電鏡技術(shù)及超薄切片技術(shù)(研究生)醫(yī)學(xué)課件

電子顯微鏡室簡介我室的電鏡型號(hào)和性能如下：H-600A型透射電鏡，購于1989年，最大點(diǎn)分辨率為0.36nm,有效放大倍數(shù)達(dá)30萬倍。H-7500型透射電鏡，購于2004年，最大點(diǎn)分辨率為0.24nm,有效放大倍數(shù)達(dá)60萬倍。S-3000N型掃描電鏡，購于2004年，有效放大倍數(shù)達(dá)30萬倍。1醫(yī)學(xué)ppt電子顯微鏡室簡介1醫(yī)學(xué)ppt

1924年，法國物理學(xué)家Broglie提出了“電子與光一樣，具有波動(dòng)性“的假說，并計(jì)算出電磁波長為0.005nm.1926年，德國科學(xué)家Busch發(fā)現(xiàn)了帶電粒子在電場或磁場中偏轉(zhuǎn)聚焦的現(xiàn)象，類似于光線通過透鏡可被聚焦一樣。1928—1931年間，德國年輕的大學(xué)生Ruska測量了磁透鏡的聚焦特性，并開展了電子放大成像的研究，終于在1938年成功研制了世界上第一臺(tái)真正的電子顯微鏡，放大倍數(shù)為1200倍，被譽(yù)為電子顯微鏡之父。，并在1986年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。20世紀(jì)50年代初到60年代末期，電鏡發(fā)展很快，從性能到構(gòu)造都得到很大的改進(jìn)，特別是分辨本領(lǐng)得到大幅度提高，達(dá)到1nm左右，到80年代的點(diǎn)分辨率已接近0.1nm，最新研制的超高壓透射電鏡的點(diǎn)分辨率可達(dá)0.005nm。電鏡的發(fā)展歷程2醫(yī)學(xué)ppt1924年，法國物理學(xué)家Broglie提電鏡的基本類型：

1、透射電子顯微鏡

2、掃描電子顯微鏡

3、分析電子顯微鏡

4、超高壓電子顯微鏡

5、掃描探針顯微鏡

（掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡、掃描光子顯微鏡等）3醫(yī)學(xué)ppt電鏡的基本類型：

1、透射電子顯微鏡

2、掃描電子顯微鏡

3

一、電子顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)

光的衍射現(xiàn)象：

由于光具有波動(dòng)性，當(dāng)光線通過小孔或小孔光源經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成象會(huì)產(chǎn)生衍射。其圖案是:中央部分一個(gè)亮斑，在其周圍有明暗交替的園環(huán)。2D

D=4醫(yī)學(xué)ppt

可以這么說，顯微鏡分辯本領(lǐng)是由其產(chǎn)生的衍射圖中央亮斑半徑D（分辨能力）而定：

阿貝公式：

D=

當(dāng)光的波長為λ=500nm=0.5μm

介質(zhì)折射率N（油）=1.5

物體與物鏡所形成夾角的半數(shù)α<90o中央亮斑的半徑D=200nm=0.2μm

5醫(yī)學(xué)ppt可以這么說，顯微鏡分辯本領(lǐng)是由其產(chǎn)生的衍射圖中分辨本領(lǐng)測算：1、人眼在明視距離250mm處能分辨0.2mm的兩點(diǎn)。

油鏡最小能分辨0.2μm的兩點(diǎn)。

則油鏡理論最大放大能力為：0.2mm/0.2μm=10002、假如一臺(tái)電鏡的點(diǎn)分辨率為0.1nm,則其理論放大倍數(shù)為：0.2mm/0.1nm=2x1063、H-7500型透射電鏡的點(diǎn)分辨率為0.24nm,則其理論放大倍數(shù)為：0.2mm/0.24nm=0.83x106。而其有效放大倍數(shù)為0.6x1066醫(yī)學(xué)ppt分辨本領(lǐng)測算：1、人眼在明視距離250mm處能分辨0.2m瑞利準(zhǔn)則

光線通過二個(gè)比較靠近的小孔時(shí)，這二個(gè)小孔的衍射圖會(huì)重疊在一起。當(dāng)一個(gè)衍射圖的中央亮斑正好落在另一個(gè)衍射圖的第一暗環(huán)中心時(shí)，這二個(gè)點(diǎn)剛可以分辯。這就是顯微鏡分辯本領(lǐng)的瑞利準(zhǔn)則。7醫(yī)學(xué)ppt瑞利準(zhǔn)則光線通過二個(gè)比較靠近的小孔時(shí)，這二個(gè)運(yùn)動(dòng)著的電子所產(chǎn)生電磁波長為：

λ=(nm)如V=50000v

則λ=0.005nm=0.000005μm

是光的λ=500nm的10萬分之一，大大減少了衍射光斑D的值。8醫(yī)學(xué)ppt運(yùn)動(dòng)著的電子所產(chǎn)生電磁波長為：

光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡在工作原理上的比較：

光學(xué)顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對(duì)光進(jìn)行折射，將一物點(diǎn)發(fā)出不同角度的光線最終會(huì)聚成一個(gè)像點(diǎn)。

電子顯微鏡是利用電場或磁場折射電子束，達(dá)到成像目的。

9醫(yī)學(xué)ppt光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡在工作原理上的比較：9醫(yī)光源聚光鏡樣品物鏡投影鏡最終象透射電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡10醫(yī)學(xué)ppt光源透射電子顯微鏡

鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖：

1)照明系統(tǒng)：電子槍聚光鏡2）樣品室3）成象系統(tǒng)：物鏡中間鏡投影鏡4）觀察記錄系統(tǒng)：觀察室照相機(jī)

11醫(yī)學(xué)ppt鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖：11醫(yī)學(xué)ppt一、電子顯微鏡的照明系統(tǒng)1、電子槍一般安裝在鏡筒的頂端，是一個(gè)由陰極、柵極和陽極三個(gè)部分組成的結(jié)構(gòu)。大多數(shù)陰極為熱陰極。燈絲為鎢燈絲，呈V形，尖端向下，其余兩端連接電源。2、聚光鏡由鐵殼包裹的線圈構(gòu)成，通入電流后乃形成電磁場，使由電子槍發(fā)出的電子束進(jìn)一步密集聚攏，以增強(qiáng)其照明效果。聚光鏡的中央位置裝有極靴，其作用是籍以增強(qiáng)磁場強(qiáng)度，而磁場強(qiáng)度可通過改變所加電流大小來調(diào)節(jié)，以達(dá)到根據(jù)需要調(diào)節(jié)放大倍率和對(duì)所形成圖象進(jìn)行聚焦的目的。一般電鏡都設(shè)有二級(jí)聚光鏡。12醫(yī)學(xué)ppt一、電子顯微鏡的照明系統(tǒng)12醫(yī)學(xué)ppt二、電子顯微鏡的成像系統(tǒng)1、物鏡由鐵殼包裹的線圈組成，是電鏡成像系統(tǒng)的關(guān)鍵性部件。在物鏡中心位置同樣裝有精密度極高的極靴，以及要求很高的肖像散部件，以盡量消除成像過程中難以完全避免的像散現(xiàn)象，保證成像的清晰度。在物鏡的后焦面裝有可動(dòng)光闌片，可根據(jù)具體情況來調(diào)整光闌孔的大小。2、中間鏡也是由鐵殼包裹的線圈組成，位于物鏡和投影鏡之間，作用是將物鏡所成的放大像進(jìn)一步放大。目前高檔的電鏡可設(shè)有三極中間鏡。3、投影鏡也是由鐵殼包裹的線圈組成，作用是將以上成像進(jìn)一步放大并投影于熒光屏上，激發(fā)熒光，形成影象。13醫(yī)學(xué)ppt二、電子顯微鏡的成像系統(tǒng)13醫(yī)學(xué)ppt三、觀察記錄系統(tǒng)1、熒光屏為圓形平面結(jié)構(gòu)，上面涂以熒光粉，當(dāng)高速電子撞擊其表面時(shí)，便激發(fā)出熒光，從而使觀察者能通過含鉛玻璃窗口直接看到影象。2、照相室在熒光屏的下邊，裝有電鏡軟片，通過電子束直接轟擊軟片表面而使軟片爆光，從而使觀察影象以底片或照片的形式保存下來。14醫(yī)學(xué)ppt三、觀察記錄系統(tǒng)14醫(yī)學(xué)ppt四、真空系統(tǒng)

由低真空和高真空兩極真空泵構(gòu)成。前者稱為機(jī)械泵，排氣氣壓達(dá)0.01mmHg;后者稱為擴(kuò)散泵，排氣氣壓可達(dá)0.0001mmHg以下。真空系統(tǒng)的作用是使鏡筒內(nèi)部獲得高真空。如果鏡筒內(nèi)真空度較差，將會(huì):1）氣體分子與高速電子相互作用，隨機(jī)地散射電子，降低象的反差。2）電子槍中存在殘余氣體，會(huì)產(chǎn)生電離和放電，引起電子束發(fā)射不穩(wěn)定。3）殘余產(chǎn)體與白燈絲發(fā)生作用，降低燈絲壽命。4）殘余產(chǎn)體在樣品周圍會(huì)污染樣品。15醫(yī)學(xué)ppt四、真空系統(tǒng)15醫(yī)學(xué)ppt

五、供電系統(tǒng)它是由以下三個(gè)部分組成1）高壓電源：使電子獲得一定的速度。通常電壓為25KV、50KV、75KV和100KV。2）磁透鏡激勵(lì)磁電源：它提供了磁透鏡所必需的電源，從而使磁透鏡周圍有一個(gè)特定形狀的磁場。3）輔助電源：例如真空系統(tǒng)控制電源、調(diào)焦和嚗光裝置、照相機(jī)自動(dòng)控制和記數(shù)電路等等。16醫(yī)學(xué)ppt五、供電系統(tǒng)16醫(yī)學(xué)ppt六、輔助系統(tǒng)1）水冷系統(tǒng)：是用水冷卻油擴(kuò)散泵、磁透鏡的線圈等，保證設(shè)備正常工作。2）氣動(dòng)系統(tǒng)：采用壓縮空氣作為動(dòng)力，將各種閥門按程序要求打開或關(guān)閉，完成所須任務(wù)。17醫(yī)學(xué)ppt六、輔助系統(tǒng)17醫(yī)學(xué)ppt透射與掃描電鏡原理圖解18醫(yī)學(xué)ppt透射與掃描電鏡原理圖解18醫(yī)學(xué)ppt掃描電子顯微鏡工作原理

就是通過極細(xì)的電子束掃描標(biāo)本表面而激發(fā)出二次電子，并被接收到陰極射線管而成像。

掃描電鏡由兩個(gè)主要部分組成：

探查系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)

19醫(yī)學(xué)ppt掃描電子顯微鏡工作原理

就是通過極細(xì)的電子束一、探查系統(tǒng)：由電子槍、電磁透鏡組成。

電子槍發(fā)射電子束（加速電壓在1—50KV），經(jīng)過電磁透鏡的作用，射擊標(biāo)本表面，使之產(chǎn)生二次電子。二、顯示系統(tǒng)：電子檢測器，閃爍器、光電倍增器以及顯示屏組成。

由電子束激發(fā)的二次電子被位于檢測器前端的柵極所吸引，并被強(qiáng)正電場加速飛向閃爍器。當(dāng)電子擊中閃爍器時(shí)，后者乃產(chǎn)生光子，光子沿導(dǎo)光管引向光電倍增器，并在此產(chǎn)生光電子，此信號(hào)經(jīng)放大后被傳輸?shù)疥帢O射線管（顯示屏），從而在此成像。20醫(yī)學(xué)ppt一、探查系統(tǒng)：由電子槍、電磁透鏡組成。20醫(yī)學(xué)ppt透射電子顯微鏡拍攝的照片掃描電子顯微鏡拍攝的照片21醫(yī)學(xué)ppt透射電子顯微鏡拍攝的照片掃描電子顯微鏡拍攝的照片21醫(yī)學(xué)pp

電子束的穿透能力一般較弱，大多數(shù)標(biāo)本無法直接在電鏡下觀察，必須把樣品切成厚度為10—1000nm的薄片。這種切片稱為超薄切片，是電鏡觀察生物樣品常用方法之一。(1)

超薄切片技術(shù)二、透射電子顯微鏡樣品制備22醫(yī)學(xué)ppt電子束的穿透能力一般較弱，大多數(shù)標(biāo)本無法直接

1）取材取材的要點(diǎn)是快、小、冷、準(zhǔn)，組織要新鮮?？欤喝〔臅r(shí)間在1—2分鐘以內(nèi)完成；?。后w積大小在1立方毫米左右或橫切面為1平方毫米的長條形；冷：固定液溫度在4攝氏度左右。準(zhǔn)：取材部位要準(zhǔn)確，盡量取材于所要觀察的部位。23醫(yī)學(xué)ppt1）取材23醫(yī)學(xué)ppt取材方法：

1、器官組織取材法：主要針對(duì)活體器官組織的取材如腎、肝、肺等活檢組織。

2、游離細(xì)胞收集法：主要針對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞及游離細(xì)胞如血細(xì)胞、脫落細(xì)胞等。常用方法有血漿凝集法和瓊脂預(yù)包埋法。

24醫(yī)學(xué)ppt取材方法：

1、器官組織取材法：主要針對(duì)活體器官組織的取材雙刀拉鋸法25醫(yī)學(xué)ppt雙刀拉鋸法25醫(yī)學(xué)ppt2）固定

固定的目的是被研究的材料盡量保持生活狀態(tài)時(shí)的組織結(jié)構(gòu)，避免因缺血缺氧所帶來的“死后變化”。

固定方法分物理固定法和化學(xué)固定法

1、物理固定法：微波快速高溫、冷凍或干燥

2、化學(xué)固定法：使用化學(xué)試劑-固定劑

3、常用固定劑：2.5%戊二醛、1%鋨酸、

5%高錳酸鉀、10%福爾馬林、等。26醫(yī)學(xué)ppt2）固定

固定的目的是被研1．組織塊固定：適用活組織檢查，如腎、肝、胃腸道等等。常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。2．游離細(xì)胞的固定：適用于培養(yǎng)細(xì)胞、周圍血、骨髓、胸腹水或其他滲出液。如為貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)先用橡皮刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)管壁上輕輕刮下，或用酶消化，使細(xì)胞脫離管壁，然后按以上方法固定。有離心法和懸浮制備法。3.原位固定法：在組織表面滴固定液或注射固定液的方法。4．灌注固定法：即通過血管將固定液灌注到所要固定的組織中。通常采用的固定劑為2%～4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液?；瘜W(xué)固定方式分：27醫(yī)學(xué)ppt1．組織塊固定：適用活組織檢查，如腎、肝、胃腸道等等。常規(guī)采常用固定劑的性質(zhì)1．四氧化鋨(osmiumtetroxide，OsO4):四氧化鋨又名鋨酸，是強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，因而對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。固定的時(shí)間一般為1小時(shí)左右,其蒸氣對(duì)皮膚、呼吸道粘膜及眼睛角膜有傷害作用。注意通風(fēng)和避光。

28醫(yī)學(xué)ppt常用固定劑的性質(zhì)1．四氧化鋨(osmiumtetrox2．戊二醛(glutaraldehydeC5H8O2)

戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，還能保存某些酶的活力，長時(shí)間的固定(幾周甚至1～2個(gè)月)不會(huì)使組織變脆。缺點(diǎn)是不能保存脂肪，沒有電子染色作用，對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差。另外還有10%福爾馬林、5%高錳酸鉀等。29醫(yī)學(xué)ppt2．戊二醛(glutaraldehydeC5H8O2)

3）漂洗

組織塊固定后，必須徹底洗凈固定液的殘余。在戊二醛—鋨酸雙重固定的組織塊，力求將戊二醛洗凈后浸入鋨酸液中，防止二者起化學(xué)反應(yīng)而降低固定效果。常用漂洗液為0.1M的磷酸緩沖液（PBS）。30醫(yī)學(xué)ppt3）漂洗

組織塊固定后，必須徹底洗凈固定液的殘余。在戊二醛—4）塊染

就是對(duì)組織塊進(jìn)行整塊染色。一般在脫水前用1%醋酸雙氧鈾染色，時(shí)間為1—2小時(shí)。31醫(yī)學(xué)ppt4）塊染

就是對(duì)組織塊進(jìn)行整塊染色。一般在脫水前用1%醋酸雙

5）脫水

為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必須事先將組織內(nèi)的水分驅(qū)除干凈，即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。急驟的脫水會(huì)引起細(xì)胞的收縮，因此，脫水應(yīng)梯度進(jìn)行：70%丙酮15分鐘，80%丙酮15分鐘，90%丙酮15分鐘，100%丙酮１0分鐘(二次)。32醫(yī)學(xué)ppt5）脫水為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必6）浸泡與包埋浸泡：使某種適宜的液體介質(zhì)（包埋劑）滲入組織塊取代脫水劑。包埋：使浸入的介質(zhì)經(jīng)高溫處理后聚合為堅(jiān)固體，利于超薄切片。常用包埋劑：Epon-812環(huán)氧樹脂、DDSA、MNA以及加速劑DMP-30等。（高溫處理）液體————固體

33醫(yī)學(xué)ppt6）浸泡與包埋33醫(yī)學(xué)ppt包埋劑的理想性質(zhì)理想的包埋劑應(yīng)具有以下性質(zhì)：(1)．粘度低，容易滲入組織；(2)．聚合均勻而充分，聚合前后體積變化小；(3)．有良好的切割性能；(4)．能耐受電子束轟擊，高溫下不變形；(5)．對(duì)細(xì)胞成分抽提少，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好；(6)．在電鏡的高倍放大下，本身不顯示任何結(jié)構(gòu)；(7)．材料來源豐富、易得，價(jià)格低廉，對(duì)人體無害。34醫(yī)學(xué)ppt包埋劑的理想性質(zhì)理想的包埋劑應(yīng)具有以下性質(zhì)：34醫(yī)學(xué)ppt透射電鏡樣品制備操作流程：取材——漂洗（生理鹽水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小時(shí)以上）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——后固定(1%鋨酸1小時(shí)左右）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——塊染（1%醋酸鈾2小時(shí)）——梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分鐘，100%2次，各10分鐘）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37oC烘箱2小時(shí)；丙酮：包埋液=1：4，37oC烘箱過夜；純包埋液45oC烘箱2小時(shí)）——包埋聚合（45oC烘箱3小時(shí)，65oC烘箱48小時(shí)）35醫(yī)學(xué)ppt透射電鏡樣品制備操作流程：35醫(yī)學(xué)ppt常用包埋劑1．環(huán)氧樹脂Epon812:為進(jìn)口分裝，聚合前后體積變化小(收縮率為2%～5%)，切片在電子束照射下穩(wěn)定，能較好地保存細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。但操作條件要求較嚴(yán)格，如組織塊脫水要徹底，包埋時(shí)要注意防潮及防止氣泡產(chǎn)生，聚合時(shí)溫度要控制好等。通常與硬化劑MNA、增塑劑DDSA以及加速劑DMP-30混合使用。2、環(huán)氧樹脂Epon618：國產(chǎn)，效果不如前者。36醫(yī)學(xué)ppt常用包埋劑1．環(huán)氧樹脂Epon812:為進(jìn)口分裝，聚合前超薄切片

1、切片前的準(zhǔn)備：銅網(wǎng)清洗，用丙酮和乙醇浸洗2、支持膜制備：常用Formvar膜聚乙烯醇縮甲醛），由氯仿配置，濃度為0.5%。3、玻璃刀制備：專用制刀機(jī)制作。4、半薄切片光鏡定位。5、修塊技術(shù)。6、超薄切片厚度在50—80nm之間較為合適，干涉色為金黃色為宜。7、撈片：常用粘撈法和圈撈法。37醫(yī)學(xué)ppt超薄切片37醫(yī)學(xué)ppt超薄切片機(jī)分兩類：一類是機(jī)械推進(jìn)式切片機(jī)，用微動(dòng)螺旋和微動(dòng)杠桿來提供微小推進(jìn)；另一類是熱脹冷縮式切片機(jī)，利用金屬桿熱脹或冷縮時(shí)產(chǎn)生的微小長度變化來提供推進(jìn)。38醫(yī)學(xué)ppt超薄切片機(jī)分兩類：一類是機(jī)械推進(jìn)式切片機(jī)，用微

切片染色：生物材料是由氫、碳、氮、氧、磷等具有很小原子序數(shù)的物質(zhì)組成，這些物質(zhì)對(duì)電子透射能力和散射能力基本一樣，這樣所產(chǎn)生圖象的反差是很弱的。采用重金屬處理以增強(qiáng)反差、提高分辯率。由于被染色標(biāo)本的不同結(jié)構(gòu)成份對(duì)重金屬的結(jié)合量不同，染色處理后重金屬密度高的部分因散射掉的電子較多，在熒光屏上觀察顏色也就較深，這樣可獲得反差對(duì)比良好的圖象。常用的重金屬為鉛和鈾。

39醫(yī)學(xué)ppt切片染色：39醫(yī)學(xué)ppt電鏡觀察、拍片、記錄等。首先，觀察人員要熟悉電鏡的基本操作程序以及所要觀察材料的相關(guān)知識(shí)。其次，做好觀察記錄，選好范圍拍片，準(zhǔn)確記錄底片號(hào)碼及相應(yīng)內(nèi)容。最后，做好各種資料的整理、備案工作。40醫(yī)學(xué)ppt電鏡觀察、拍片、記錄等。首先，觀察人員要熟悉電鏡的基本操作掃描電鏡樣品制備流程：

取材（做好樣品觀察面的標(biāo)志）——漂洗（生理鹽水或緩沖液）——固定（2.5%戊二醛2小時(shí)以上）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——后固定（1%鋨酸，2小時(shí)）——脫水（50%、70%、80%、90%、95%各15分鐘，換醋酸異戊酯15分鐘或叔丁醇15分鐘）——干燥（零界點(diǎn)干燥或冷凍干燥）——鍍膜（真空鍍膜儀或離子濺射儀）41醫(yī)學(xué)ppt掃描電鏡樣品制備流程：

取材（做好樣品觀察面的標(biāo)志）——漂

負(fù)染技術(shù)的原理：觀察顆粒狀生物材料的外部形狀常用的染色方法。用重金屬鹽沉積到樣品四周，樣品四周散射電子的能力就較強(qiáng)，因而表現(xiàn)為暗區(qū)；樣品本身散射電子的能力較弱，則表現(xiàn)為亮區(qū)，這樣便能把樣品的外形與表面結(jié)構(gòu)清楚地襯托出來。42醫(yī)學(xué)ppt負(fù)染技術(shù)的原理：42醫(yī)學(xué)ppt標(biāo)本回顧性研究——石蠟塊做超薄切片技術(shù)1、取材：用鋒利刀片從石蠟塊上切下1mm左右的厚片，對(duì)照HE切片在切下的厚片上選取所需部位，切成1mm3的小塊。2、溶蠟：二甲苯浸泡8—12h，使石蠟完全溶解，期間換2次新二甲苯。3、水化：用100%、90%、80%、70%、50%乙醇進(jìn)行水化，直到完全水化。4、漂洗：用緩沖液漂洗（0.1M磷酸緩沖液或二甲砷酸鈉緩沖液)后，1%鋨酸后固定1—2h。5、脫水：50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水。6、浸泡包埋同常規(guī)方法。43醫(yī)學(xué)ppt標(biāo)本回顧性研究——43醫(yī)學(xué)ppt此課件下載可自行編輯修改，供參考！感謝您的支持，我們努力做得更好！此課件下載可自行編輯修改，供參考！

電子顯微鏡室簡介我室的電鏡型號(hào)和性能如下：H-600A型透射電鏡，購于1989年，最大點(diǎn)分辨率為0.36nm,有效放大倍數(shù)達(dá)30萬倍。H-7500型透射電鏡，購于2004年，最大點(diǎn)分辨率為0.24nm,有效放大倍數(shù)達(dá)60萬倍。S-3000N型掃描電鏡，購于2004年，有效放大倍數(shù)達(dá)30萬倍。45醫(yī)學(xué)ppt電子顯微鏡室簡介1醫(yī)學(xué)ppt

1924年，法國物理學(xué)家Broglie提出了“電子與光一樣，具有波動(dòng)性“的假說，并計(jì)算出電磁波長為0.005nm.1926年，德國科學(xué)家Busch發(fā)現(xiàn)了帶電粒子在電場或磁場中偏轉(zhuǎn)聚焦的現(xiàn)象，類似于光線通過透鏡可被聚焦一樣。1928—1931年間，德國年輕的大學(xué)生Ruska測量了磁透鏡的聚焦特性，并開展了電子放大成像的研究，終于在1938年成功研制了世界上第一臺(tái)真正的電子顯微鏡，放大倍數(shù)為1200倍，被譽(yù)為電子顯微鏡之父。，并在1986年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。20世紀(jì)50年代初到60年代末期，電鏡發(fā)展很快，從性能到構(gòu)造都得到很大的改進(jìn)，特別是分辨本領(lǐng)得到大幅度提高，達(dá)到1nm左右，到80年代的點(diǎn)分辨率已接近0.1nm，最新研制的超高壓透射電鏡的點(diǎn)分辨率可達(dá)0.005nm。電鏡的發(fā)展歷程46醫(yī)學(xué)ppt1924年，法國物理學(xué)家Broglie提電鏡的基本類型：

1、透射電子顯微鏡

2、掃描電子顯微鏡

3、分析電子顯微鏡

4、超高壓電子顯微鏡

5、掃描探針顯微鏡

（掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡、掃描光子顯微鏡等）47醫(yī)學(xué)ppt電鏡的基本類型：

1、透射電子顯微鏡

2、掃描電子顯微鏡

3

一、電子顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)

光的衍射現(xiàn)象：

由于光具有波動(dòng)性，當(dāng)光線通過小孔或小孔光源經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成象會(huì)產(chǎn)生衍射。其圖案是:中央部分一個(gè)亮斑，在其周圍有明暗交替的園環(huán)。2D

D=48醫(yī)學(xué)ppt

可以這么說，顯微鏡分辯本領(lǐng)是由其產(chǎn)生的衍射圖中央亮斑半徑D（分辨能力）而定：

阿貝公式：

D=

當(dāng)光的波長為λ=500nm=0.5μm

介質(zhì)折射率N（油）=1.5

物體與物鏡所形成夾角的半數(shù)α<90o中央亮斑的半徑D=200nm=0.2μm

49醫(yī)學(xué)ppt可以這么說，顯微鏡分辯本領(lǐng)是由其產(chǎn)生的衍射圖中分辨本領(lǐng)測算：1、人眼在明視距離250mm處能分辨0.2mm的兩點(diǎn)。

油鏡最小能分辨0.2μm的兩點(diǎn)。

則油鏡理論最大放大能力為：0.2mm/0.2μm=10002、假如一臺(tái)電鏡的點(diǎn)分辨率為0.1nm,則其理論放大倍數(shù)為：0.2mm/0.1nm=2x1063、H-7500型透射電鏡的點(diǎn)分辨率為0.24nm,則其理論放大倍數(shù)為：0.2mm/0.24nm=0.83x106。而其有效放大倍數(shù)為0.6x10650醫(yī)學(xué)ppt分辨本領(lǐng)測算：1、人眼在明視距離250mm處能分辨0.2m瑞利準(zhǔn)則

光線通過二個(gè)比較靠近的小孔時(shí)，這二個(gè)小孔的衍射圖會(huì)重疊在一起。當(dāng)一個(gè)衍射圖的中央亮斑正好落在另一個(gè)衍射圖的第一暗環(huán)中心時(shí)，這二個(gè)點(diǎn)剛可以分辯。這就是顯微鏡分辯本領(lǐng)的瑞利準(zhǔn)則。51醫(yī)學(xué)ppt瑞利準(zhǔn)則光線通過二個(gè)比較靠近的小孔時(shí)，這二個(gè)運(yùn)動(dòng)著的電子所產(chǎn)生電磁波長為：

λ=(nm)如V=50000v

則λ=0.005nm=0.000005μm

是光的λ=500nm的10萬分之一，大大減少了衍射光斑D的值。52醫(yī)學(xué)ppt運(yùn)動(dòng)著的電子所產(chǎn)生電磁波長為：

光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡在工作原理上的比較：

光學(xué)顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對(duì)光進(jìn)行折射，將一物點(diǎn)發(fā)出不同角度的光線最終會(huì)聚成一個(gè)像點(diǎn)。

電子顯微鏡是利用電場或磁場折射電子束，達(dá)到成像目的。

53醫(yī)學(xué)ppt光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡在工作原理上的比較：9醫(yī)光源聚光鏡樣品物鏡投影鏡最終象透射電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡54醫(yī)學(xué)ppt光源透射電子顯微鏡

鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖：

1)照明系統(tǒng)：電子槍聚光鏡2）樣品室3）成象系統(tǒng)：物鏡中間鏡投影鏡4）觀察記錄系統(tǒng)：觀察室照相機(jī)

55醫(yī)學(xué)ppt鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖：11醫(yī)學(xué)ppt一、電子顯微鏡的照明系統(tǒng)1、電子槍一般安裝在鏡筒的頂端，是一個(gè)由陰極、柵極和陽極三個(gè)部分組成的結(jié)構(gòu)。大多數(shù)陰極為熱陰極。燈絲為鎢燈絲，呈V形，尖端向下，其余兩端連接電源。2、聚光鏡由鐵殼包裹的線圈構(gòu)成，通入電流后乃形成電磁場，使由電子槍發(fā)出的電子束進(jìn)一步密集聚攏，以增強(qiáng)其照明效果。聚光鏡的中央位置裝有極靴，其作用是籍以增強(qiáng)磁場強(qiáng)度，而磁場強(qiáng)度可通過改變所加電流大小來調(diào)節(jié)，以達(dá)到根據(jù)需要調(diào)節(jié)放大倍率和對(duì)所形成圖象進(jìn)行聚焦的目的。一般電鏡都設(shè)有二級(jí)聚光鏡。56醫(yī)學(xué)ppt一、電子顯微鏡的照明系統(tǒng)12醫(yī)學(xué)ppt二、電子顯微鏡的成像系統(tǒng)1、物鏡由鐵殼包裹的線圈組成，是電鏡成像系統(tǒng)的關(guān)鍵性部件。在物鏡中心位置同樣裝有精密度極高的極靴，以及要求很高的肖像散部件，以盡量消除成像過程中難以完全避免的像散現(xiàn)象，保證成像的清晰度。在物鏡的后焦面裝有可動(dòng)光闌片，可根據(jù)具體情況來調(diào)整光闌孔的大小。2、中間鏡也是由鐵殼包裹的線圈組成，位于物鏡和投影鏡之間，作用是將物鏡所成的放大像進(jìn)一步放大。目前高檔的電鏡可設(shè)有三極中間鏡。3、投影鏡也是由鐵殼包裹的線圈組成，作用是將以上成像進(jìn)一步放大并投影于熒光屏上，激發(fā)熒光，形成影象。57醫(yī)學(xué)ppt二、電子顯微鏡的成像系統(tǒng)13醫(yī)學(xué)ppt三、觀察記錄系統(tǒng)1、熒光屏為圓形平面結(jié)構(gòu)，上面涂以熒光粉，當(dāng)高速電子撞擊其表面時(shí)，便激發(fā)出熒光，從而使觀察者能通過含鉛玻璃窗口直接看到影象。2、照相室在熒光屏的下邊，裝有電鏡軟片，通過電子束直接轟擊軟片表面而使軟片爆光，從而使觀察影象以底片或照片的形式保存下來。58醫(yī)學(xué)ppt三、觀察記錄系統(tǒng)14醫(yī)學(xué)ppt四、真空系統(tǒng)

由低真空和高真空兩極真空泵構(gòu)成。前者稱為機(jī)械泵，排氣氣壓達(dá)0.01mmHg;后者稱為擴(kuò)散泵，排氣氣壓可達(dá)0.0001mmHg以下。真空系統(tǒng)的作用是使鏡筒內(nèi)部獲得高真空。如果鏡筒內(nèi)真空度較差，將會(huì):1）氣體分子與高速電子相互作用，隨機(jī)地散射電子，降低象的反差。2）電子槍中存在殘余氣體，會(huì)產(chǎn)生電離和放電，引起電子束發(fā)射不穩(wěn)定。3）殘余產(chǎn)體與白燈絲發(fā)生作用，降低燈絲壽命。4）殘余產(chǎn)體在樣品周圍會(huì)污染樣品。59醫(yī)學(xué)ppt四、真空系統(tǒng)15醫(yī)學(xué)ppt

五、供電系統(tǒng)它是由以下三個(gè)部分組成1）高壓電源：使電子獲得一定的速度。通常電壓為25KV、50KV、75KV和100KV。2）磁透鏡激勵(lì)磁電源：它提供了磁透鏡所必需的電源，從而使磁透鏡周圍有一個(gè)特定形狀的磁場。3）輔助電源：例如真空系統(tǒng)控制電源、調(diào)焦和嚗光裝置、照相機(jī)自動(dòng)控制和記數(shù)電路等等。60醫(yī)學(xué)ppt五、供電系統(tǒng)16醫(yī)學(xué)ppt六、輔助系統(tǒng)1）水冷系統(tǒng)：是用水冷卻油擴(kuò)散泵、磁透鏡的線圈等，保證設(shè)備正常工作。2）氣動(dòng)系統(tǒng)：采用壓縮空氣作為動(dòng)力，將各種閥門按程序要求打開或關(guān)閉，完成所須任務(wù)。61醫(yī)學(xué)ppt六、輔助系統(tǒng)17醫(yī)學(xué)ppt透射與掃描電鏡原理圖解62醫(yī)學(xué)ppt透射與掃描電鏡原理圖解18醫(yī)學(xué)ppt掃描電子顯微鏡工作原理

就是通過極細(xì)的電子束掃描標(biāo)本表面而激發(fā)出二次電子，并被接收到陰極射線管而成像。

掃描電鏡由兩個(gè)主要部分組成：

探查系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)

63醫(yī)學(xué)ppt掃描電子顯微鏡工作原理

就是通過極細(xì)的電子束一、探查系統(tǒng)：由電子槍、電磁透鏡組成。

電子槍發(fā)射電子束（加速電壓在1—50KV），經(jīng)過電磁透鏡的作用，射擊標(biāo)本表面，使之產(chǎn)生二次電子。二、顯示系統(tǒng)：電子檢測器，閃爍器、光電倍增器以及顯示屏組成。

由電子束激發(fā)的二次電子被位于檢測器前端的柵極所吸引，并被強(qiáng)正電場加速飛向閃爍器。當(dāng)電子擊中閃爍器時(shí)，后者乃產(chǎn)生光子，光子沿導(dǎo)光管引向光電倍增器，并在此產(chǎn)生光電子，此信號(hào)經(jīng)放大后被傳輸?shù)疥帢O射線管（顯示屏），從而在此成像。64醫(yī)學(xué)ppt一、探查系統(tǒng)：由電子槍、電磁透鏡組成。20醫(yī)學(xué)ppt透射電子顯微鏡拍攝的照片掃描電子顯微鏡拍攝的照片65醫(yī)學(xué)ppt透射電子顯微鏡拍攝的照片掃描電子顯微鏡拍攝的照片21醫(yī)學(xué)pp

電子束的穿透能力一般較弱，大多數(shù)標(biāo)本無法直接在電鏡下觀察，必須把樣品切成厚度為10—1000nm的薄片。這種切片稱為超薄切片，是電鏡觀察生物樣品常用方法之一。(1)

超薄切片技術(shù)二、透射電子顯微鏡樣品制備66醫(yī)學(xué)ppt電子束的穿透能力一般較弱，大多數(shù)標(biāo)本無法直接

1）取材取材的要點(diǎn)是快、小、冷、準(zhǔn)，組織要新鮮?？欤喝〔臅r(shí)間在1—2分鐘以內(nèi)完成；?。后w積大小在1立方毫米左右或橫切面為1平方毫米的長條形；冷：固定液溫度在4攝氏度左右。準(zhǔn)：取材部位要準(zhǔn)確，盡量取材于所要觀察的部位。67醫(yī)學(xué)ppt1）取材23醫(yī)學(xué)ppt取材方法：

1、器官組織取材法：主要針對(duì)活體器官組織的取材如腎、肝、肺等活檢組織。

2、游離細(xì)胞收集法：主要針對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞及游離細(xì)胞如血細(xì)胞、脫落細(xì)胞等。常用方法有血漿凝集法和瓊脂預(yù)包埋法。

68醫(yī)學(xué)ppt取材方法：

1、器官組織取材法：主要針對(duì)活體器官組織的取材雙刀拉鋸法69醫(yī)學(xué)ppt雙刀拉鋸法25醫(yī)學(xué)ppt2）固定

固定的目的是被研究的材料盡量保持生活狀態(tài)時(shí)的組織結(jié)構(gòu)，避免因缺血缺氧所帶來的“死后變化”。

固定方法分物理固定法和化學(xué)固定法

1、物理固定法：微波快速高溫、冷凍或干燥

2、化學(xué)固定法：使用化學(xué)試劑-固定劑

3、常用固定劑：2.5%戊二醛、1%鋨酸、

5%高錳酸鉀、10%福爾馬林、等。70醫(yī)學(xué)ppt2）固定

固定的目的是被研1．組織塊固定：適用活組織檢查，如腎、肝、胃腸道等等。常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。2．游離細(xì)胞的固定：適用于培養(yǎng)細(xì)胞、周圍血、骨髓、胸腹水或其他滲出液。如為貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)先用橡皮刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)管壁上輕輕刮下，或用酶消化，使細(xì)胞脫離管壁，然后按以上方法固定。有離心法和懸浮制備法。3.原位固定法：在組織表面滴固定液或注射固定液的方法。4．灌注固定法：即通過血管將固定液灌注到所要固定的組織中。通常采用的固定劑為2%～4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液?；瘜W(xué)固定方式分：71醫(yī)學(xué)ppt1．組織塊固定：適用活組織檢查，如腎、肝、胃腸道等等。常規(guī)采常用固定劑的性質(zhì)1．四氧化鋨(osmiumtetroxide，OsO4):四氧化鋨又名鋨酸，是強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，因而對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。固定的時(shí)間一般為1小時(shí)左右,其蒸氣對(duì)皮膚、呼吸道粘膜及眼睛角膜有傷害作用。注意通風(fēng)和避光。

72醫(yī)學(xué)ppt常用固定劑的性質(zhì)1．四氧化鋨(osmiumtetrox2．戊二醛(glutaraldehydeC5H8O2)

戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，還能保存某些酶的活力，長時(shí)間的固定(幾周甚至1～2個(gè)月)不會(huì)使組織變脆。缺點(diǎn)是不能保存脂肪，沒有電子染色作用，對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差。另外還有10%福爾馬林、5%高錳酸鉀等。73醫(yī)學(xué)ppt2．戊二醛(glutaraldehydeC5H8O2)

3）漂洗

組織塊固定后，必須徹底洗凈固定液的殘余。在戊二醛—鋨酸雙重固定的組織塊，力求將戊二醛洗凈后浸入鋨酸液中，防止二者起化學(xué)反應(yīng)而降低固定效果。常用漂洗液為0.1M的磷酸緩沖液（PBS）。74醫(yī)學(xué)ppt3）漂洗

組織塊固定后，必須徹底洗凈固定液的殘余。在戊二醛—4）塊染

就是對(duì)組織塊進(jìn)行整塊染色。一般在脫水前用1%醋酸雙氧鈾染色，時(shí)間為1—2小時(shí)。75醫(yī)學(xué)ppt4）塊染

就是對(duì)組織塊進(jìn)行整塊染色。一般在脫水前用1%醋酸雙

5）脫水

為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必須事先將組織內(nèi)的水分驅(qū)除干凈，即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。急驟的脫水會(huì)引起細(xì)胞的收縮，因此，脫水應(yīng)梯度進(jìn)行：70%丙酮15分鐘，80%丙酮15分鐘，90%丙酮15分鐘，100%丙酮１0分鐘(二次)。76醫(yī)學(xué)ppt5）脫水為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必6）浸泡與包埋浸泡：使某種適宜的液體介質(zhì)（包埋劑）滲入組織塊取代脫水劑。包埋：使浸入的介質(zhì)經(jīng)高溫處理后聚合為堅(jiān)固體，利于超薄切片。常用包埋劑：Epon-812環(huán)氧樹脂、DDSA、MNA以及加速劑DMP-30等。（高溫處理）液體————固體

77醫(yī)學(xué)ppt6）浸泡與包埋33醫(yī)學(xué)ppt包埋劑的理想性質(zhì)理想的包埋劑應(yīng)具有以下性質(zhì)：(1)．粘度低，容易滲入組織；(2)．聚合均勻而充分，聚合前后體積變化?。?3)．有良好的切割性能；(4)．能耐受電子束轟擊，高溫下不變形；(5)．對(duì)細(xì)胞成分抽提少，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好；(6)．在電鏡的高倍放大下，本身不顯示任何結(jié)構(gòu)；(7)．材料來源豐富、易得，價(jià)格低廉，對(duì)人體無害。78醫(yī)學(xué)ppt包埋劑的理想性質(zhì)理想的包埋劑應(yīng)具有以下性質(zhì)：34醫(yī)學(xué)ppt透射電鏡樣品制備操作流程：取材——漂洗（生理鹽水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小時(shí)以上）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——后固定(1%鋨酸1小時(shí)左右）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——塊染（1%醋酸鈾2小時(shí)）——梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分鐘，100%2次，各10分鐘）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37oC烘箱2小時(shí)；丙酮：包埋液=1：4，37oC烘箱過夜；純包埋液45oC烘箱2小時(shí)）——包埋聚合（45oC烘箱3小時(shí)，65oC烘箱48小時(shí)）79醫(yī)學(xué)ppt透射電鏡樣品制備操作流程：35醫(yī)學(xué)ppt常用包埋劑1．環(huán)氧樹脂Epon812:為進(jìn)口分裝，聚合前后體積變化小(收縮率為2%～5%)，切片在電子