血紅蛋白的提取和分離

2003年4月14日宣布(xuānbù)人類基因組序列圖完成這標(biāo)志著進入了后基因組時代。人類基因組：指DNA分子(fēnzǐ)所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個體(gètǐ)表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究第一頁，共三十九頁。第二頁，共三十九頁。蛋白質(zhì)別離(fēnlí)的原理：根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)(xìngzhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)(xìngzhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來別離不同種類的蛋白質(zhì)。一、根底知識第三頁，共三十九頁?！惨弧衬z色譜法2.凝膠：大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物〔如葡聚糖或瓊脂糖〕構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多(xǔduō)貫穿的通道。根據(jù)被別離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小(dàxiǎo)，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進行別離。1.概念(gàiniàn)：〔分配色譜法〕第四頁，共三十九頁。3.凝膠色譜法別離蛋白質(zhì)的具體(jùtǐ)過程第五頁，共三十九頁。第六頁，共三十九頁。4.凝膠色譜法的原理(yuánlǐ)①相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動(yídòng)速度較慢;②相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以別離。進行體外實驗時，如何保證蛋白質(zhì)不會發(fā)生(fāshēng)變性呢？第七頁，共三十九頁。〔二〕緩沖溶液(huǎnchōnɡrónɡyè)能夠抵抗外界的酸和堿對溶液(róngyè)PH值的影響，維持PH根本不變。1.作用(zuòyòng):2.緩沖溶液的配制:

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。3.在本課題中使用的緩沖液是:磷酸緩沖液,成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？第八頁，共三十九頁?！踩畴娪?diànyǒnɡ)：1.概念(gàiniàn)：帶電粒子在電場(diànchǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待別離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的別離。第九頁，共三十九頁。3.類型(lèixíng):瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。第十頁，共三十九頁。

聚丙烯酰胺凝膠電泳在測定(cèdìng)蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉〔SDS〕—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺〔形成(xíngchéng)交聯(lián)〕丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反響第十一頁，共三十九頁。

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少(duōshǎo)以及分子的大小等因素。

1.原理(yuánlǐ)：SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條(dāntiáo)肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。2.SDS作用機理:第十二頁，共三十九頁。用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定(cèdìng)蛋白質(zhì)分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進行電泳(diànyǒnɡ)，根據(jù)分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。第十三頁，共三十九頁。第十四頁，共三十九頁。

二、實驗(shíyàn)操作樣品處理→粗別離→純化→純度(chúndù)鑒定蛋白質(zhì)提取和別離(fēnlí)步驟血液血漿水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團血液有哪些成分？〔一〕血紅蛋白第十五頁，共三十九頁。血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵血紅素基團每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子(fēnzǐ)氧或一分子(fēnzǐ)二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白(xuèhóngdànbái)的特點：第十六頁，共三十九頁。

用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白(xuèhóngdànbái)的原因是什么？

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進行DNA的提?。蝗说募t細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單(jiǎndān)，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。第十七頁，共三十九頁。(1)紅細(xì)胞的洗滌(xǐdí):①洗滌(xǐdí)目的:去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的別離(fēnlí)純化，洗滌次數(shù)不可過少。②洗滌操作：1、采集血樣。2、低速短時間離心〔速度越高和時間越長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到別離的效果〕3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心〔低速短時間〕6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，說明洗滌干凈。1.樣品處理及粗別離〔二〕操作過程第十八頁，共三十九頁。(2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積(tǐjī)，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘〔加速細(xì)胞破裂〕,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)別離血紅蛋白(xuèhóngdànbái)溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次(céngcì)：第1層〔最上層〕：甲苯層〔無色透明〕；第2層〔中上層〕：脂溶性物質(zhì)沉淀層〔白色〕；第3層〔中下層〕：血紅蛋白的水溶液層〔紅色)；第4層〔最下層〕：雜質(zhì)沉淀層〔暗紅色〕。③別離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第十九頁，共三十九頁。(4)透析：①過程(guòchéng)：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中〔pH為7.0〕，透析12小時。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。第二十頁，共三十九頁。2.凝膠色譜(sèpǔ)操作:〔1〕凝膠色譜(sèpǔ)柱的制作：①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得(bude)超出橡皮塞的凹穴底面，否那么難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)別離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第二十一頁，共三十九頁?！?〕凝膠色譜(sèpǔ)柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠〔G-75〕。B、代表意義：“G〞表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及別離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理(chǔlǐ)：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。

第二十二頁，共三十九頁。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為(yīnwèi)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低別離效果?！?〕凝膠色譜(sèpǔ)柱的裝填第二十三頁，共三十九頁。

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作(cāozuò)壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液〔pH為7.0〕充分洗滌平衡12小時。注意：1、液面不要低于凝膠外表，否那么可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的別離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。50cm高〔2〕凝膠色譜(sèpǔ)柱的裝填第二十四頁，共三十九頁?！?〕樣品(yàngpǐn)參加與洗脫①調(diào)節(jié)(tiáojié)緩沖液面：翻開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

第二十五頁，共三十九頁。注意：正確的加樣操作(cāozuò)是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第二十六頁，共三十九頁。③樣品滲入凝膠床：加樣后翻開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全(wánquán)進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口④洗脫：小心參加pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，翻開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。〔在別離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功〕第二十七頁，共三十九頁。思考(sīkǎo)下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定(wěndìng)的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。1、在血紅蛋白純化的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理(chǔlǐ)的目的是什么？2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點？這一特點對你進行血紅蛋白的別離有什么啟示？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜別離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的別離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。第二十八頁，共三十九頁?！踩砈DS—聚丙烯酰胺凝膠電泳〔選做〕鑒定血紅蛋白(xuèhóngdànbái)純度。1.目的(mùdì)：第二十九頁，共三十九頁。1.樣品的處理——通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液(róngyè)2.樣品的粗別離——經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)3.樣品的純化——通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去4.經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。小結(jié)：你能描述血紅蛋白別離的完整(wánzhěng)過程嗎？第三十頁，共三十九頁。觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同(yītóng)沉淀，也得不到純潔的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、結(jié)果分析(fēnxī)與評價

1、你是否(shìfǒu)完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？第三十一頁，共三十九頁。2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何(rúhé)判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以參加(jiārù)大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。第三十二頁，共三十九頁。如果凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明別離的效果(xiàoguǒ)不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的別離(fēnlí)過程中紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷別離(fēnlí)效果？第三十三頁，共三十九頁。作業(yè)(zuòyè)完成?血紅蛋白的提取(tíqǔ)和別離?學(xué)案穩(wěn)固1、穩(wěn)固2、例1；隨堂達(dá)標(biāo)檢測1、3；活頁1、3、5、75月15日第三十四頁，共三十九頁。作業(yè)(zuòyè)完成(wánchéng)?血紅蛋白的提取和別離?學(xué)案全部5月16日第三十五頁，共三十九頁。 教學(xué)(jiāoxué)反響1．凝膠色譜法是根據(jù)〔〕別離蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小B相對分子質(zhì)量的大小C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵抗外界的影響來維持〔〕根本不變。A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷〔〕的電極(diànjí)移動。A相同B相反C相對D相向4.哺乳動物和人的成熟的紅細(xì)胞中的〔〕與氧氣的運輸有關(guān)。A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動蛋白D肌球蛋白BBBA第三十六頁，共三十九頁。5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中〔〕的含量最多。A白細(xì)胞B血小板C紅