章基因工程課件

基因重組和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章基因重組和基因工程第十四章1基因重組(generecombination)是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。基因工程(geneticengineering）是指采用人工方法將不同來源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程?；蛑亟M(generecombination)是指DNA片第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombDNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)轉(zhuǎn)座(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(t發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組(homologousrecombination)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊5′3′5′3′5′3′5′3′②一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNAHolliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊5′3′5′3′5′3′5′3

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移(recA)內(nèi)切酶(recBCD)DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA侵?jǐn)_分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′5′3′5′3④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：1、片段重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。2、拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNAHoliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶拼接重組體片段重組體Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)質(zhì)?！?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)質(zhì)?！?xì)菌（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用(transformation)。

（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。1943年，Avery將有毒型肺炎雙球菌DNA與無毒型肺炎雙球菌一起培養(yǎng)，結(jié)果使無毒型肺炎雙球菌轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘头窝纂p球菌。其原因就是有毒型肺炎雙球菌DNA進(jìn)入無毒型肺炎雙球菌中，引起其遺傳性狀改變。1943年，Avery將有毒型肺炎雙球菌DNA與無毒型肺炎雙章基因工程課件（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)例λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑例溶源生長(zhǎng)途徑（整合途徑）：噬菌體整合進(jìn)宿主細(xì)菌染色體，隨宿主菌DNA復(fù)制而復(fù)制。溶菌生長(zhǎng)途徑（裂解途徑）：噬菌體DNA在宿主菌內(nèi)迅速復(fù)制，溶解細(xì)菌，產(chǎn)生新生噬菌體。轉(zhuǎn)染：是特殊形式的轉(zhuǎn)化，是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體DNA/RNA感染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生的變化溶源生長(zhǎng)途徑（整合途徑）：噬菌體整合進(jìn)宿主細(xì)菌染色體，隨宿主當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合作用：參與表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)育過程中程序性的DNA重排有些病毒或者質(zhì)粒復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除等等三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specificr例（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

例（一）λ噬菌體DNA的整合例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。某些基因的位置在基因組中是可以變動(dòng)的，如：插入序列，轉(zhuǎn)座子四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(章基因工程課件插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個(gè)分離的反向重復(fù)序列(invertedrepeats,IR)特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因（當(dāng)轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)時(shí)，即可引起該序列的轉(zhuǎn)座）IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座插入序列(insertionsequences,IS)組插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座“如果你能腳踏實(shí)地從事研究并如實(shí)報(bào)告觀察結(jié)果，同時(shí)保持健康長(zhǎng)壽，那么，你有可能獲諾貝爾獎(jiǎng)?！保ǘ┺D(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座“如果你能腳踏實(shí)地從事研究并轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因轉(zhuǎn)座子(transposons)IRIRTransposa許多轉(zhuǎn)座子中，它的側(cè)翼序列本身就是插入序列許多轉(zhuǎn)座子中，它的側(cè)翼序列本身就是插入序列由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因（VH）和一組恒定區(qū)基因（CH）構(gòu)成，通過這些基因的選擇性轉(zhuǎn)座和重組，就可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)出各種各樣的免疫球蛋白重鏈，以對(duì)付不同的抗原。

免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因（VH）和一組第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinat章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件基因重組——是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。廣泛的分為三個(gè)水平：整體水平（如生物有性雜交）細(xì)胞水平（如單克隆抗體技術(shù)）分子水平（如構(gòu)建重組體）基因重組一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(cl技術(shù)水平：分子克隆(即DNA克隆

)細(xì)胞克隆個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）技術(shù)水平：分子克隆(即DNA克隆)應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。定義DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)限制性核酸內(nèi)切酶:是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCGGATCC+BamHⅠ定義Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型，特點(diǎn)是識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)一致分類與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。作用分類作用第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名HindⅢⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口鈍性末端粘性末端BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA等等（四）基因載體定義常用載體克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。生物安全載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；1.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。1.質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)章基因工程課件λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬含有的lacZ基因編碼了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外源DNA后，α片段不能正常合成含有的lacZ基因編碼了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外3.柯斯質(zhì)粒(cosmid)一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了λ噬菌體的cos基因。柯斯質(zhì)粒能被包裝到λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的DNA片段（超過45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大3.柯斯質(zhì)粒(cosmid)一種人工構(gòu)建的克隆載體酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程以章基因工程課件（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法*化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。一般用于小分子基因的合成*化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌*從基因組DNA文庫獲取目的基因組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcosc基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）將某一基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪螅c載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為G文庫基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）cDNA文庫(cDNAlibrary)：

以某種細(xì)胞的全部mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA（cDNA）再復(fù)制成雙鏈cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫(cDNAlibrary)：C-章基因工程課件如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。但此法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。

利用PCR合成：如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接（二）克隆載體的BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端2.平端連接目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

4.人工接頭(linker)連接人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)處理后處于最適攝取和容忍重組體的狀態(tài)。受體菌條件導(dǎo)入方式（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌感受態(tài)細(xì)胞：受體（五）重組體的篩選

1.直接選擇法——針對(duì)基因設(shè)計(jì)的篩選方法(1)

抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法——針對(duì)表達(dá)的產(chǎn)物設(shè)計(jì)的方法如：免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等（五）重組體的篩選(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救組氨酸缺陷無組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體α互補(bǔ)的檢測(cè)標(biāo)志補(bǔ)救α互補(bǔ)的檢測(cè)標(biāo)志補(bǔ)救藍(lán)白選擇藍(lán)白選擇原位雜交原位雜交Southern印跡Southern印跡雞的β肌球蛋白的克隆和檢出雞的β肌球蛋白的克隆和檢出重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立（六）克隆基因的表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)缺點(diǎn)：

不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達(dá)大量可溶性蛋白1.原核表達(dá)體系（E.coli表達(dá)體系最為常用）優(yōu)點(diǎn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子1.原核表達(dá)體系（E.col大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌 大鼠胰島素原cDNA章基因工程課件優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程

磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射

2.真核表達(dá)體系

酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞方法的選擇決定于細(xì)胞的種類、特性及表達(dá)載體的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA轉(zhuǎn)染——將表表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜章基因工程課件（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物制藥（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化生長(zhǎng)素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴(kuò)增待測(cè)的DNA片斷基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物標(biāo)準(zhǔn).能正確擴(kuò)增靶基因；.能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動(dòng)化操作，適合大面積、大人群普查。標(biāo)準(zhǔn)（四）基因治療定義基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。方式體細(xì)胞基因治療(somaticcellgenetherapy)性細(xì)胞基因治療(germlinegenetherapy)（四）基因治療定義方式1.產(chǎn)前診斷2.攜帶者測(cè)試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預(yù)防1.產(chǎn)前診斷（五）遺傳疾病的預(yù)防演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！

基因重組和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章基因重組和基因工程第十四章115基因重組(generecombination)是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能?；蚬こ?geneticengineering）是指采用人工方法將不同來源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程?；蛑亟M(generecombination)是指DNA片第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombDNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)轉(zhuǎn)座(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(t發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組(homologousrecombination)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊5′3′5′3′5′3′5′3′②一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNAHolliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊5′3′5′3′5′3′5′3

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移(recA)內(nèi)切酶(recBCD)DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA侵?jǐn)_分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′5′3′5′3④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：1、片段重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。2、拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNAHoliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶拼接重組體片段重組體Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)質(zhì)?！?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)質(zhì)粒——細(xì)菌（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用(transformation)。

（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。1943年，Avery將有毒型肺炎雙球菌DNA與無毒型肺炎雙球菌一起培養(yǎng)，結(jié)果使無毒型肺炎雙球菌轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘头窝纂p球菌。其原因就是有毒型肺炎雙球菌DNA進(jìn)入無毒型肺炎雙球菌中，引起其遺傳性狀改變。1943年，Avery將有毒型肺炎雙球菌DNA與無毒型肺炎雙章基因工程課件（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)例λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑例溶源生長(zhǎng)途徑（整合途徑）：噬菌體整合進(jìn)宿主細(xì)菌染色體，隨宿主菌DNA復(fù)制而復(fù)制。溶菌生長(zhǎng)途徑（裂解途徑）：噬菌體DNA在宿主菌內(nèi)迅速復(fù)制，溶解細(xì)菌，產(chǎn)生新生噬菌體。轉(zhuǎn)染：是特殊形式的轉(zhuǎn)化，是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體DNA/RNA感染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生的變化溶源生長(zhǎng)途徑（整合途徑）：噬菌體整合進(jìn)宿主細(xì)菌染色體，隨宿主當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合作用：參與表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)育過程中程序性的DNA重排有些病毒或者質(zhì)粒復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除等等三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specificr例（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

例（一）λ噬菌體DNA的整合例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。某些基因的位置在基因組中是可以變動(dòng)的，如：插入序列，轉(zhuǎn)座子四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(章基因工程課件插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個(gè)分離的反向重復(fù)序列(invertedrepeats,IR)特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因（當(dāng)轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)時(shí)，即可引起該序列的轉(zhuǎn)座）IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座插入序列(insertionsequences,IS)組插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座“如果你能腳踏實(shí)地從事研究并如實(shí)報(bào)告觀察結(jié)果，同時(shí)保持健康長(zhǎng)壽，那么，你有可能獲諾貝爾獎(jiǎng)?！保ǘ┺D(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座“如果你能腳踏實(shí)地從事研究并轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因轉(zhuǎn)座子(transposons)IRIRTransposa許多轉(zhuǎn)座子中，它的側(cè)翼序列本身就是插入序列許多轉(zhuǎn)座子中，它的側(cè)翼序列本身就是插入序列由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因（VH）和一組恒定區(qū)基因（CH）構(gòu)成，通過這些基因的選擇性轉(zhuǎn)座和重組，就可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)出各種各樣的免疫球蛋白重鏈，以對(duì)付不同的抗原。

免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因（VH）和一組第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinat章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件章基因工程課件基因重組——是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。廣泛的分為三個(gè)水平：整體水平（如生物有性雜交）細(xì)胞水平（如單克隆抗體技術(shù)）分子水平（如構(gòu)建重組體）基因重組一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(cl技術(shù)水平：分子克隆(即DNA克隆

)細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）技術(shù)水平：分子克隆(即DNA克隆)應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。定義DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)限制性核酸內(nèi)切酶:是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCGGATCC+BamHⅠ定義Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型，特點(diǎn)是識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)一致分類與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。作用分類作用第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名HindⅢⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口鈍性末端粘性末端BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA等等（四）基因載體定義常用載體克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。生物安全載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；1.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。1.質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)章基因工程課件λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬含有的lacZ基因編碼了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外源DNA后，α片段不能正常合成含有的lacZ基因編碼了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外3.柯斯質(zhì)粒(cosmid)一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了λ噬菌體的cos基因?？滤官|(zhì)粒能被包裝到λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的DNA片段（超過45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大3.柯斯質(zhì)粒(cosmid)一種人工構(gòu)建的克隆載體酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程以章基因工程課件（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法*化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。一般用于小分子基因的合成*化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌*從基因組DNA文庫獲取目的基因組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcosc基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）將某一基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪螅c載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為G文庫基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）cDNA文庫(cDNAlibrary)：

以某種細(xì)胞的全部mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA（cDNA）再復(fù)制成雙鏈cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫(cDNAlibrary)：C-章基因工程課件如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。但此法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。

利用PCR合成：如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接（二）克隆載體的BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端2.平端連接目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶4.人工接頭(linker)連接由平端