現(xiàn)代分離技術(shù)-高效液相色譜(HPLC)課件

高效液相色譜高效液相色譜目錄一、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介二、鍵合相色譜法三、親和色譜法四、體積排阻色譜法五、建立高效液相色譜分析方法的一般步驟目錄一、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介第一節(jié)、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介一、經(jīng)典液相柱色譜與高效液相色譜法的比較第一節(jié)、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介二、高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高：新型高效微粒固定相填料（2）選擇性高：同分異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體（3）檢測(cè)靈敏度高：紫外10-9g，熒光10-12g（4）分析速度快：高壓輸液泵二、高效液相色譜法的特點(diǎn)三、高效液相色譜儀的組成其組成部件主要包括：儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀、數(shù)據(jù)處理裝置等。三、高效液相色譜儀的組成其組成部件主要包括：儲(chǔ)液罐、1、流動(dòng)相及儲(chǔ)液罐（1）流動(dòng)相在使用前需經(jīng)脫氣處理（2）流動(dòng)相放入儲(chǔ)液罐前需經(jīng)0.45μm濾膜過濾（3）儲(chǔ)液罐材料耐腐蝕、使用過程宜密閉（4）進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相純度要高、互溶性要好，同時(shí)應(yīng)選擇對(duì)溶劑組成不敏感的檢測(cè)器1、流動(dòng)相及儲(chǔ)液罐2、色譜柱的使用和維護(hù)（1）避免較強(qiáng)機(jī)械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙（2）避免壓力、溫度的急劇變化（3）應(yīng)逐漸改變流動(dòng)相組成（4）色譜柱不宜反沖（5）生物樣品不宜直接進(jìn)入柱內(nèi)（6）常用強(qiáng)溶劑清洗色譜柱以清除雜質(zhì)（7）保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇2、色譜柱的使用和維護(hù)（8）色譜柱的再生A、反相柱再生：依次以MeOH：H2O（95：5）、MeOH、CH2Cl2洗脫，每種溶劑沖洗20-30倍柱體積，再以相反順序沖洗色譜柱B、正相柱再生：依次以正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇洗脫，20-30倍柱體積，再以相反順序沖洗，注意脫水C、離子交換柱再生：稀酸緩沖液沖洗使陽離子樹脂再生；稀堿緩沖液沖洗使陰離子樹脂再生（8）色譜柱的再生3、檢測(cè)器（1）紫外檢測(cè)器：固定波長(zhǎng)、全波長(zhǎng)掃描（二極管陣列檢測(cè)器，DAD）（2）示差折光檢測(cè)器：通過連續(xù)監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器，為通用型檢測(cè)器（可指示樣品在流動(dòng)相中的濃度）（3）電導(dǎo)檢測(cè)器：用于檢測(cè)陰離子或陽離子，在離子色譜中廣泛應(yīng)用（4）熒光檢測(cè)器：利用某些溶質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)來進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可與熒光試劑反應(yīng)后測(cè)試。3、檢測(cè)器消除溶劑干擾和因溫度變化引起的基線漂移、死體積小、靈敏度高通用型質(zhì)量檢測(cè)器，對(duì)各種物質(zhì)均有響應(yīng)，且響應(yīng)因子基本一致，不依賴于樣品分子中的官能團(tuán)，且可用于梯度洗脫。（5）蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器（ELSD）消除溶劑干擾和因溫度變化引起的基線漂移、死體積小、靈敏度高（第二節(jié)、鍵合相色譜法第二節(jié)、鍵合相色譜法一、分離原理1、正相鍵合相色譜法分離原理極性鍵合固定相：將全多孔微粒硅膠載體經(jīng)酸活化處理成表面含有大量硅羥基的載體后，再與含氨基、氰基、醚基的硅烷化試劑反應(yīng)，聲稱表面具有氨基、氰基、醚基的極性固定相。溶質(zhì)在此類固定相上的分離機(jī)理屬于分配色譜。一、分離原理2、反相鍵合相色譜法分離原理非極性鍵合固定相：將全多孔微粒硅膠載體經(jīng)酸活化處理后與含烷基鏈（C4，C8，C18）或苯基的硅烷化試劑反應(yīng)，聲稱表面具有烷基或苯基的非極性固定相。關(guān)于反相鍵合相的分離機(jī)理有兩種論點(diǎn)，一種認(rèn)為屬于分配色譜，另一種認(rèn)為屬于吸附色譜。2、反相鍵合相色譜法分離原理二、化學(xué)鍵合相的類型及應(yīng)用范圍二、化學(xué)鍵合相的類型及應(yīng)用范圍1、氨基柱：具有強(qiáng)極性，一級(jí)胺可與醛、酮的羰基反應(yīng)生成Schiff堿，因此不能用氨基柱分析分離含羰基化合物，分離時(shí)使用的流動(dòng)相中也不能含羰基（如丙酮）2、氰基柱：具有中等極性，對(duì)酸、堿性樣品可獲得對(duì)稱的色譜峰，對(duì)含雙鍵的異構(gòu)體或雙鍵環(huán)狀化合物具有良好的分離能力。3、芳硝基柱：具有電荷轉(zhuǎn)移功能，呈弱極性，對(duì)芳香族化合物及多環(huán)芳烴具有良好的分離選擇性。1、氨基柱：具有強(qiáng)極性，一級(jí)胺可與醛、酮的羰基反應(yīng)生成Sch三、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問題1、硅膠鍵合相的穩(wěn)定性正相鍵合相的穩(wěn)定性要低于反相鍵合相反相烷基鍵合相的穩(wěn)定性與流動(dòng)相的pH值相關(guān)，通常水溶液的pH應(yīng)保持在2-8之間，pH大于8.5會(huì)引起基體硅膠的溶解。2、鍵合相柱的再生正相鍵合相柱可用甲醇-氯仿（1：1）流動(dòng)相進(jìn)行再生，反相鍵合相柱可用甲醇再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基甲酰胺或約0.01M無機(jī)酸水溶液進(jìn)行再生。三、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問題四、流動(dòng)相1、溶劑的選擇性分組四、流動(dòng)相1、溶劑的選擇性分組常用溶劑可分為8個(gè)選擇性不同的特征組，處于同一組中的溶劑具有相似的特性，因此對(duì)某種指定的分離，若某種溶劑不能給出良好的分離選擇性，就可以用另一種其他組的溶劑來替代。常用溶劑可分為8個(gè)選擇性不同的特征組，處于同一組中的2、選擇流動(dòng)相的一般原則2、選擇流動(dòng)相的一般原則3、改善色譜分離選擇性的方法（1）調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性（2）向流動(dòng)相中加入改性劑a、離子抑制法：加入酸、堿、緩沖液抑制溶質(zhì)離子化b、離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)法：向含水流動(dòng)相中加入無機(jī)鹽后，使流動(dòng)相的表面張力增大，減弱殘存硅羥基的干擾，可抑制峰形托尾并改善分離效果3、改善色譜分離選擇性的方法五、離子對(duì)色譜法

離子對(duì)色譜法是將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子（B-，稱為對(duì)離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相（或固定相）中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)，此離子對(duì)不易在水中離解而迅速進(jìn)入有機(jī)相中。五、離子對(duì)色譜法現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件第三節(jié)、親和色譜法一、分離原理：鎖鑰結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的生成第三節(jié)、親和色譜法一、分離原理：鎖鑰結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的生成親和色譜法的分類親和色譜法的分類二、固定相親和色譜固定相由基體、間隔臂、配位體三部分構(gòu)成。1、基體（1）葡聚糖凝膠：SephadexG（2）瓊脂糖凝膠（3）聚丙烯酰胺及其衍生物二、固定相（2）瓊脂糖凝膠性質(zhì)如下表性質(zhì)如下表（4）甲基丙烯酸酯共聚物可耐受脲、鹽酸胍、有機(jī)溶劑的處理，富含醇羥基和醚基，可用多種方法活化，如TSKToyopearlHW-65F凝膠（5）高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物（4）甲基丙烯酸酯共聚物2、配位體（1）染料配位體三嗪染料配位體：此類染料結(jié)構(gòu)與酶的天然底物結(jié)構(gòu)相似，故可與酶或蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)結(jié)合。如人血清白蛋白的純化2、配位體（2）定位金屬離子配位體如（2）定位金屬離子配位體如（3）包合配合物配位體（3）包合配合物配位體（4）生物特效配位體（4）生物特效配位體（5）共價(jià)配位體（5）共價(jià)配位體三、流動(dòng)相三、流動(dòng)相1、非選擇性洗脫法1、非選擇性洗脫法現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件2、特殊洗脫法2、特殊洗脫法現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件第四節(jié)、體積排阻色譜體積排阻色譜凝膠過濾色譜GFC凝膠滲透色譜GPC第四節(jié)、體積排阻色譜體積排阻色譜凝膠過濾色譜GFC凝膠滲透一、分離原理一、分離原理1、分布系數(shù)KD2、溶質(zhì)容量因子KD’1、分布系數(shù)KD2、溶質(zhì)容量因子KD’凝膠滲透極限：KD=1.0，凝膠固定相所有孔洞均能接受樣品分子凝膠排阻極限：KD=0，凝膠固定相所有孔洞均不能使樣品分子進(jìn)入因此在SEC中，不同尺寸樣品分子的分布系數(shù)總是保持在0-1之間。凝膠滲透極限：KD=1.0，凝膠固定相所有孔洞均能接受樣品分以所分離樣品的分子量（M）和組分從柱中洗脫時(shí)的洗脫體積VC繪制校正曲線3、SEC的分離特點(diǎn)（1）、洗脫體積位于V0至V0+VP之間，因此色譜柱的峰容量是有限的，一般只能容納10-12個(gè)色譜峰（2）、不能用于分子大小組成相似，或分子大小僅差10%的組分分析以所分離樣品的分子量（M）和組分從柱中洗脫時(shí)的洗脫體積VC繪二、固定相1、固定相的分類二、固定相（1）軟質(zhì)凝膠Sephadex，Sepharose，Bio-GelA、P等系列，常用于中、低壓色譜，不適用于高柱壓。（2）半剛性凝膠Styragel，NGX系列，聚苯乙烯凝膠，適合有機(jī)溶劑做流動(dòng)相，可承受至少10MPa的柱壓（3）剛性凝膠多孔球形硅膠羥基化聚醚多孔微球如TSK系列（1）軟質(zhì)凝膠2、凝膠固定相的特性參數(shù)（1）滲透極限凝膠可用來分離化合物分子量的最大值，超過此極限，高分子量化合物都從凝膠顆粒間的空隙處流出，而無分離效果。市售凝膠均由滲透極限大小確定產(chǎn)品規(guī)格。（2）分離范圍lgM-VC校正曲線的線性部分。實(shí)際使用中可串聯(lián)兩到三根不同規(guī)格的凝膠柱，以擴(kuò)充其分離范圍。2、凝膠固定相的特性參數(shù)現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件三、流動(dòng)相體積排阻色譜法中，樣品的分離與樣品、流動(dòng)相之間的相互作用無關(guān)，因而無需采用改變流動(dòng)相組成來改善分離度。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意：三、流動(dòng)相現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件1、凝膠滲透色譜的流動(dòng)相1、凝膠滲透色譜的流動(dòng)相續(xù)表續(xù)表現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件2、凝膠過濾色譜的流動(dòng)相使用以水為基體的具有不同pH值的緩沖溶液為流動(dòng)相（1）常加入無機(jī)鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨等以消除吸附作用及基體疏水作用（2）當(dāng)需洗脫生物大分子蛋白質(zhì)時(shí)，可加入離液序列試劑，如鹽酸胍、聚乙二醇、脲、十二烷基磺酸鈉等。2、凝膠過濾色譜的流動(dòng)相四、凝膠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)（附）1、凝膠的選擇

根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如SephadexG-200的吸水量為20，1克SephadexG-200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的SephadexG-200效果好，脫鹽用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快四、凝膠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)（附）2、凝膠的制備商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)，自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。2、凝膠的制備3、樣品溶液的處理樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過SephadexG-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白超過4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。3、樣品溶液的處理4、防止微生物的污染交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長(zhǎng)，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:

⑴疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長(zhǎng)，疊氮鈉易溶一水，在20℃時(shí)約為40％；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。

⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的殺菌效果最佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時(shí)易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.01％。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。

⑷苯基汞代鹽在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01％。在微堿性溶液中抑效果最佳，長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。

4、防止微生物的污染交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止五、SephadexLH-20的使用（附）適合用于有機(jī)溶劑分離親脂性分子。可以非常經(jīng)濟(jì)的大規(guī)模制備各種天然產(chǎn)物，尤其在中藥有效成分提取中作為大孔吸附樹脂解析物的純化。結(jié)合凝膠過濾、分配色譜及吸附層析于一身，能分離結(jié)構(gòu)相近的分子。

產(chǎn)品LH-20分離范圍（球蛋白）100-4000顆粒大小（μm）20-150特性/應(yīng)用膽固醇，脂肪酸，激素，維他命，天然產(chǎn)物PH穩(wěn)定性2－13最高流速（cm/h）400五、SephadexLH-20的使用（附）產(chǎn)品LH-20凝膠過濾的上樣量一般為5-7％的床體積，我們建議初次上樣量控制在1-2％的床體積，視分離情況可以逐步增加難分物質(zhì)要有一定柱高和流速控制；流動(dòng)相可參考TLC的條件，正確的流動(dòng)相可以提高分離度并縮短分離時(shí)間。常用溶劑為：水甲醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷上述溶劑的極性依次降低，對(duì)帶有極性的被分離物而言，保留值和分離度依次遞增；同理選用的凝膠柱高可依次降低，流速可以增大。凝膠過濾的上樣量一般為5-7％的床體積，我們建議初次反相系統(tǒng)：以甲醇-水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)：以氯仿-甲醇最為常見，先用50％氯仿-甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。二氯甲烷通常對(duì)被分離物質(zhì)間的極性和堿性差異比較小時(shí)采用。甲醇通常對(duì)帶環(huán)狀(包括苯環(huán))物質(zhì)分離采用，葡聚糖凝膠對(duì)環(huán)狀物質(zhì)有強(qiáng)烈吸附反相系統(tǒng)：凝膠的裝填SephadexLH-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分?jǐn)嚢?，否則會(huì)破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。

1、在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，參考膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。

2、使溶脹的膠體積沉淀之后占總體積的75％，上層溶劑占25％，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一個(gè)容器時(shí)膠粒可移動(dòng)。

3、將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。凝膠的裝填1、上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì)

2、為確保延長(zhǎng)層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾以除去雜質(zhì)。

3、樣品體積應(yīng)該占柱總體積的1-2％，同樣在使用之前樣品應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾。

4、洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定，最大線流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/h?？傮w來說，較低的流速，具有較高的分辨率。

5、凝膠再生通常事先用2-3個(gè)柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗，如果換洗脫液，則需要重新平衡。1、上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)凝膠操作條件：1、pH范圍：2-112、化學(xué)穩(wěn)定性：pH2以下及強(qiáng)氧化劑中不穩(wěn)定3、121℃可耐受20分鐘4、操作溫度：4-40℃5、可加入抑菌劑（如20％乙醇，0.04％疊氮鈉），切勿冷凍6、保存條件：4-25℃，干燥凝膠操作條件：六、云芝多糖的分離及相對(duì)分子量測(cè)定（例）1、分離條件摸索對(duì)于未知分子量的樣品，通常是采用Line柱進(jìn)行粗分離,摸索分子量大概范圍及其分離條件，再以此條件選擇系統(tǒng)的合適孔徑柱子進(jìn)行細(xì)分離。針對(duì)蕓芝多糖是水溶性高分子混合物，因而選擇水溶性Ul-trahydrogel-line柱摸索分離條件。2、選擇色譜柱由云芝多糖在Ultrahydrogel-line柱上的粗分離最佳條件以及根據(jù)凝膠柱的分子量分離范圍,我們選用Ultrahydrogel-1000+2000型雙柱串聯(lián)

六、云芝多糖的分離及相對(duì)分子量測(cè)定（例）3、流動(dòng)相的離子強(qiáng)度影響考察不同離子強(qiáng)度的流動(dòng)相對(duì)云芝多糖在Ultrahydrogel-line柱上的吸附影響情況當(dāng)鹽濃度在50mmol/LNaNO3時(shí)分離效果較好,繼續(xù)降低鹽濃度,峰面積雖然增大但分離效果變差。故最佳離子強(qiáng)度鹽濃度為50mmol/LNaNO34、校正曲線制作

配制系列窄分布Pullulan多糖標(biāo)樣,其濃度與樣品濃度一致,Mr分別為12.5×105、8.50×105、5.01×105、1.56×105、6×104、2.85×104。在相應(yīng)的色譜條件下得到校正曲線，計(jì)算出曲線擬合公式3、流動(dòng)相的離子強(qiáng)度影響5、云芝多糖各組分相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

根據(jù)GPC校正曲線及云芝多糖色譜流出峰，可計(jì)算云芝多糖各流出組分的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量和重均相對(duì)分子質(zhì)量。5、云芝多糖各組分相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

根據(jù)GPC校正第五節(jié)、建立高效液相色譜分析方法的一般步驟第五節(jié)、建立高效液相色譜分析方法的一般步驟一、樣品的性質(zhì)及柱分離模式的選擇1、樣品的溶解度非極性化合物：吸附、正相分配、正相鍵合相色譜極性化合物：反相分配、反相鍵合相色譜水溶性樣品：pH為中性：非離子型化合物，反相鍵合相色譜pH為弱酸性：流動(dòng)相中加入硫酸或磷酸，再用反相鍵合相色譜分析pH為弱堿性：流動(dòng)相中加入陽離子型反離子，再用離子對(duì)色譜法進(jìn)行分析pH為強(qiáng)酸、堿性：離子對(duì)色譜法一、樣品的性質(zhì)及柱分離模式的選擇pH為中性：非離子型化合物，2、樣品的分子量范圍脂溶性樣品：分子量<2000且分子量差別不大非離子型：吸附或鍵合相色譜離子型：離子對(duì)色譜法分子量<2000且分子量差別很大：剛性凝膠的凝膠滲透色譜法或鍵合相色譜法分子量>2000：聚苯乙烯凝膠的凝膠滲透色譜法2、樣品的分子量范圍非離子型：吸附或鍵合相色譜分子量<200水溶性樣品：分子量<2000且分子量差別不大：吸附或分配色譜法分子量<2000且分子量差別很大：剛性凝膠的凝膠過濾色譜法分子量<2000且分子量差別很大，同時(shí)呈離子型：離子對(duì)色譜法分子量>2000：聚醚凝膠的凝膠過濾色譜法水溶性樣品：分子量<2000且分子量差別很大：剛性凝3、樣品的分子結(jié)構(gòu)和分析特性（1）同系物的分離（2）同分異構(gòu)體的分離3、樣品的分子結(jié)構(gòu)和分析特性（3）對(duì)映異構(gòu)體的分離（4）生物大分子的分離凝膠過濾色譜或親和色譜法（3）對(duì)映異構(gòu)體的分離（4）生物大分子的分離基于樣品分子結(jié)構(gòu)對(duì)分離系統(tǒng)的選擇基于樣品分子結(jié)構(gòu)對(duì)分離系統(tǒng)的選擇現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件二、分離操作條件的選擇最滿意的分離度最短的分離時(shí)間最低的流動(dòng)相消耗最大的檢測(cè)靈敏度二、分離操作條件的選擇最滿意的分離度高效液相色譜高效液相色譜目錄一、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介二、鍵合相色譜法三、親和色譜法四、體積排阻色譜法五、建立高效液相色譜分析方法的一般步驟目錄一、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介第一節(jié)、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介一、經(jīng)典液相柱色譜與高效液相色譜法的比較第一節(jié)、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介二、高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高：新型高效微粒固定相填料（2）選擇性高：同分異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體（3）檢測(cè)靈敏度高：紫外10-9g，熒光10-12g（4）分析速度快：高壓輸液泵二、高效液相色譜法的特點(diǎn)三、高效液相色譜儀的組成其組成部件主要包括：儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀、數(shù)據(jù)處理裝置等。三、高效液相色譜儀的組成其組成部件主要包括：儲(chǔ)液罐、1、流動(dòng)相及儲(chǔ)液罐（1）流動(dòng)相在使用前需經(jīng)脫氣處理（2）流動(dòng)相放入儲(chǔ)液罐前需經(jīng)0.45μm濾膜過濾（3）儲(chǔ)液罐材料耐腐蝕、使用過程宜密閉（4）進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相純度要高、互溶性要好，同時(shí)應(yīng)選擇對(duì)溶劑組成不敏感的檢測(cè)器1、流動(dòng)相及儲(chǔ)液罐2、色譜柱的使用和維護(hù)（1）避免較強(qiáng)機(jī)械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙（2）避免壓力、溫度的急劇變化（3）應(yīng)逐漸改變流動(dòng)相組成（4）色譜柱不宜反沖（5）生物樣品不宜直接進(jìn)入柱內(nèi)（6）常用強(qiáng)溶劑清洗色譜柱以清除雜質(zhì)（7）保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇2、色譜柱的使用和維護(hù)（8）色譜柱的再生A、反相柱再生：依次以MeOH：H2O（95：5）、MeOH、CH2Cl2洗脫，每種溶劑沖洗20-30倍柱體積，再以相反順序沖洗色譜柱B、正相柱再生：依次以正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇洗脫，20-30倍柱體積，再以相反順序沖洗，注意脫水C、離子交換柱再生：稀酸緩沖液沖洗使陽離子樹脂再生；稀堿緩沖液沖洗使陰離子樹脂再生（8）色譜柱的再生3、檢測(cè)器（1）紫外檢測(cè)器：固定波長(zhǎng)、全波長(zhǎng)掃描（二極管陣列檢測(cè)器，DAD）（2）示差折光檢測(cè)器：通過連續(xù)監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器，為通用型檢測(cè)器（可指示樣品在流動(dòng)相中的濃度）（3）電導(dǎo)檢測(cè)器：用于檢測(cè)陰離子或陽離子，在離子色譜中廣泛應(yīng)用（4）熒光檢測(cè)器：利用某些溶質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)來進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可與熒光試劑反應(yīng)后測(cè)試。3、檢測(cè)器消除溶劑干擾和因溫度變化引起的基線漂移、死體積小、靈敏度高通用型質(zhì)量檢測(cè)器，對(duì)各種物質(zhì)均有響應(yīng)，且響應(yīng)因子基本一致，不依賴于樣品分子中的官能團(tuán)，且可用于梯度洗脫。（5）蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器（ELSD）消除溶劑干擾和因溫度變化引起的基線漂移、死體積小、靈敏度高（第二節(jié)、鍵合相色譜法第二節(jié)、鍵合相色譜法一、分離原理1、正相鍵合相色譜法分離原理極性鍵合固定相：將全多孔微粒硅膠載體經(jīng)酸活化處理成表面含有大量硅羥基的載體后，再與含氨基、氰基、醚基的硅烷化試劑反應(yīng)，聲稱表面具有氨基、氰基、醚基的極性固定相。溶質(zhì)在此類固定相上的分離機(jī)理屬于分配色譜。一、分離原理2、反相鍵合相色譜法分離原理非極性鍵合固定相：將全多孔微粒硅膠載體經(jīng)酸活化處理后與含烷基鏈（C4，C8，C18）或苯基的硅烷化試劑反應(yīng)，聲稱表面具有烷基或苯基的非極性固定相。關(guān)于反相鍵合相的分離機(jī)理有兩種論點(diǎn)，一種認(rèn)為屬于分配色譜，另一種認(rèn)為屬于吸附色譜。2、反相鍵合相色譜法分離原理二、化學(xué)鍵合相的類型及應(yīng)用范圍二、化學(xué)鍵合相的類型及應(yīng)用范圍1、氨基柱：具有強(qiáng)極性，一級(jí)胺可與醛、酮的羰基反應(yīng)生成Schiff堿，因此不能用氨基柱分析分離含羰基化合物，分離時(shí)使用的流動(dòng)相中也不能含羰基（如丙酮）2、氰基柱：具有中等極性，對(duì)酸、堿性樣品可獲得對(duì)稱的色譜峰，對(duì)含雙鍵的異構(gòu)體或雙鍵環(huán)狀化合物具有良好的分離能力。3、芳硝基柱：具有電荷轉(zhuǎn)移功能，呈弱極性，對(duì)芳香族化合物及多環(huán)芳烴具有良好的分離選擇性。1、氨基柱：具有強(qiáng)極性，一級(jí)胺可與醛、酮的羰基反應(yīng)生成Sch三、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問題1、硅膠鍵合相的穩(wěn)定性正相鍵合相的穩(wěn)定性要低于反相鍵合相反相烷基鍵合相的穩(wěn)定性與流動(dòng)相的pH值相關(guān)，通常水溶液的pH應(yīng)保持在2-8之間，pH大于8.5會(huì)引起基體硅膠的溶解。2、鍵合相柱的再生正相鍵合相柱可用甲醇-氯仿（1：1）流動(dòng)相進(jìn)行再生，反相鍵合相柱可用甲醇再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基甲酰胺或約0.01M無機(jī)酸水溶液進(jìn)行再生。三、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問題四、流動(dòng)相1、溶劑的選擇性分組四、流動(dòng)相1、溶劑的選擇性分組常用溶劑可分為8個(gè)選擇性不同的特征組，處于同一組中的溶劑具有相似的特性，因此對(duì)某種指定的分離，若某種溶劑不能給出良好的分離選擇性，就可以用另一種其他組的溶劑來替代。常用溶劑可分為8個(gè)選擇性不同的特征組，處于同一組中的2、選擇流動(dòng)相的一般原則2、選擇流動(dòng)相的一般原則3、改善色譜分離選擇性的方法（1）調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性（2）向流動(dòng)相中加入改性劑a、離子抑制法：加入酸、堿、緩沖液抑制溶質(zhì)離子化b、離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)法：向含水流動(dòng)相中加入無機(jī)鹽后，使流動(dòng)相的表面張力增大，減弱殘存硅羥基的干擾，可抑制峰形托尾并改善分離效果3、改善色譜分離選擇性的方法五、離子對(duì)色譜法

離子對(duì)色譜法是將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子（B-，稱為對(duì)離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相（或固定相）中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)，此離子對(duì)不易在水中離解而迅速進(jìn)入有機(jī)相中。五、離子對(duì)色譜法現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件第三節(jié)、親和色譜法一、分離原理：鎖鑰結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的生成第三節(jié)、親和色譜法一、分離原理：鎖鑰結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的生成親和色譜法的分類親和色譜法的分類二、固定相親和色譜固定相由基體、間隔臂、配位體三部分構(gòu)成。1、基體（1）葡聚糖凝膠：SephadexG（2）瓊脂糖凝膠（3）聚丙烯酰胺及其衍生物二、固定相（2）瓊脂糖凝膠性質(zhì)如下表性質(zhì)如下表（4）甲基丙烯酸酯共聚物可耐受脲、鹽酸胍、有機(jī)溶劑的處理，富含醇羥基和醚基，可用多種方法活化，如TSKToyopearlHW-65F凝膠（5）高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物（4）甲基丙烯酸酯共聚物2、配位體（1）染料配位體三嗪染料配位體：此類染料結(jié)構(gòu)與酶的天然底物結(jié)構(gòu)相似，故可與酶或蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)結(jié)合。如人血清白蛋白的純化2、配位體（2）定位金屬離子配位體如（2）定位金屬離子配位體如（3）包合配合物配位體（3）包合配合物配位體（4）生物特效配位體（4）生物特效配位體（5）共價(jià)配位體（5）共價(jià)配位體三、流動(dòng)相三、流動(dòng)相1、非選擇性洗脫法1、非選擇性洗脫法現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件2、特殊洗脫法2、特殊洗脫法現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件第四節(jié)、體積排阻色譜體積排阻色譜凝膠過濾色譜GFC凝膠滲透色譜GPC第四節(jié)、體積排阻色譜體積排阻色譜凝膠過濾色譜GFC凝膠滲透一、分離原理一、分離原理1、分布系數(shù)KD2、溶質(zhì)容量因子KD’1、分布系數(shù)KD2、溶質(zhì)容量因子KD’凝膠滲透極限：KD=1.0，凝膠固定相所有孔洞均能接受樣品分子凝膠排阻極限：KD=0，凝膠固定相所有孔洞均不能使樣品分子進(jìn)入因此在SEC中，不同尺寸樣品分子的分布系數(shù)總是保持在0-1之間。凝膠滲透極限：KD=1.0，凝膠固定相所有孔洞均能接受樣品分以所分離樣品的分子量（M）和組分從柱中洗脫時(shí)的洗脫體積VC繪制校正曲線3、SEC的分離特點(diǎn)（1）、洗脫體積位于V0至V0+VP之間，因此色譜柱的峰容量是有限的，一般只能容納10-12個(gè)色譜峰（2）、不能用于分子大小組成相似，或分子大小僅差10%的組分分析以所分離樣品的分子量（M）和組分從柱中洗脫時(shí)的洗脫體積VC繪二、固定相1、固定相的分類二、固定相（1）軟質(zhì)凝膠Sephadex，Sepharose，Bio-GelA、P等系列，常用于中、低壓色譜，不適用于高柱壓。（2）半剛性凝膠Styragel，NGX系列，聚苯乙烯凝膠，適合有機(jī)溶劑做流動(dòng)相，可承受至少10MPa的柱壓（3）剛性凝膠多孔球形硅膠羥基化聚醚多孔微球如TSK系列（1）軟質(zhì)凝膠2、凝膠固定相的特性參數(shù)（1）滲透極限凝膠可用來分離化合物分子量的最大值，超過此極限，高分子量化合物都從凝膠顆粒間的空隙處流出，而無分離效果。市售凝膠均由滲透極限大小確定產(chǎn)品規(guī)格。（2）分離范圍lgM-VC校正曲線的線性部分。實(shí)際使用中可串聯(lián)兩到三根不同規(guī)格的凝膠柱，以擴(kuò)充其分離范圍。2、凝膠固定相的特性參數(shù)現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件三、流動(dòng)相體積排阻色譜法中，樣品的分離與樣品、流動(dòng)相之間的相互作用無關(guān)，因而無需采用改變流動(dòng)相組成來改善分離度。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意：三、流動(dòng)相現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件1、凝膠滲透色譜的流動(dòng)相1、凝膠滲透色譜的流動(dòng)相續(xù)表續(xù)表現(xiàn)代分離技術(shù)——高效液相色譜(HPLC)課件2、凝膠過濾色譜的流動(dòng)相使用以水為基體的具有不同pH值的緩沖溶液為流動(dòng)相（1）常加入無機(jī)鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨等以消除吸附作用及基體疏水作用（2）當(dāng)需洗脫生物大分子蛋白質(zhì)時(shí)，可加入離液序列試劑，如鹽酸胍、聚乙二醇、脲、十二烷基磺酸鈉等。2、凝膠過濾色譜的流動(dòng)相四、凝膠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)（附）1、凝膠的選擇

根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如SephadexG-200的吸水量為20，1克SephadexG-200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的SephadexG-200效果好，脫鹽用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快四、凝膠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)（附）2、凝膠的制備商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)，自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。2、凝膠的制備3、樣品溶液的處理樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過SephadexG-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白超過4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。3、樣品溶液的處理4、防止微生物的污染交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長(zhǎng)，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:

⑴疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長(zhǎng)，疊氮鈉易溶一水，在20℃時(shí)約為40％；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。

⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的殺菌效果最佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時(shí)易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.01％。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。

⑷苯基汞代鹽在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01％。在微堿性溶液中抑效果最佳，長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。

4、防止微生物的污染交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止五、SephadexLH-20的使用（附）適合用于有機(jī)溶劑分離親脂性分子?？梢苑浅＝?jīng)濟(jì)的大規(guī)模制備各種天然產(chǎn)物，尤其在中藥有效成分提取中作為大孔吸附樹脂解析物的純化。結(jié)合凝膠過濾、分配色譜及吸附層析于一身，能分離結(jié)構(gòu)相近的分子。

產(chǎn)品LH-20分離范圍（球蛋白）100-4000顆粒大?。é蘭）20-150特性/應(yīng)用膽固醇，脂肪酸，激素，維他命，天然產(chǎn)物PH穩(wěn)定性2－13最高流速（cm/h）400五、SephadexLH-20的使用（附）產(chǎn)品LH-20凝膠過濾的上樣量一般為5-7％的床體積，我們建議初次上樣量控制在1-2％的床體積，視分離情況可以逐步增加難分物質(zhì)要有一定柱高和流速控制；流動(dòng)相可參考TLC的條件，正確的流動(dòng)相可以提高分離度并縮短分離時(shí)間。常用溶劑為：水甲醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷上述溶劑的極性依次降低，對(duì)帶有極性的被分離物而言，保留值和分離度依次遞增；同理選用的凝膠柱高可依次降低，流速可以增大。凝膠過濾的上樣量一般為5-7％的床體積，我們建議初次反相系統(tǒng)：以甲醇-水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)：以氯仿-甲醇最為常見，先用50％氯仿-甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。二氯甲烷通常對(duì)被分離物質(zhì)間的極性和堿性差異比較小時(shí)采用。甲醇通常對(duì)帶環(huán)狀(包括苯環(huán))物質(zhì)分離采用，葡聚糖凝膠對(duì)環(huán)狀物質(zhì)有強(qiáng)烈吸附反相系統(tǒng)：凝膠的裝填SephadexLH-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分?jǐn)嚢瑁駝t會(huì)破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。

1、在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，參考膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。

2、使溶脹的膠體積沉淀之后占總體積的75％，上層溶劑占25％，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一個(gè)容器時(shí)膠?？梢苿?dòng)。

3、將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。凝膠的裝填1、上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì)

2、為確保延長(zhǎng)層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾以除去雜質(zhì)。

3、樣品體積應(yīng)該占柱總體積的1-2％，同樣在使用之前樣品應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾。

4、洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定，最大線流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/h?？傮w來說，較低的流速，具有較高的分辨率。

5、凝膠再生通常事先用2-3個(gè)柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗，如果換洗脫液，則需要重新平衡。1、上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)凝膠操作條件：1、pH范圍：2-112、化學(xué)穩(wěn)定性：pH2以下及強(qiáng)氧化劑中不穩(wěn)定3、121℃