文書(shū)：6.參考資料7.其它有關(guān)物品：病因初步判斷 病癥體征 微生物食物中毒大多為急性弧菌中毒表現(xiàn)為嘔吐、瀉水、脫水、體溫下降等；沙門(mén)菌胃腸炎病癥。如霍亂、志賀菌中毒表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、發(fā)熱等；變形桿菌中毒以上腹部刀絞樣疼痛及急性胃腸炎病癥為主；葡萄球菌腸毒素引起胃腸炎，神經(jīng)系統(tǒng)病癥肉毒毒素、真菌毒素、化學(xué)毒物；呼吸道病癥鏈球菌等.初步病因判斷潛伏期 平均潛伏期意義：是確診標(biāo)準(zhǔn)之一；用于估計(jì)事故發(fā)生開(kāi)展態(tài)勢(shì)；決定調(diào)查起點(diǎn)餐次；確定采取防治措施的時(shí)間范圍，并考核防治措施效果。病因初步判斷4類(lèi)食物

8、中毒的潛伏期一般是： 5 L 液體食品 致病菌或毒物分析 可疑食物200ml 固體食品 致病菌或毒物分析 可疑食物200g 嘔吐物 致病菌或毒物分析 50g(ml) 洗胃液 致病菌或毒物分析 200ml 腹瀉物 致病菌或毒物分析 50g(ml) 血液 病原別離、抗體分析 5ml 腦脊液 病原別離 2ml 皮損分泌物 病原分析 滅菌生理鹽水浸泡棉簽涂取采多少所有標(biāo)本在采集時(shí)立即分裝，一式 N 份(不同檢驗(yàn)工程、重復(fù)實(shí)驗(yàn)、其它實(shí)驗(yàn)室復(fù)核、留樣) 采什么樣 對(duì) 照內(nèi)對(duì)照外對(duì)照爆發(fā)性食源性疾病多途徑傳播疾病大腸桿菌O157:H7 潛伏期長(zhǎng)的疾病傷寒、李斯特菌等非消化道病癥的疾病水源性傳播疾病需注意什么

9、時(shí)間采 采樣時(shí)間血清：如疑心是沙門(mén)菌、變形桿菌、致瀉大腸艾希菌食物中毒時(shí)，應(yīng)分別在患者急性期3天以?xún)?nèi)和恢復(fù)期2周左右各采取血液23毫升，待凝固時(shí)別離血清，做抗體滴度測(cè)定。如做血液細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)將采取的血液直接注入含有玻璃株的無(wú)菌小燒瓶中進(jìn)行振搖，然后參加相應(yīng)培養(yǎng)基或直接將血液注入培養(yǎng)基中。如疑心副溶血性弧菌食物中毒時(shí)，應(yīng)分別在患者中毒12天和1周時(shí)采取血液做抗體滴度測(cè)定。 因1周后抗體就降低或消失。病毒別離標(biāo)本最好在發(fā)病初期1-2天采樣 品 采 集怎么采不同檢驗(yàn)?zāi)康牡臉悠芳?xì)菌別離 病毒別離抗原-抗體檢測(cè)化學(xué)毒物檢測(cè)無(wú)菌部位基因檢測(cè)木制的棉拭子 ？食物中毒事件怎么采 糞便可直接采取或采便管插入直

10、腸采集；嘔吐物可注入滅菌試管內(nèi)，由于胃酸能使樣品為酸性，不利于細(xì)菌的存活，所以應(yīng)在采集的嘔吐物內(nèi)參加10蘇打予以中和，以保持細(xì)菌的活性。咽喉涂抹樣可用棉簽涂擦咽喉部采取洗胃液直接抽取注入滅菌容器內(nèi)。血液血樣的采集應(yīng)盡早抽取患者的血液，在中毒患者急性期必要時(shí)可作血樣培養(yǎng)，但主要是用來(lái)檢測(cè)患者血液中的抗體。一般需采血二次以上，第一次在發(fā)病初期(3天以?xún)?nèi))，第二次是在恢復(fù)期(2周左右)，假設(shè)患者血中抗體呈明顯上升趨勢(shì)，即可證實(shí)其受到過(guò)相應(yīng)致病菌的感染。方法是從肘靜脈采取血液23ml，注入干熱滅菌試管內(nèi)，使成斜面，待凝固后，分出血清送檢。如做血液細(xì)菌培養(yǎng)，可直接注入滅菌并帶有玻璃珠的三角瓶中，立即振搖

11、數(shù)分鐘，以防凝固，然后送檢。食物中毒事件怎么采(3)對(duì)可疑中毒患者在解剖前不要將尸體用福爾馬林、酒精等化學(xué)物處理，解剖臺(tái)要沖洗干凈，所用的解剖器具、手套要預(yù)先沖洗干凈、晾干備用，不要沾染消毒藥液如來(lái)蘇、酒精、升汞溶液等以免污染了檢材。例如在解剖時(shí)使用了升汞溶液浸泡過(guò)的手套，手套上的升汞就可能對(duì)樣本污染，會(huì)干擾了病因的判定。在尸體周?chē)灰獓姙⑥r(nóng)藥滅蚊蠅，以免污染可能用于毒物分析的檢材。尸體解剖檢樣可采取胃腸內(nèi)容物、臟器、腸系膜淋巴結(jié)及血液等。內(nèi)容物用滅菌注射器或滅菌器械采取，置入滅菌瓶?jī)?nèi)；臟器應(yīng)先用烙鐵燒灼消毒外表，再用解剖刀剪和鑷子取內(nèi)部檢樣1020克，置于滅菌容器內(nèi)送檢。血液及體液用滅菌注射

12、器直接抽取或用滅菌棉簽蘸取。對(duì)死亡患者一般從心腔內(nèi)采集血液，也可采集腋下靜脈、頸靜脈、股靜脈血液，心腔內(nèi)血液和周?chē)卸疚餄舛炔煌Ｔ趺床?樣品采集程序 采樣用物品準(zhǔn)備 采樣程序方法 采樣紀(jì)錄 樣品編號(hào) 樣品保存 使用衛(wèi)生部統(tǒng)一制定的采樣記錄文書(shū)，經(jīng)有關(guān)責(zé)任人員簽字后送檢；注意樣 品 采 集影響采樣的主要因素缺乏及時(shí)性： 由于一些消費(fèi)者對(duì)?食品衛(wèi)生法?觀(guān)念淡薄，缺乏自我保護(hù)意識(shí)，食源性疾病發(fā)生后他們不是首先及時(shí)向衛(wèi)生監(jiān)督部門(mén)報(bào)告疫情，而是自己先與經(jīng)營(yíng)者交涉，在不能如愿的情況下才向衛(wèi)生監(jiān)督部門(mén)舉報(bào)，因此造成一是經(jīng)營(yíng)者在得知發(fā)生食源性疾病的情況后，首先處理掉一切可疑剩余食品，對(duì)加工經(jīng)營(yíng)現(xiàn)場(chǎng)、工具、

13、容器作了相應(yīng)的處理；二是延誤了報(bào)告的時(shí)間，從而影響了對(duì)可疑食品和病人排泄物的采集。采樣缺乏代表性： 由于食源性疾病多是突發(fā)性的，如細(xì)菌性食物中毒都有特定的潛伏期，最短1h 3h，一般5h 10h ，但當(dāng)衛(wèi)生監(jiān)督部門(mén)接到疫情到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)后，往往時(shí)間周期間隔較長(zhǎng)，可疑食物已清理，即使采到幾份剩余食物，也可能不是當(dāng)日餐桌上剩余菜肴，因此，常常出現(xiàn)食品中檢出的細(xì)菌與病人排泄物中檢出的細(xì)菌不相符，影響了結(jié)果的分析。 影響采樣的主要因素食品加工制作現(xiàn)場(chǎng)各環(huán)節(jié)的采樣往往能提供一些線(xiàn)索，但常常見(jiàn)到現(xiàn)場(chǎng)已被清掃，食具和用具已清洗干凈，同樣也影響了食品加工工具、容器、場(chǎng)所的采樣和檢驗(yàn)。采樣缺乏典型性：中毒病人發(fā)病后，

14、患者一般開(kāi)始時(shí)白行用抗菌毒，嚴(yán)重時(shí)才去當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療，由于一些醫(yī)務(wù)人員對(duì)食源性疾病報(bào)告制度意識(shí)不強(qiáng)，導(dǎo)致了只管用藥治療，無(wú)視了對(duì)病人嘔吐物和排泄物的留取，大量的抗菌素抑制了致病菌繁殖，從而影響了致病菌的檢出率。采樣缺乏完整性：一般中毒病人發(fā)病期的血液能采集到，但是采集恢復(fù)期的血液，由于病人的不配合或外出經(jīng)常采不全也影響了檢驗(yàn)結(jié)果的全面分析。 樣品的處理(1)固體食物如系大塊魚(yú)肉、組織臟器等，先用烙鐵燒灼外表，或在沸水中燙35秒鐘，然后再取內(nèi)部檢樣510克，按無(wú)菌要求，剪碎后置無(wú)菌乳缽內(nèi)，加人適量滅菌海沙研細(xì)，再加人無(wú)菌生理鹽水作1：5稀釋?zhuān)靹虺恋砗?，取上清液進(jìn)行接種和涂片染色鏡檢。(2)液體食

15、物可將液體食物直接接種培養(yǎng)基，或離心(每分鐘3000轉(zhuǎn)以上)半小時(shí)后，采取沉淀物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。(3)罐頭食品如罐頭尚未翻開(kāi)，先用溫水洗凈外表，并以95酒精燃燒消毒，然后用滅菌開(kāi)口刀將罐頭翻開(kāi)，以無(wú)菌操作將檢樣取出進(jìn)行細(xì)菌檢驗(yàn)。如罐頭為空盒，可用肉湯培養(yǎng)基沖洗盒內(nèi)壁，以洗液做細(xì)菌培養(yǎng)。樣品的處理(4)糞便和嘔吐物以無(wú)菌生理鹽水，充分?jǐn)嚢杌靹颉㈧o置，待其中粗塊下沉后，取上清液進(jìn)行接種及涂片染色鏡檢。(5)洗胃液用無(wú)菌試管低速離心后，取沉淀物進(jìn)行檢驗(yàn)。(6)血液檢樣用做細(xì)菌培養(yǎng)的抗凝血，以滅菌吸管吸取，注人肉湯或其他培養(yǎng)基內(nèi)增菌。用于測(cè)定患者血清效價(jià)的血樣，可用離心沉淀法或自然析出法將血清分出，與可

16、疑中毒菌株作試管凝集試驗(yàn)。(7)炊事用具擦洗水等可直接接種培養(yǎng)基。樣本標(biāo)簽內(nèi)容樣本編號(hào)唯一性樣本來(lái)源從什么物質(zhì)、材料中采集的，如病理采集的肝臟就可標(biāo) 注為某某患者肝臟；樣本數(shù)量包裝中樣本的數(shù)量，如此包裝中同時(shí)采集了2塊肝臟樣本 就要標(biāo)注為2 采樣時(shí)間：采樣地點(diǎn)：采樣人：樣本處理情況：抗凝劑 、運(yùn)送培養(yǎng)基、標(biāo)本狀況開(kāi)封食品樣本標(biāo)簽內(nèi)容 最小包裝每個(gè)標(biāo)本 每個(gè)包裝箱 每批樣本后要附上一個(gè)樣本清單，詳細(xì)列出此批樣本的名稱(chēng)、狀態(tài)和本卷須知。樣品的包裝 感染性樣本 放射性樣本 易腐性樣本 揮發(fā)性樣本樣品的運(yùn)送標(biāo)本應(yīng)由專(zhuān)業(yè)人員專(zhuān)人運(yùn)送，最好使用專(zhuān)車(chē)。郵寄樣品除患者檢測(cè)血漿外，其他樣本不宜通過(guò)郵寄方式轉(zhuǎn)運(yùn)。

17、檢測(cè)血漿用帶蓋的小塑料管盛裝，外襯緩沖包裝和吸附材料，通過(guò)EMS郵寄。在送郵件時(shí)要明確向郵局說(shuō)明郵寄物品的成分及平安性。在運(yùn)送過(guò)程中，要保證條件能夠持續(xù)保障。樣品的保存容器、介質(zhì)、溫度檢測(cè)目的 細(xì)菌 病毒 寄生蟲(chóng) 抗原抗體 核酸 化學(xué)毒物預(yù)期保存時(shí)間樣品的保存運(yùn)送平安性 樣品的平安 環(huán)境的平安不泄漏、不污染交接手續(xù)樣品送檢本卷須知 1采集的樣品一般應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)接種完畢，故必須及時(shí)送檢。2夏季送檢樣品時(shí)，應(yīng)注意冷藏。不得參加任何防腐劑。3應(yīng)附詳細(xì)送檢單，應(yīng)填明樣品名稱(chēng)、份數(shù)、重量、來(lái)源、中毒表現(xiàn)、送檢時(shí)間、有范圍的檢驗(yàn)工程、采樣條件容器是否滅菌、有無(wú)封條、送樣人。4樣品必須有牢固的標(biāo)簽，包裝嚴(yán)密

18、封閉。5注意無(wú)菌操作，防止污染，以免影響結(jié)果。6采樣過(guò)程中履行必要的采樣手術(shù)。發(fā)生中毒單位負(fù)責(zé)人簽封與開(kāi)具收據(jù)等 檢 驗(yàn)檢什么實(shí)驗(yàn)工程要結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查.臨床.血檢.電生理.影像學(xué)檢查等結(jié)果。確定實(shí)驗(yàn)工程應(yīng)同時(shí)考慮以下幾點(diǎn): 早期IgM和雙份IgG血清學(xué)檢驗(yàn)； 排泄物.分泌物.血液中的病原體的形態(tài)學(xué).血清學(xué)和核酸分型鑒定。 人體外環(huán)境病原鑒定結(jié)果與人體內(nèi)抗原、抗體的吻合、匹配； 毒力分析和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥糇C； 病原侵入與發(fā)病的時(shí)間順序； 主導(dǎo)病原與併發(fā)病原的甄別; 安排檢驗(yàn)工程要有幾套預(yù)備方案,實(shí)驗(yàn)的無(wú)果和失敗。檢什么病原別離 細(xì)菌需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌、L型菌 病毒 寄生蟲(chóng)血清學(xué)檢查：

19、 抗原 抗體 急性期IgM抗體 急性期和恢復(fù)期雙份靜脈血測(cè)定特異性IgG抗體。核酸檢測(cè) 特征基因、毒力基因、溯源比較定性/定量細(xì)菌性食物中毒的實(shí)驗(yàn)室診斷致病菌的定量檢驗(yàn)對(duì)細(xì)菌性食物中毒的調(diào)查 需要做定量檢驗(yàn)的細(xì)菌食物中毒與攝入量有關(guān)產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌 樣品：中毒相關(guān)食品、糞便、嘔吐物收集致病菌對(duì)人的最低感染劑量的資料危險(xiǎn)性分析中對(duì)暴露量的評(píng)估攝入的菌量與產(chǎn)生有害健康作用的概率和程度成正相關(guān)，但通常不是呈線(xiàn)性關(guān)系。攝入菌量的增加通常降低腸道疾病的潛伏期。怎么檢靈敏度、準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性、不同方法結(jié)果的可比較性用什么標(biāo)本用什么方法用什么試劑 對(duì)重大事件的毒物鑒定或樣本檢測(cè)要同時(shí)送數(shù)家

20、具有鑒定檢驗(yàn)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室同步開(kāi)展工作，防止因?qū)嶒?yàn)室管理和技術(shù)因素對(duì)結(jié)果的影響。檢測(cè)工程和方法確實(shí)定分析方法的選用要考慮待測(cè)樣品原形、代謝物、分析要求定性、定量、樣品類(lèi)型、實(shí)驗(yàn)室條件，分析目的等因素，還要考慮時(shí)效性、準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)性等要求。有時(shí)毒物有定性結(jié)果即可說(shuō)明問(wèn)題，而對(duì)于那些有環(huán)境或內(nèi)源性本底的毒物，或需用于現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)、應(yīng)急處理方法選擇或用于患者治療效果評(píng)價(jià)的要用定量分析。臨床治療藥物監(jiān)測(cè)必須進(jìn)行定量分析。 怎么檢快速靈敏方法的應(yīng)用儀器自動(dòng)化方法別離培養(yǎng)方法的改進(jìn)快速靈敏方法的應(yīng)用1.細(xì)菌培養(yǎng)的前、后處理方法的自動(dòng)化 培養(yǎng)法的前處理包括采樣、稱(chēng)量、分樣、勻漿、制作瓊脂培養(yǎng)基、樣品與培養(yǎng)基混釋等

21、。這些操作自動(dòng)化儀器有：自動(dòng)稱(chēng)量分注裝置、均化器、培養(yǎng)基制作裝置、菌液自動(dòng)涂抹裝置等。培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)的自動(dòng)化裝置有：筆型手動(dòng)式計(jì)數(shù)器、用圖像將平板內(nèi)菌落攝錄下來(lái)的自動(dòng)計(jì)數(shù)儀、彩色圖像菌種鑒定儀。快速靈敏方法的應(yīng)用各種簡(jiǎn)易培養(yǎng)基：簡(jiǎn)易培養(yǎng)基是食品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用較為普遍的一種快速簡(jiǎn)便的方法。培養(yǎng)基有印花型、平板型、濾膜型等多種類(lèi)型。例如，日本幾家公司生產(chǎn)的含有酶顯色底物的印花型培養(yǎng)基，由于有酶顯色底物，因而有快速易判斷等特點(diǎn)。液體樣品檢測(cè)用培養(yǎng)基有多種形式，有的在孔板上固定有無(wú)菌液體培養(yǎng)基，檢測(cè)時(shí)只要注入液體樣品即可判斷結(jié)果；顆粒狀培養(yǎng)基參加液體樣品培養(yǎng)即可判斷結(jié)果；而枯燥型培養(yǎng)基是將培養(yǎng)

22、基成分和膠體化物質(zhì)涂布在培養(yǎng)基墊上，它便于攜帶，操作簡(jiǎn)便。 快速靈敏方法的應(yīng)用快速靈敏方法的應(yīng)用檢測(cè)活菌數(shù)方法與器材 不需進(jìn)行培養(yǎng)即可直接檢測(cè)活菌數(shù)的方法有：觀(guān)察細(xì)菌引起電流阻抗值變化的阻抗測(cè)定法；以細(xì)胞內(nèi)ATP為指標(biāo)的生物發(fā)光法；用熒光劑標(biāo)記微生物細(xì)胞測(cè)定發(fā)光量的熒光染色法；用濾膜集菌，用ATP發(fā)光試劑標(biāo)記，然后進(jìn)行測(cè)定的濾膜光子檢測(cè)法等。這些方法是直接檢測(cè)活菌數(shù)，因而適于觀(guān)察細(xì)菌隨時(shí)問(wèn)發(fā)生的變化，可用于發(fā)酵食品的質(zhì)量管理、飲料生產(chǎn)工藝的監(jiān)測(cè)等?？焖凫`敏方法的應(yīng)用高選擇性顯色培養(yǎng)基食物中毒致病菌簡(jiǎn)易快速的檢測(cè)方法與器材沙門(mén)氏菌、O157大腸菌、李斯特菌等食物中毒致病菌如用培養(yǎng)法檢測(cè)，由于菌量

23、少，需進(jìn)行前培養(yǎng)和增菌培養(yǎng)，故費(fèi)時(shí)較多，且需熟練的檢測(cè)技術(shù)。因此，近年來(lái)國(guó)外對(duì)食物中毒致病菌簡(jiǎn)易快速的檢測(cè)方法與器材的研究十分重視，許多公司紛紛研制出省時(shí)、容易判斷結(jié)果的簡(jiǎn)易細(xì)菌檢測(cè)方法與器材。目前，已到達(dá)實(shí)用化程度的快速、簡(jiǎn)易的細(xì)菌檢測(cè)方法有：應(yīng)用抗原體反響原理的免疫凝集法、免疫沉降法、免疫熒光法、 EIA法，免疫色譜法、以及磁珠法等，DNA探針?lè)?，PCR法。分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)食源性病原微生物中的應(yīng)用DNA探針技術(shù) DNA探針技術(shù)是最新開(kāi)展起來(lái)的一項(xiàng)特異、靈敏、快速的檢測(cè)方法，但因有一定比例的假陽(yáng)性反響，故所有陽(yáng)性結(jié)果必須用標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法加以確證。聚合酶鏈反響(PCR)技術(shù) PCR技術(shù)原理

24、為提高DNA探針的敏感性，可先將靶 DNA序列擴(kuò)增，增加 DNA數(shù)量，使其到達(dá)足夠的檢測(cè)量，假設(shè)反響以動(dòng)力學(xué)為根底，那么能定量分析。在PCR反響中引人Taq聚合酶使反響得以半自動(dòng)化和簡(jiǎn)便反響程序。用擴(kuò)增DNA進(jìn)行的PCR反響具有無(wú)與倫比的優(yōu)越性。 快速檢出細(xì)菌的毒素 自臨床標(biāo)本中直接檢出細(xì)菌的毒素，常比細(xì)菌培養(yǎng)更可靠。如難辨梭菌在正常腸道中也可出現(xiàn)，故對(duì)抗生素相關(guān)性腸炎的診斷，檢出其毒素比細(xì)菌培養(yǎng)更有意義。已應(yīng)用此類(lèi)毒素的單抗以快速凝集或EIA法自糞便標(biāo)本中直接檢出毒素A或B進(jìn)行診斷。產(chǎn)毒素埃希氏菌ETEC感染的診斷主要依靠檢查細(xì)菌的LT熱敏毒素與ST耐熱毒素可應(yīng)用其單抗以多種免疫學(xué)手段檢出。

25、腸出血性大腸埃希氏菌EHEC的重要特征是產(chǎn)生Vero細(xì)胞毒素VT或稱(chēng)志賀樣毒素SLT。由于EHEC的血清型繁多，生化反響也可不典型，故檢查該菌的毒素極具診斷價(jià)值。快速檢出細(xì)菌的毒素 英國(guó)Unipaih公司已研制出VTEC的PRLA乳膠凝集試劑分別檢查VT-1與VT-2，試驗(yàn)時(shí)以多粘菌素裂解菌體，釋出VT，與乳膠試劑在U形板中溫育24小時(shí)，肉眼判定有無(wú)凝集。日本生研公司的VIEC -RPLA也為快速凝集試劑。Bentin等注意到90%的VTEC在洗過(guò)的羊血肉湯平板上經(jīng)37溫育過(guò)夜可表現(xiàn)出溶血；而非溶血菌落均無(wú)VT或SLT基因。這一發(fā)現(xiàn)為VTEC的檢測(cè)提供一迅速的篩查方法。 金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的多

26、種腸毒素也用單抗的協(xié)同凝集試驗(yàn)迅速檢出，是診斷該菌致成的事物中毒的可靠手段。應(yīng)用反向被動(dòng)乳膠凝集法Oxoid公司試劑快速檢測(cè)葡萄球菌的TSST1，可及時(shí)診斷出由葡萄球菌致成的中毒性休克綜合征?？焖俚募?xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性試驗(yàn) 新的檢測(cè)手段，如分子生物學(xué)手段檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因，自動(dòng)化的藥敏試驗(yàn)儀器，E test法等可提高準(zhǔn)確性與效率 。 快速紙片法Nitrocefin檢查內(nèi)酰胺酶，對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌，淋病奈瑟菌，流感嗜血桿菌，卡他莫拉菌有重要意義。 快速乳膠凝集試驗(yàn)日本生研公司可檢出變異的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a經(jīng)與mecA基因檢測(cè)比較，其敏感性98.5%，特異性達(dá)100%。 細(xì)菌性食物中毒樣品檢驗(yàn)

27、程序1 樣品采集 以無(wú)菌容器采集可疑樣品及病人的排泄物。2 別離培養(yǎng) 在病原菌不明確的情況下，多準(zhǔn)備一些各類(lèi)菌的選擇性培養(yǎng)基，如ss平板，伊紅美蘭平板作沙門(mén)菌、志賀菌；血平板、P-K瓊脂平板作金黃色葡萄球菌別離用；氯化鈉蔗糖瓊脂或TCBS瓊脂作副溶血性弧菌及溶藻性弧菌用；甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂作蠟樣芽孢桿菌別離用等等。接種：取適量可疑樣品放置無(wú)菌平皿中，參加與樣品等量的無(wú)菌生理鹽水，將樣品與生理鹽水充分混勻，用取菌環(huán)分別接種于各種平板培養(yǎng)基上，置37 培養(yǎng)20h左右，觀(guān)察各平皿菌落特征，進(jìn)一步鑒定。細(xì)菌性食物中毒樣品檢驗(yàn)程序 3. 取優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)鑒定 對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行涂片鏡檢，革蘭染色，以形

28、態(tài)特征、菌落特點(diǎn)做出意向性判斷進(jìn)行下步鑒定，接種克氏雙糖含鐵瓊脂培養(yǎng)，然后做血清凝集，生化實(shí)驗(yàn)，毒性實(shí)驗(yàn)等，報(bào)結(jié)果 4.活菌數(shù)的測(cè)定某些細(xì)菌在食品中須到達(dá)一定量時(shí)才可引起中毒病癥(如金黃色 葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等)。方法是取樣品的各個(gè)稀釋液包括1:100.1mL接種2只相應(yīng)的平板，用滅菌玻璃棒在每只平板外表涂布均勻。將平板置30培養(yǎng)24小時(shí)， 數(shù)出可疑菌落數(shù)，然后挑取典型菌落5個(gè)或更多的可疑菌落，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，計(jì)算出菌落數(shù)。細(xì)菌性食物中毒樣品檢驗(yàn)程序5.毒素測(cè)定 有些細(xì)菌性食物中毒并不是細(xì)菌本身所引起，而是由其所產(chǎn)生的毒素引起的，如金黃色葡萄球菌腸毒素、肉毒梭菌毒素，故須做其

29、毒素的測(cè)定。 動(dòng)物試驗(yàn)將可疑食物制備浸出液，或別離所得的上清液，皮下或腹腔注射動(dòng)物(小白鼠 )體內(nèi)，觀(guān)察數(shù)日，看有無(wú)中毒 。細(xì)菌性食物中毒樣品檢驗(yàn)程序6.血清凝集試驗(yàn) 將中毒患者急性期和恢復(fù)期的血清，與自中毒檢樣中別離的致病菌所制成的菌體抗原(將別離菌接種培養(yǎng)基，37培養(yǎng)24小時(shí)，待其生長(zhǎng)旺盛后，刮取菌苔至滅菌鹽水中，混散均勻，用生理鹽水稀釋成6億，毫升即成)做試管凝集試驗(yàn)，觀(guān)察凝集價(jià)有無(wú)上升趨勢(shì)，如恢復(fù)期的血清效價(jià)比發(fā)病初期有明顯增高增高4倍或以上即有診斷價(jià)值。經(jīng)驗(yàn) 1.對(duì)所有樣品進(jìn)行致病菌別離和鑒定時(shí)應(yīng)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法和已公認(rèn)的微生物檢驗(yàn)程序，應(yīng)用直接別離及增菌雙重培養(yǎng)，直接別離可檢出

30、樣品中的優(yōu)勢(shì)菌(包括一些條件致病菌)增菌可將樣品中污染的但又菌量較少的病原菌撿出，同時(shí)對(duì)服藥患者肛試樣品中被抗菌素抑制的細(xì)菌到達(dá)復(fù)蘇和增加菌量的作用。 2.由于多種病原菌引起的食物中毒，有相類(lèi)似的臨床病癥，因此對(duì)致病菌的檢測(cè)范圍應(yīng)擴(kuò)大，在別離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)多準(zhǔn)備一些各類(lèi)菌的選擇性培養(yǎng)基，采取多思路、多方法同時(shí)檢測(cè)各種致病菌的原那么，從而獲得滿(mǎn)意的檢驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)驗(yàn)金黃色葡萄球菌按GB47892021(以下簡(jiǎn)稱(chēng)GB)的方法有時(shí)不能檢出。有一次食物中毒檢驗(yàn)中我們同時(shí)用GB的方法和法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的血漿凝固酶平板的方法，結(jié)果GB的方法沒(méi)有檢出，而血漿凝固酶平板的方法卻檢出了金黃色葡萄球菌，看來(lái)多種檢驗(yàn)方法并

31、用能提高致病菌的檢出率。2 副溶血性弧菌食物中毒中最多見(jiàn)的一種致病菌。按GB方法樣品經(jīng)增菌后劃TCBS平板，經(jīng)1824 h培養(yǎng)后菌落有時(shí)為不典型的黃色或黃綠色，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后菌落才成典型的藍(lán)綠色，經(jīng)生化鑒定符合副溶血性弧菌。這是因?yàn)槿茉逍曰【蕛?yōu)勢(shì)菌時(shí)，會(huì)影響副溶血性弧菌的菌落顏色。所以經(jīng)24 h培養(yǎng)，菌落不典型時(shí)不要輕易放棄，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再作鑒定。我們?cè)谂囵B(yǎng)副溶血性弧菌時(shí)已屢次出現(xiàn)這種情況。經(jīng)驗(yàn)3 沙門(mén)菌也是較常見(jiàn)的一種致病菌。 經(jīng)驗(yàn) 對(duì)于細(xì)菌性食物中毒標(biāo)本的檢測(cè)流程，由于國(guó)家沒(méi)有系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)，一般都根據(jù)病人臨床病癥、流行病學(xué)特征等具體情況，而選擇檢測(cè)工程，實(shí)際上由于多種細(xì)菌混合污染

32、、病人個(gè)體差異、病原菌株的不同等原因，缺乏典型病癥，很容易造成漏檢，導(dǎo)致食物中毒原因不明。該流程由于多種培養(yǎng)基同時(shí)應(yīng)用，防止了上述缺乏，提高了檢出率。由于在直接別離平板的同時(shí)進(jìn)行了選擇性增菌培養(yǎng)，對(duì)用藥后采集的樣本和細(xì)菌數(shù)量較少的樣本中的病原菌起到了復(fù)蘇、增菌的作用，有效地降低了漏檢率。 經(jīng)驗(yàn)用該流程檢測(cè)食物中毒標(biāo)本，由于采用優(yōu)勢(shì)菌(可疑菌落)直接鑒定法，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，加快了檢測(cè)速度。在多數(shù)情況下有效的縮短了檢測(cè)時(shí)間，為病人的臨床治療及疫情的控制提供了可靠的依據(jù)，減少了經(jīng)濟(jì)損失。優(yōu)勢(shì)茵的選擇經(jīng)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)菌的選擇應(yīng)注重觀(guān)察各樣本在相同選擇性平板上普遍生長(zhǎng)的相似菌落。食物中毒標(biāo)本采集的質(zhì)量直接影響到

33、檢出率。未能檢出病原優(yōu)勢(shì)菌的選擇的原因很可能是現(xiàn)場(chǎng)被破壞、無(wú)剩余食物、病人用藥治療、未能采集到理想樣本等因素有關(guān)。 培養(yǎng)基的選擇可根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)室具體情況確定，在上述選定的培養(yǎng)基不能滿(mǎn)足少數(shù)致食物中毒的病原菌檢測(cè)時(shí)，可根據(jù)具體情況選擇相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行別離鑒定。 優(yōu)勢(shì)菌(可疑菌落)的鑒定主要參照?中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一微生物學(xué)局部?、?衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)?、?出口食品中嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法? 細(xì)菌性食物中毒樣品處理一些新觀(guān)點(diǎn) 1.病原菌量的概述在很多資料談到這個(gè)問(wèn)題，引起食物中毒病原菌一定要在食品中大量繁殖后才能造成中毒，如金黃色葡萄球菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌等，食品中含量要在106- 108個(gè)g以上

34、，才到達(dá)中毒量。 2.可疑食品檢驗(yàn)有無(wú)增菌的必要性 一般中毒樣品可能受到某病原菌的污染，其菌量少，不一定造成食物中毒的概念，如作增菌實(shí)驗(yàn)，這少量的病原菌可能檢出，而食品中的大量條件致病菌被無(wú)視，病因可能就是這些條件致病菌，造成病癥與檢驗(yàn)結(jié)果不符，就是說(shuō)無(wú)增菌的必要。 根據(jù)以上兩個(gè)論點(diǎn)，細(xì)菌性食物中毒病原菌，應(yīng)在食品中大量繁殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群，不需要增菌，直接別離培養(yǎng)即可獲得樣品中的優(yōu)勢(shì)菌株。結(jié)果的報(bào)告、解釋、分析結(jié)果的報(bào)告、解釋、分析實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果是確定病因的重要依據(jù)，但實(shí)驗(yàn)室結(jié)果要和現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查情況、患者的臨床表現(xiàn)一起分析，才能確定病因。檢驗(yàn)結(jié)果的正確性不僅取決于實(shí)驗(yàn)室的條件和技術(shù)水平，同時(shí)還與檢

35、驗(yàn)樣品的采集、保存、送樣方法等方面有關(guān)。因此在分析檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，除了應(yīng)考慮結(jié)果是否符合有關(guān)實(shí)驗(yàn)室判定標(biāo)準(zhǔn)外，還應(yīng)綜合考慮各種困難影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素。陽(yáng)性結(jié)果不一定能說(shuō)明病原因子在爆發(fā)事件中的致病作用；反之陰性結(jié)果也不一定能完全否認(rèn)某種病原因子的病因假設(shè)結(jié)果的報(bào)告、解釋、分析無(wú)菌部位病原別離陽(yáng)性食品、環(huán)境標(biāo)本檢出變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)菌性食物中毒的實(shí)驗(yàn)室診斷 要點(diǎn)：從相關(guān)食品及發(fā)病者中別離到相同的致病菌從同批發(fā)病者中別離到相同的致病菌從食品中別離到致病菌的致病特點(diǎn)與發(fā)病者的臨床病癥相符檢出限值和檢驗(yàn)結(jié)果的表達(dá)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)已經(jīng)建立的檢測(cè)方法都要進(jìn)行準(zhǔn)確性和靈敏性評(píng)價(jià)，還要爭(zhēng)取開(kāi)展與其它檢測(cè)方法之間

36、進(jìn)行比較的工作。每批樣本都要對(duì)方法進(jìn)行檢出限值最低檢出濃度測(cè)算，并將最低檢出限值在發(fā)出的檢測(cè)報(bào)告中注明。對(duì)定量檢測(cè)，如樣本中毒物濃度超過(guò)檢出限值，應(yīng)標(biāo)注出實(shí)際測(cè)出的數(shù)值；如在樣本中檢測(cè)出所檢測(cè)的毒物，但毒物的量或濃度低于檢出限值，應(yīng)在檢測(cè)報(bào)告中報(bào)告“檢出；對(duì)在樣本中未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)毒物，應(yīng)該檢測(cè)報(bào)告上注明“未檢出。對(duì)定性檢測(cè)，樣本中檢出目標(biāo)毒物時(shí)在檢驗(yàn)報(bào)告上注明“陽(yáng)性；對(duì)未檢出目標(biāo)毒物者在檢驗(yàn)報(bào)告上注明“陰性。結(jié)合流調(diào)資料分析檢測(cè)結(jié)果 一致（合理）不一致（合理）檢測(cè)陽(yáng)性假設(shè)成立是否混雜？流調(diào)資料可信度？檢測(cè)陰性假設(shè)成立是否假陰性？流調(diào)資料可信度？沖突結(jié)果的處理每個(gè)重大中毒事件病因確定或中毒患者診斷的過(guò)程中都會(huì)有一次或?qū)掖味疚镨b定檢測(cè)，各次檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該有一致性，這些結(jié)果共同指向某一種或多種毒物。沖突的原因分析a. 檢測(cè)方法、所用的儀器不同，其靈敏度、精