動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)(上課用)1

1、動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、 動(dòng)物細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞融合、 單克隆抗體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。提問(wèn)：植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？植物組織培養(yǎng), 植物體細(xì)胞雜交第一頁(yè)，共二十七頁(yè)。 從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個(gè)細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)1 、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念第二頁(yè)，共二十七頁(yè)。動(dòng)物組織塊細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞（幼齡動(dòng)物的器官、組織或胚胎）加入培養(yǎng)液用胰蛋白酶等處理貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞從瓶壁脫落適宜條件2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程第三頁(yè)，共二十七頁(yè)。細(xì)胞懸浮液細(xì)胞貼滿

2、瓶壁50代細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng): 將動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶等處理后的初次培養(yǎng)。傳代培養(yǎng): 對(duì)貼滿瓶壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，然后再分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。第四頁(yè)，共二十七頁(yè)。動(dòng)物組織單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞懸液貼壁生長(zhǎng)分瓶培養(yǎng)10代細(xì)胞50代細(xì)胞不死細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶或膠原蛋白酶剪碎加培養(yǎng)液接觸抑制少數(shù)癌變少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)流程失去接觸抑制現(xiàn)象細(xì)胞核型不變第五頁(yè)，共二十七頁(yè)。 當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制。哪些細(xì)胞失去了接觸抑制？ 傳代培養(yǎng)時(shí)，少數(shù)超過(guò)50代的細(xì)胞，由于遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，可無(wú)限增殖，并失去了接觸抑制腫瘤細(xì)胞。接觸抑制第六頁(yè)，共二十七頁(yè)。動(dòng)物胚胎或

3、幼齡動(dòng)物的組織、器官細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶10代細(xì)胞50代細(xì)胞細(xì)胞株無(wú)限傳代（不死性）細(xì)胞系遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)未改變第七頁(yè)，共二十七頁(yè)。 多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識(shí)，思考以下問(wèn)題： 1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì)？ 2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？ P46討 論充足營(yíng)養(yǎng)（糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等合成成分及血清、血漿等天然成分。）適宜溫度、PH和氣體環(huán)境；無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境第八頁(yè)，共二十七頁(yè)。4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件：1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營(yíng)養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、動(dòng)物血清等。）3、溫度

4、和PH 36.5+（-）0.54、氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）保證細(xì)胞順利的生長(zhǎng)增殖維持培養(yǎng)液的PH第九頁(yè)，共二十七頁(yè)。5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）作為基因工程中的受體細(xì)胞培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可以用于檢測(cè)有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)第十頁(yè)，共二十七頁(yè)。思考：2、為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？主要

5、成分：葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有動(dòng)物血清等因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)。細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體或組織培養(yǎng)結(jié)果獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白快速繁殖、培育無(wú)病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動(dòng)物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目試一試第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)。第二課時(shí)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)。二.動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)

6、和克隆動(dòng)物 將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成為一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體（克隆動(dòng)物）。 分類(lèi)胚胎細(xì)胞核移植：體細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易；細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性不容易1.動(dòng)物細(xì)胞核移植概念：（難度高）第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)。卵母細(xì)胞母綿羊母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過(guò)程融合后的卵母細(xì)胞第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)。2、體細(xì)胞核移植的過(guò)程：請(qǐng)看教材P48圖2-21思考：1.核移植的受體細(xì)胞是什么？處在什么時(shí)期？用此細(xì)胞作為受體細(xì)胞有什么好處？2.通過(guò)什么手段激活受

7、體細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎？ M中期卵母細(xì)胞誘導(dǎo)方法：物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。卵母細(xì)胞體積大，便于操作；含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，提供早期胚胎發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)；含有激活細(xì)胞核體現(xiàn)全能性的物質(zhì)。第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)。電激處理使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞構(gòu)建重組胚胎卵母細(xì)胞采集、培養(yǎng)M中期卵母細(xì)胞供體牛供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞代孕母牛克隆牛體細(xì)胞培養(yǎng)去核卵母細(xì)胞去核胚胎移植2.體細(xì)胞核移植過(guò)程（體細(xì)胞克隆動(dòng)物）原理：動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性顯微操作第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)。3.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景：1.加速家畜遺傳改良的進(jìn)程2.保護(hù)瀕危物種3. 生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植4.了解胚胎發(fā)育

8、和衰老過(guò)程；追蹤研究疾病的發(fā)展過(guò)程和治療疾病第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)。4、體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題 P173（1）成功率非常低（2）克隆動(dòng)物以表現(xiàn)早衰、生理缺陷等健康問(wèn)題 成功率低，絕大多數(shù)克隆動(dòng)物存在健康問(wèn)題并表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷：如體型過(guò)大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)。討論：（教材P49）1.在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？ 為使核移植的胚胎或動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有重要利用價(jià)值的動(dòng)物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐?。第二十?yè)，共二十七頁(yè)。 培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般

9、當(dāng)傳代至1050代左右時(shí)，部分細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生突變，而10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞。2.用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞，想一想，這是為什么？第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)。3.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物，是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？克隆動(dòng)物絕大部分DNA來(lái)自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來(lái)自于受體卵母細(xì)胞。此外，即便動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動(dòng)物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)

10、系，核供體動(dòng)物生活的環(huán)境與克隆動(dòng)物所生活的環(huán)境不會(huì)完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動(dòng)物完全相同，從這一角度看，克隆動(dòng)物不會(huì)是核供體動(dòng)物100%的復(fù)制。第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)。1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí)，一般是取胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官，請(qǐng)解釋原因。細(xì)胞的衰老與動(dòng)物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動(dòng)物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動(dòng)物則相反。所以，一般來(lái)說(shuō)幼年動(dòng)物的組織細(xì)胞比老年動(dòng)物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。腫瘤組織或細(xì)胞 正常組織或細(xì)胞 拓展-動(dòng)物組織或細(xì)胞培養(yǎng)的難易程度幼體組織或細(xì)胞 老齡

11、組織或細(xì)胞分化程度低的組織或細(xì)胞 分化程度高的組織或細(xì)胞思考與探究（教材P50）第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)。思考與探究（教材P50）2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)脫分化的過(guò)程嗎？為什么？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過(guò)脫分化過(guò)程。因高度分化的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，所以，動(dòng)物細(xì)胞也就沒(méi)有類(lèi)似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的脫分化過(guò)程了。要想使培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動(dòng)物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)。3.1997年，美國(guó)威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國(guó)高產(chǎn)奶

12、牛場(chǎng)奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國(guó)奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為34 t。 （1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請(qǐng)說(shuō)明理由?？梢?。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來(lái)自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。該克隆牛不能無(wú)限制地推廣，其數(shù)量不宜過(guò)多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無(wú)限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。第二十五頁(yè)，共二十七頁(yè)。（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對(duì)它進(jìn)行克??？從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場(chǎng)取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時(shí)供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過(guò)程。核移