高效液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)版

關(guān)于高效液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)版第1頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、簡(jiǎn)介

色譜學(xué)是現(xiàn)代分離分析的一個(gè)重要領(lǐng)域，也是一門新興學(xué)科，在化學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的地位。近幾十年來(lái)，色譜學(xué)各分支，如氣相色譜、液相色譜、薄層色譜等研究方法都得到了深入的研究，20世紀(jì)50年代創(chuàng)立了氣相色譜法，它的出現(xiàn)把色譜法從分離技術(shù)提高到分離與“在線”分析的新水平，為色譜法成為現(xiàn)代分離-分析方法奠定了基礎(chǔ)，1957年誕生了毛細(xì)管色譜法。20世紀(jì)60年代推出了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

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（LC-MS），有效的彌補(bǔ)了色譜法定性分析特征性差的弱點(diǎn)，成為最重要的分離分析方法之一，LC-MS在選擇性、靈敏度、分子量測(cè)定和提供結(jié)構(gòu)信息方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能夠同時(shí)獲得可靠的定性定量結(jié)果，因而被廣泛應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制（雜質(zhì)、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等的鑒定和測(cè)定）、藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布和代謝研究（包括代謝物的結(jié)構(gòu)確定及定量）和臨床醫(yī)學(xué)研究（如蛋白異常的研究）。LC-MS已成為新藥研究必不可少的手段。20世紀(jì)70年代，高效液相色譜法崛起克服了第3頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

氣相色譜法不能直接用于分析難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子化合物等的弱點(diǎn)，大大擴(kuò)大了色譜法的應(yīng)用范圍，把色譜法推進(jìn)到一個(gè)新水平。高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是一種高效、快速的分離分析技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)。HPLC具有的同時(shí)分離和分析的功能對(duì)于體內(nèi)藥物分析和體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的分析及成分復(fù)雜的中藥分析尤其重要。HPLC的分離功能還廣泛用于藥物的純化和制備，如用制備色譜分離第4頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

天然藥物的有效成分，或制備手性藥物的單一對(duì)應(yīng)體。由于使用各種高靈敏度的檢測(cè)器，如熒光、電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器，再結(jié)合許多衍生化技術(shù)及樣品富集技術(shù)，HPLC對(duì)許多藥物的最低檢測(cè)限都達(dá)到了pg級(jí)或更低水平，非常適合于一些微量成分甚至痕量成分的分析。由于色譜條件的可控制性及進(jìn)樣技術(shù)和在線樣品處理技術(shù)的發(fā)展，HPLC分析的精密度完全能夠滿足醫(yī)藥分析實(shí)驗(yàn)室的要求。HPLC一般在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成一個(gè)樣品分析，而且往往能夠?qū)崿F(xiàn)多組分的同時(shí)測(cè)第5頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

定，這一快速分析的特點(diǎn)使HPLC廣泛應(yīng)用于藥物合成的各部反應(yīng)的監(jiān)控和臨床治療藥物的監(jiān)測(cè)。HPLC的柱切換技術(shù)是通過(guò)程序控制的切換閥改變流動(dòng)相的流向和（或）流動(dòng)相系統(tǒng)的技術(shù)。這一技術(shù)在醫(yī)藥分析中的應(yīng)用越來(lái)越多，尤其在藥物分析中的應(yīng)用最為廣泛。利用柱切換技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)樣品的在線凈化與富集、在線衍生化、在多個(gè)色譜柱上進(jìn)行分離。在復(fù)雜樣品的分析方面有著巨大的潛力。目前，高效液相色譜已成為化學(xué)、生化、醫(yī)學(xué)、工、第6頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家和生物化學(xué)家手中用以解決他們面臨的各種實(shí)際分析和分離課題必不可少的工具之一。液相色譜根據(jù)固定相性質(zhì)可分為離子交換色譜、吸附色譜、鍵合相色譜和大小排阻色譜。

離子交換色譜法是流動(dòng)相中的被分離離子，與作為固定相的離子交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)，它們對(duì)交換劑的基體離子親和力的不同而達(dá)到分離的。第7頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六組分離子對(duì)交換劑基體離子親和力越大，保留時(shí)間就越長(zhǎng)。

吸附色譜法是當(dāng)組分分子流經(jīng)固定相（吸附劑，如硅膠或氧化鋁）時(shí)，不同組分分子、流動(dòng)相分子就要對(duì)吸附劑表面的活性中心展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)。這種競(jìng)爭(zhēng)能力的大小，決定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。

鍵合相色譜法是將類似于氣相色譜中的固定液的液體，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠表面，從而形成固定相。第8頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜。若采用極性鍵合相、非極性流動(dòng)相，則稱為正相色譜；采用非極性鍵合相、極性流動(dòng)相，則稱為反相色譜。這種分離的保留值大小，主要決定于組分分子與鍵合固定液分子間作用力的大小。

大小排阻色譜法的固定相是一類孔徑大小有一定范圍的多孔材料。被分離的分子大小不同，它們擴(kuò)散滲入多孔材料的容易程度不同。小分子最易擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)孔中，保留時(shí)間最長(zhǎng)；大分子完全排斥在孔外，隨流動(dòng)

第9頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六相很快流出，保留時(shí)間最短。在以上四種分離方式中，反相鍵合相色譜應(yīng)用最廣，因?yàn)樗捎么肌螂妗w系作流動(dòng)相。純水易得廉價(jià)，它的紫外吸收極小。在純水中添加各種物質(zhì)可改變流動(dòng)相選擇性。使用最廣的反相鍵合相是十八烷基鍵合相，即讓十八烷基（C18H37—）鍵合到硅膠表面。這種鍵合相又稱ODS（Octadecylsilyl）鍵合相，如國(guó)外的partisil5-ODS、Zorbax-ODS、Shim-packCLC-ODS，國(guó)產(chǎn)的YWG-C18等。第10頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

二、基本概念和術(shù)語(yǔ)一、色譜圖和峰參數(shù)

1、色譜圖(chromatogram)--樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)。

2、基線(baseline)--經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。基線反映儀器及操作條件的恒定程度，主要由流動(dòng)相中的雜質(zhì)等因素決定。第11頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

3、噪音(noise)--基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

4、漂移(drift)--基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。

5、色譜峰(peak)--組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形第12頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見(jiàn)。

6、拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子(symmetryfactor)或不對(duì)稱因子(asymmetryfactor)?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。

7、峰底-基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。第13頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

8、峰高(peakheight，h)-峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。

9、峰寬（peakwidth，W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W＝4σ10、半峰寬（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ11、標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，σ)-正態(tài)分布曲線x＝±1時(shí)（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱第14頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

過(guò)程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

12、峰面積(peakarea，A)-峰與峰底所包圍的面積。第15頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、定性參數(shù)（保留值）1、死時(shí)間(deadtime，t0)--不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過(guò)色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來(lái)測(cè)定死時(shí)間。2、死體積(deadvolume，V0)--由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作第16頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）3、保留時(shí)間(retentiontime，tR)--從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。4、保留體積(retentionvolume，VR)--從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR5、調(diào)整保留時(shí)間(adjustedretentiontime，t'R)--扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱折合保留時(shí)間(reduced第17頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

retentiontime)。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t06、調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume，V‘R)--扣除死體積后的保留體積。三、柱效參數(shù)1、理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)--用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種類和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。第18頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。1.1用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。1.2N與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱長(zhǎng)為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）1.3若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。第19頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

2、理論塔板高度(theoreticalplateheight，H)--每單位柱長(zhǎng)的方差。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長(zhǎng)L和理論塔板數(shù)計(jì)算。四相平衡參數(shù)1、分配系數(shù)(distributioncoefficient，K)--在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相（Cs）與流動(dòng)相（Cm）中的濃度之比。K=Cs/Cm

分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，第20頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來(lái)表示。在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。

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在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。2、容量因子(capacityfactor，k)--化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。

容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（t‘R）是不保留組分保留時(shí)間（t0)的幾倍。第22頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六k＝0時(shí)，化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定相中不保留，t’R＝0；k越大，說(shuō)明固定相對(duì)此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)3、選擇性因子(selectivityfactor，α)--相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α又稱為相對(duì)保留時(shí)間。要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無(wú)關(guān)。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。第23頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六五、分離參數(shù)分離度(resolution，R)--相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。當(dāng)W1＝W2時(shí)，R＝0；當(dāng)R＝1時(shí)，稱為4σ分離，兩峰基本分離；R＝1.5時(shí)，稱為6σ分離。R≥1.5稱為完全分離。中國(guó)藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5。

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提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當(dāng)α＝1時(shí)，R＝0，無(wú)論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來(lái)改變選擇性：a.改變流動(dòng)相的組成及pH值；b.改變柱溫；c.改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)。第25頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

三、基本分析方法高效液相色譜法在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用非常廣泛，它能用于化學(xué)合成藥物的含量測(cè)定和雜質(zhì)限量分析，用于中草藥和中成藥的定性鑒別和有效成分或指標(biāo)成分的測(cè)定，也用于制劑分析，還用于藥物代謝和動(dòng)力學(xué)研究。此外，HPLC還廣泛用于天然藥物有效成份的分離制備和純化。這些方法主要分為：定性分析、定量分析、雜質(zhì)分析。對(duì)于任何方法都必須進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。第26頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

一HPLC分析方法的參數(shù)及驗(yàn)證

1.專一性專一性（specificity）又稱為特效性，是指在可能存在諸多干擾組分時(shí)方法明確確定被分析組分的能力，分析含有和不含有干擾組分的樣品，比較分析結(jié)果，其差異即是方法偏差（bias）。如果結(jié)果沒(méi)有差異，則說(shuō)明方法具有專一性。HPLC方法的專一性可以通過(guò)檢查色譜峰純度來(lái)驗(yàn)證。采用多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器時(shí)，同時(shí)在兩個(gè)波長(zhǎng)下檢測(cè)色譜峰，如果測(cè)得該峰在兩波長(zhǎng)之處的吸收之第27頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

比值恒定不變，則該峰為純組分色譜峰。

2.準(zhǔn)確度分析方法的準(zhǔn)確度（accuracy）表示測(cè)得值與真值或認(rèn)可的參考值之間的一致程度。此外，真實(shí)性（trueness）表示一組測(cè)量值的平均值與真實(shí)值間的差異，偏差（bias）表示多組測(cè)量值的平均值與真實(shí)值間的差異,偏差是由系統(tǒng)誤差引起的。通常用回收率實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證準(zhǔn)確度。方法回收率實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，實(shí)際上是以相同的方法配置分析對(duì)照品系列和測(cè)試樣第28頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

品，以對(duì)照品結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)（工作）曲線，在以此曲線確定樣品的濃度。再在已知濃度的樣品中加入一定量的對(duì)照品，檢測(cè)其含量。測(cè)得值與已知值之差除以加入值再乘以%即為回收率。回收率一般在100±5%。

3.精密度分析方法的精密度（precision）表示在規(guī)定條件下對(duì)同一均勻樣品多次測(cè)得的一組測(cè)得值之間的一致程度。精密度的表示方法有標(biāo)準(zhǔn)偏差、方差，更多的是相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)第29頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

偏差（RSD）。精密度可分為重復(fù)性（repeatability）、中間精密度(intermediateprecision)和再現(xiàn)性（reproducibility），后兩者統(tǒng)稱為再現(xiàn)性。重復(fù)性表示在相同條件下，短時(shí)間間隔內(nèi)的一致程度，如日內(nèi)精密度（intra-dayprecision）和批內(nèi)精密度(intra-assay或intra-runprecision)；中間精密度表示同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同日期（intra-day）、不同實(shí)驗(yàn)批（intra-assay）、不同分析者、不同儀器間的一致程度。再現(xiàn)性是不同實(shí)驗(yàn)室間的第30頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

一致程度。在HPLC分析中，如果只用對(duì)照品（或樣品）溶液重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定精密度，這只表示色譜系統(tǒng)的精密度。而方法的精密度的驗(yàn)證應(yīng)該對(duì)均一的真實(shí)（QC）樣品進(jìn)行包括樣品處理在內(nèi)的全過(guò)程操作,用接近最低、中間和最高濃度的三個(gè)樣品濃度進(jìn)行隨機(jī)分析。日間精密度還應(yīng)該連續(xù)測(cè)定8天，每個(gè)樣品每天至少測(cè)定2次。第31頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

4.檢測(cè)限和定量限在樣品中能檢測(cè)出的被測(cè)組分的最低濃度（量）稱為檢測(cè)限（limitofdetection,LOD），對(duì)其測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度沒(méi)有確定的要求。

能以適當(dāng)準(zhǔn)確度和精密度定量測(cè)定的樣品中組分的最低濃度（量）稱為定量限（limitofquantitation,LOQ）。這對(duì)低含量的組分的測(cè)定如雜質(zhì)含量的定量測(cè)定和體內(nèi)代謝物的測(cè)定十分重要。在定量分析中，定量限比檢測(cè)限更重要。

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二、定性分析方法定性分析及鑒別試驗(yàn)可以分為色譜鑒別法和非色譜鑒別法，后者又可分為化學(xué)鑒別法和光譜鑒別法。

1.色譜鑒別法色譜鑒別法是利用色譜定性參數(shù)保留時(shí)間（或保留體積）對(duì)組分進(jìn)行定性分析，其原理是同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時(shí)間相同。此法只適用于已知范圍的未知物，如合成藥物的前體或藥物的可能代謝產(chǎn)物等。第33頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

常常采用已知物對(duì)照法，即往樣品中加入某一純物質(zhì)（對(duì)照品），混勻進(jìn)樣。對(duì)比加入前后的色