土壤水解酶測定方法

土壤酶測定方法——熒光微型板酶檢測技術（microplatefluorimetricassay）（一）所測酶類：（纖維素、淀粉、半纖維素：①α-Glucosidase a-葡萄苷酶②β-Glucosidase b-葡萄苷酶（E.C.1）③β-Cellobiosidase β-纖維二糖苷酶④β-Xylosidase β-木糖苷酶（E.C.7）⑤-cty-gucosmdse （幾丁質酶（..3.2..52）有機氮分解酶類（蛋白質、尿素：⑥Aminopeptidases leucine-aminopeptidase（蛋白酶之一）（E.C.3.4.11.X）⑦尿酶有機磷分解酶類：⑧Phosphatase 磷酸酶（E.C.and）有機硫分解酶類：⑨Sulfatase E.C.氧化還原酶類：⑩Peroxidase （加雙氧水）?phenol oxidase 酚氧化酶（二）500ml個移液器3.排槍（10-100ul,30-300υL）磁力攪拌器96孔微型板（黒、白板）ｖ型槽7.酶標儀標準底物：4-methylumbelliferone(MUB)7-amino-4-methylcoumarin(AMC)熒光底物:4-MUB-phosphate4-MUB-sulfatepotassiumsalt4-MUB-β-D-glucoside4-MUB-β-D-cellobioside4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide4-MUB-β-D-xyloside-D-glucosideL-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin非熒光底物：L-dopa（三）試劑準備2L8.003g無水醋酸鈉溶液加水1L，用醋酸調pH到土壤pH，再定容到2L。2mM（10×）mg14-MUB-phosphate2.56水24-MUB-sulfatepotassiumsalt2.9434-MUB-β-D-glucoside3.38水44-MUB-β-D-cellobioside5.00水54-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide3.791mlDMF二甲基甲酰胺+水64-MUB-β-D-xyloside3.08水74-MUB-α-D-glucoside3.381ml吡啶+水8L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin3.251ml乙醇+水水使用時取1.6mL稀釋10倍形成200uM底物溶液16mL。（備注：除水以外的溶解劑在最后體系中濃度不超過3%）5mLmg4-methylumbelliferone(MUB)1.761ml乙醇+水7-amino-4-methylcoumarin(AMC)1.751ml丙酮+水使用時，各取80uL稀釋到16mL３.5mL濃度為250mM的L-DOPA溶液（10×）0.24649gL-DOPA溶入5ｍＬ水。使用時3ml稀釋10陪形成25mM的Ｌ－ＤＯＰＡ溶液３０ｍＬ。４.6mL0.3%雙氧水（現(xiàn)配）60uL30%的雙氧水+5940uL的水。５.濃度為4M(10×)尿素底物5mL1.2012g尿素溶入5mL水使用時取1.2mL稀釋10陪形成200ｍＭ的尿素溶液１２ｍＬ步驟１.板編號。２.緩沖液準備好。３.先將緩沖液加入微型版中。４.6個燒杯一組，1g鮮土加100mL緩沖液。５.按順序加入待測液。６.標準溶液配好，加入標準溶液。７.底物溶液配好，迅速加入底物溶液。８.黑板在25度培養(yǎng)4h后上機測定，excitationwavelength:365,emissionwavelength:460９.氧化還原酶白板在25度培養(yǎng)20個小時，上機測定，absorbancewavelength:450（三）上機操作儀器：ThermoioskanFlash１.提前開機預熱30min２.程序—ok—newsession—sessionname:_--next—next—finish—wizard—no.ofunknows:,設定總孔數(shù)—addandclose—protocol wavelength:365,emissionwavelength:460—save—connect—run—ok３.數(shù)據(jù)保存，dataprocessing—report/export—全選—add—fluorometricl—format—list—全選—ok—report—save.4-MUB-phosphate

4-MUB-sulfate

4-MUB-β-D-glucoside

4-MUB-β-D-cellobioside第一排1 2 3 4 5 6 7 8

9 10

11 12

4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide

4-MUB-β-D-xyloside

4-MUB-α-D-glucoside

第二排13第三 待加排25第四 待加排31第五 緩加緩加排 緩加緩 34

14 15MUB26 2732 33

16 17 18AMC28 29 30

19 20

21 22

23 24第一步 200ul緩 緩加（34號板1-8列緩加標號板9-10列緩加（37號板11列）第二步 50ul緩 緩加緩（37號板第11列），待加緩（第四行全部）第三步 200ul待36個樣 待加底，待加標，待加緩（一二三四行，每三塊板36個樣）第四步 50ul標 緩加標（MUB，AMC，34號板9-10列），待加標（MUB,AMC第三行全部）第五步 50ul底 8個底物

緩加底（34號板1-8列），待加底（第一，二行每種酶三塊板）L-DOPA

L-DOPA+0.雙氧K 尿奔待加底

1 2 3

基 5

。

恃加底

p1逞

15 _. 1G 待加緩7線爰戎］陌爰綸爰戌］日廳臣

8: 9

:10

,, 11

12.

特 加標12

1了J> 18

1||13||持加峽

0. 21

2'2但一步 I

2oou:1緩 廠| 緩加緩 (13號

第1列），緩加底(13號板第2, 3列）

2.3第一步 200ul緩f|緩加底

24 25(13號板第·4—列-）I第二步 50ul綏 綏加綏(13號板第1列），待加線（第二行全部）笫三步 200ul待 待加底，特 加級（每種醇加兩列）

第二步 50ul綏 待加綏（第四行全部）笫三步 200ul待 待加底，待加標1．待加標2·待加緩（尿酶加4列）第四步第五步

50ul底10ulb.3%H202

待加底（第一行全部）16-21號板全部13號板第3列t

第四步第五步18

Iu1l21待3（4部標2備注 綏：50詛的醋酸鈉緩沖液

|待加底：assay

第六步 sal.y勹二 尿親全部，13號板第哼le4.0u1_|待：lg土l.水土垣懸濁液

1待力日綏：soilcon-t:rol

怎 底25L

1綏加底：

negat1ve control

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134lt-： blankt-

備注三|t