基因工程工具酶(同名324)課件

基因工程

GeneEngineering彭銀祥等編著華中科技大學出版社2008年2月第二次印刷第3章基因工程工具酶ToolEnzymesinGeneEngineering高等學校生物工程、生物科學及生物技術專業(yè)教材1基因工程

GeneEngineering彭銀祥等編著華中科基因工程的四大要素工具酶toolenzymes目的基因interestedgene載體vector受體細胞receiptcells2基因工程的四大要素2重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①合成雙鏈cDNA分子或片段連接；②缺口平移制作高比活探針；③DNA序列分析；④填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進行填補，標記等多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基TaqDNA聚合酶PCR合成DNA片段3重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功基因工程實驗中常用的工具酶內切酶連接酶聚合酶修飾酶多核苷酸激酶末端轉移酶核酸外切酶IIIλ核酸外切酶堿性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶4基因工程實驗中常用的工具酶內切酶多核苷酸激酶43.1限制性內切酶3.1.1細菌的限制-修飾系統(tǒng)（R-M系統(tǒng)）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGMeMeRestrictionModificationREcoRIMEcoRI限制與修飾系統(tǒng)的生物學意義1保護自身DNA不被降解；2破壞外源DNA，防止DNA的轉化，保證物種的遺傳穩(wěn)定性。53.1限制性內切酶3.1.1細菌的限制-修飾系統(tǒng)（R-第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶3.1.2限制內切酶的命名EcoRI：EscherichiacoliRIHindIII：Haemophilus

influensaedIIISacI：Streptomyces

achromagenesI6第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；命名HindⅢ3.1.3限制性內切酶分類限制修飾系統(tǒng)的種類

（a）I型：由三個基因構成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因產(chǎn)物構成一個復合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。（b）II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用。（c）III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產(chǎn)物結合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。73.1.3限制性內切酶分類限制修飾系統(tǒng)的種類7核酸限制性內切酶的類型及主要特性特性I類內切酶II類內切酶III類內切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內切酶的蛋白結構3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG8核酸限制性內切酶的類型及主要特性特性I類內切酶II類內切酶I切割位點在距離識別位點至少1000bp處隨機切開一條單鏈。位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3‘端24—26bp處酶催轉換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用9切割位點在距離識別位點至少1000位于寄主特異性位點或其附近I型限制性內切核酸酶有其特定的DNA識別序列，但酶在DNA上的切割位置遠離其識別位置，有的酶可在同識別序列相距1000bp的位置上隨機切割。l型限制酶對體外重組DNA實驗沒有多少用處。III型限制性內切核酸酶在DNA上有其特定的識別序列，其酶切位置在識別序列3‘端之外相距約20個堿基對處，可以產(chǎn)生各種類型的單鏈末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。II限制性內切核酸酶在DNA上有其特定的識別序列即，回文結構，通常為4-8bp，在特定識別位點處切割DNA。是基因工程中主要使用的酶類。10I型限制性內切核酸酶有其特定的DNA識別序列，但酶在DNA上限制酶特點：1.識別４-8個相連的核苷酸，以6個多見；3.1.4限制性內切酶的識別序列

BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’NotI5’-GCGGCCGC-3’

3’-CGCCGGCG-5’2.呈回文結構(palindrome)；3.旋轉對稱性；EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

4.切點大多數(shù)在識別順序之內，也有例外。FokI5’-GGATGNN

-3’3’-CCTAC

NN-5’外側，產(chǎn)生3’-端突起5.識別序列嚴格，少數(shù)有變動，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。11限制酶特點：3.1.4限制性內切酶的識別序列BamHI3.1.5限制性內切酶的切割方式內切酶切割后產(chǎn)生的三種末端a)5’突出的粘性末端如,EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’b)3’突出的粘性末端如,PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’c)平末端

如,SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’123.1.5限制性內切酶的切割方式內切酶切割后產(chǎn)生的三種末端同裂酶:能識別相同序列，切割位點可以相同也可以不同，來源不同的酶。（1）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’3.1.6同列裂酶和同尾酶13同裂酶:能識別相同序列，切割位點可以相同也可以不同，來源不同XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：Asp718I5’-G

GTACC-3’3’-CCATG

G-5’KpnI5’-GGTAC

C-3’3’-C

CATGG-5’14XmaI5’-CCCGGG-3’識別位點相同尾酶(Isocaudamers):識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（2）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。15同尾酶(Isocaudamers):識別的序列不同，5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ

5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A165’-GATC----3’Sau3A同尾酶的粘性末端互相同裂酶

（Isoschizomers）EnzymeSequenceIsoschizomersAcc65IGGTACCCCATGGAsp718I,KpnIAhaIIITTTAAA

AAATTTDraIBstMAICTGCAGGACGTCPstIEcoRIGAATTCCTTAAGFunIINdeICATATGGTATACFauNDINheIGCTAGCCGATCGAsuNHI,BmtINotIGCGGCCGCCGCCGGCGCciNISmaICCCGGGGGGCCCCfr9I,PspAI,XmaI,XmaCIRestrictionendonucleasesthatrecognizethesamesequenceareisoschizomers.17同裂酶（Isoschizomers）EnzymeSeq同尾酶

（

Isocaudamers

）EnzymeSequenceIsoschizomersBamHI5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’BclI,BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BamHI,BglIIBglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI,BamHIPstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-3’NsiI,5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-3’NsiI5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-5’PstIRestrictionendonucleasesthatrecognizethedifferenttargetsequenceandcutdownthesamesequencesstickyendsareisocaudamers.18同尾酶（Isocaudamers）EnzymeSequ3.1.7限制性內切酶識別序列出現(xiàn)的幾率及酶切片段的估算193.1.7限制性內切酶識別序列出現(xiàn)的幾率及酶切片段的估DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1.DNA的純度3.1.8

影響限制性內切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量③延長保溫時間④擴大反應體積（>20l）一般采取20DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。21大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質粒：2.DNA的甲基化程度對不完全消化具有一定的影響3.DNA的分子結構DNA的分子結構有三種超螺旋結構、線性結構、單鏈開環(huán)結構22對不完全消化具有一定的影響3.DNA的分子結構D是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。23是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045255.酶切消化反應的時間和溫度

24不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少限制性內切酶儲存在含50%的甘油緩沖液中，酶切時甘油的濃度不應超過1/10體積。否則對酶活性有抑制作用。6.反應體積和甘油濃度質粒酶切鑒定通常設定反應體積為10-20μl,質粒酶切大量酶切通常設定反應體積為80-100μl。25限制性內切酶儲存在含50%的甘油緩沖液中，酶切時甘油的濃度不限制性內切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。7.星號（*）活性如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應緩沖液。星號（*）活性26限制性內切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pHEcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時候要特別注意！27EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活。或用乙醇沉淀DNA。3.1.9限制酶酶切反應的終止幾種常用限制酶識別位點28大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活。3.1.9限制酶酶切29293.2DNA連接酶（Ligase）

DNA連接酶能利用ATP或NAD+提供的能量催化多段DNA片段的3’-OH和5’-P基團之間形成3’，5’-磷酸二酯鍵，把兩個DNA片段連接在一起。OHPOHPHOPHOPPPOHHO連接酶303.2DNA連接酶（Ligase）DN1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用機制及特點2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi311.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用機4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP324.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的5.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。335.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出A（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。3.2.2DNA連接酶的分類34（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件35（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH連接酶反應的最佳溫度是37C。3.連接反應的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結合很不穩(wěn)定。2.實用溫度所以一般采用4~16C。36連接酶反應的最佳溫度是37C。3.連接反應的溫度1.最增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應溫度4.影響連接反應的因素10~20倍。一般12~16℃37增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.3.3DNA聚合酶（Polymerase）基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉錄酶383.3DNA聚合酶（Polymerase）基因工程中常1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。391.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較40DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率3.3.1DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質①一條單鏈多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。413.3.1DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的D①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’-OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應條件-OH5’3’dNTPs42①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針標記已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列雜交43①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’3’44標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片③

DNA聚合酶I對探針序列的標記切口轉移法(nicktranslation)：放射性同位素標記：DNA聚合酶I同時具備5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。45③DNA聚合酶I對探針序列的標記切口轉移法(nickt5’3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5’端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3’一側補上一個新的核苷酸。切口5’5’3’3’5’3’5’3’465’3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5’端除去一個純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈切口DNAPolI進行切口轉移一種-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記47純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈切口DNAPol3.3.2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenow片段的性質DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶483.3.2.Klenowfragment具有5’3’聚①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補平限制性內切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途49①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h503’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物51③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉錄cDNA（1）T4DNA聚合酶的性質3.3.3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性52（1）T4DNA聚合酶的性質3.3.3.T4DNA聚③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。53③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’5’外切5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’545’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTP（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。①補平隱蔽末端②DNA3’末端標記55（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內切酶切無dNTPs56酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPs3.3.4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。573.3.4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一但與模板結合就會不間斷地合成互補鏈。②3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結構的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結構的阻礙58（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一但與模板結②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。59②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測序雙脫氧法。②標記DNA3’隱蔽末端③更有效地補平末端60修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去3.3.5.反轉錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質由和兩條多肽鏈組成。613.3.5.反轉錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤?、冁溣蟹崔D錄活性和RNaseH活性。RNaseH：鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以5’3’或3’5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA62①鏈有反轉錄活性和RNaseH活性。RNaseH：RN（3）逆轉錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA63（3）逆轉錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3②合成DNA探針用隨機引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機引物：隨機順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結合）③RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉錄出cDNA第一鏈。64②合成DNA探針用隨機引物（randomprimer）或1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。具有抗熱性。（1）細菌性堿性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase，BAP（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。SDS中加熱68oC可完全失活。3.4其他DNA修飾酶3.4.1堿性磷酸酶651.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。（1）細菌性堿性磷2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接662.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’67單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTHindA-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。68A-OHHO-AGCTTOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個nick，但轉入細菌后會被修復。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA69AAGCTTAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。1、單鏈DNA外切酶1)大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’3’外切識別5’-OH2)大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’、3’5’外切識別3’-OH、5’-P3.4.2核酸外切酶（Exonucleases）70是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。1、單鏈DN2、雙鏈DNA外切酶1)核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’外切識別3’-OH主要用途：在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。5’5’5’5’exoⅢ與klenow配合進行3’端標記-OHHO-712、雙鏈DNA外切酶1)核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’52.核酸外切酶（

exo）5’3’外切。主要用途：使DNA雙鏈變成單鏈（短）。5’P--P5’5’5’

exo成為測序模板。識別5’-P（但不能降解5’-OH）722.核酸外切酶（exo）5’3’外切。主要用途：使3.T7基因6核酸外切酶5’3’外切。用途與

exo一樣。既能識別5’-P，又能識別5’-OH。5’5’5’5’已被克隆到大腸桿菌中表達。733.T7基因6核酸外切酶5’3’外切。用途與exo一DNA外切酶切割方式識別位點單鏈大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’3’5’-OH大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’3’5’5’-P3’-OH雙鏈核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’3’-OH核酸外切酶（

exo）5’3’5’-PT7基因6核酸外切酶5’3’5’-P5’-OH74DNA外切酶切割方式識別位點單鏈大腸桿菌核酸外切酶I（exo1.來源稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）。2.特性（1）高度單鏈特異性（2）反應條件①低水平Zn2+②pH4.0~4.33.4.3S1核酸酶751.來源稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）。3.S1核酸內切酶的功能（1）催化單鏈RNA或DNA降解。（2）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)。S1S1發(fā)卡或有缺口的部位。763.S1核酸內切酶的功能（1）催化單鏈RNA或DNA降解。（4）不能降解雙鏈DNA或RNA-DNA雜交鏈ATGCATGCATGCTACGTACGTACGT甚至能識別單個核苷酸的單鏈區(qū)?。?）降解限制酶切形成的單鏈突出端。77（4）不能降解雙鏈DNA或RNA-DNA雜交鏈ATGCAT4.S1核酸酶的用途（1）定位RNADNARNAS1S1200bp400bp某限制酶切后再與RNA雜交某限制酶位點（參照物）內切酶位點不能位于內含子序列中！RNA784.S1核酸酶的用途（1）定位RNADNARNAS1S12RNA位于某限制酶位點左200bp和右400bp。RNA位置不能配對的內含子區(qū)域形成的單鏈環(huán)被S1切掉。mRNADNA（2）用mRNA測定基因中的外顯子序列79RNA位于某限制酶位點左200bp和右400bp。RNA位置Bal31核酸酶1.來源埃氏交替單胞菌（Alteromonoasespejiana）2.功能既有單鏈特異的DNA（RNA）內切酶；又有雙鏈特異的DNA外切酶。降解雙鏈DNA或其上的單鏈缺口、未配對的單鏈區(qū)域。80Bal31核酸酶1.來源埃氏交替單胞菌（Alteromo4.Bal31的用途定位測定DNA片斷中的限制酶位點分布。3.反應條件Mg2+、Ca2+EGTA（乙二醇雙四乙酸）專一性螯合Ca2+，可終止反應。EcoRIEcoRIBamHIHindIII814.Bal31的用途定位測定DNA片斷中的限制酶位點分布。與對照組（不用Bal31消化）只用相同的酶切的電泳比較。根據(jù)酶切片斷消失的先后順序，判斷這些片斷在原DNA中的位置。用Bal31消化線性DNA，并在不同的時間加入EGTA終止反應，再酶切電泳。Bal31控制消化法：82與對照組（不用Bal31消化）只用相同的酶切的電泳比較。用BEcoRIEcoRIBamHIHindIII分別用各個內切酶切后電泳，記錄片斷數(shù)目和大小。EcoRIBamHIHindIIIMarker83EcoRIEcoRIBamHIHindIII分別用各EcoRIEcoRIBamHIHindIIIEcoRIEcoRIBamHIHindIIIBal31分別用原內切酶切后電泳，判斷片斷數(shù)目和大小。HindIIIEcoRIBamHIMarker84EcoRIEcoRIBamHIHindIIIEcoR（a）特點：具內切酶活性，作用于ds-DNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活達最大值當酶濃度很低時，ds-DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置

（b）用途

切口平移（nicktranslation)，制備DNA探針

制備RNA樣品時除去DNA分子

基因突變時產(chǎn)生切口

3.4.4DNA酶85（a）特點：具內切酶活性，作用于ds-DNA，但無核苷酸序大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質合成系統(tǒng)中的RNA分子。RNase的識別（a）RNaseA分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100℃加熱15min仍具活性）,用于除去DNA樣品中的RNA分子。（b）RNaseH

作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去DNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。3.4.5RNA酶86大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣3.4.53.4.6T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化磷酸從ATP轉給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。873.4.6T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸帶有32P標記，就會被轉移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。885’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應（forwardreaction）89多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5（2）交換反應標記法反應混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應效果不理想。90（2）交換反應標記法反應混合物中具有超量(-32P)ATP3.4.7末端脫氧核苷酸轉移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個亞基。3.特性（1）5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）913.4.7末端脫氧核苷酸轉移酶1.來源小牛胸腺。2.②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉移酶92②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物4.末端轉移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉移酶934.末端轉移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體（2）再生酶切位點便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補平94（2）再生酶切位點便于回收克隆片斷。AAGCTT5’5’HiAAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAA末端轉移酶dTTPAAAAAA外源DNA95AAGCTAGCTTAAGCATTTAGCAAGCTTTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點HindⅢ位點連接96AAGCTTTTAGCTTAAAAAAHi3.5核酸探針的標記3.5.1探針探針：是一段帶有檢測標記的已知核酸序列，它能過與待檢測DNA序列特異性互補結合。

1DNA探針切口平移法，隨機引物法，末端轉移法，

PCR法等等。

2RNA探針

RNA聚合酶體外合成法973.5核酸探針的標記3.5.1探針973.5.2核酸標記物的選擇放射性同位素標記物

標記DNA探針

α-32p-dGTPγ-32p-dGTP

α-32p-GTP非放射性同位素標記物生物素，地高辛的標記物983.5.2核酸標記物的選擇放射性同位素標記物非放射性同位3.5.3探針的標記策略1.放射性同位素標記（1）切口平移法（2）末端標記法（3）隨機引物法2.非放射性同位素標記993.5.3探針的標記策略1.放射性同位素標記2.非放Thanks!100Thanks!100基因工程

GeneEngineering彭銀祥等編著華中科技大學出版社2008年2月第二次印刷第3章基因工程工具酶ToolEnzymesinGeneEngineering高等學校生物工程、生物科學及生物技術專業(yè)教材101基因工程

GeneEngineering彭銀祥等編著華中科基因工程的四大要素工具酶toolenzymes目的基因interestedgene載體vector受體細胞receiptcells102基因工程的四大要素2重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①合成雙鏈cDNA分子或片段連接；②缺口平移制作高比活探針；③DNA序列分析；④填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進行填補，標記等多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基TaqDNA聚合酶PCR合成DNA片段103重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功基因工程實驗中常用的工具酶內切酶連接酶聚合酶修飾酶多核苷酸激酶末端轉移酶核酸外切酶IIIλ核酸外切酶堿性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶104基因工程實驗中常用的工具酶內切酶多核苷酸激酶43.1限制性內切酶3.1.1細菌的限制-修飾系統(tǒng)（R-M系統(tǒng)）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGMeMeRestrictionModificationREcoRIMEcoRI限制與修飾系統(tǒng)的生物學意義1保護自身DNA不被降解；2破壞外源DNA，防止DNA的轉化，保證物種的遺傳穩(wěn)定性。1053.1限制性內切酶3.1.1細菌的限制-修飾系統(tǒng)（R-第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶3.1.2限制內切酶的命名EcoRI：EscherichiacoliRIHindIII：Haemophilus

influensaedIIISacI：Streptomyces

achromagenesI106第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；命名HindⅢ3.1.3限制性內切酶分類限制修飾系統(tǒng)的種類

（a）I型：由三個基因構成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因產(chǎn)物構成一個復合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。（b）II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用。（c）III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產(chǎn)物結合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。1073.1.3限制性內切酶分類限制修飾系統(tǒng)的種類7核酸限制性內切酶的類型及主要特性特性I類內切酶II類內切酶III類內切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內切酶的蛋白結構3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG108核酸限制性內切酶的類型及主要特性特性I類內切酶II類內切酶I切割位點在距離識別位點至少1000bp處隨機切開一條單鏈。位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3‘端24—26bp處酶催轉換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用109切割位點在距離識別位點至少1000位于寄主特異性位點或其附近I型限制性內切核酸酶有其特定的DNA識別序列，但酶在DNA上的切割位置遠離其識別位置，有的酶可在同識別序列相距1000bp的位置上隨機切割。l型限制酶對體外重組DNA實驗沒有多少用處。III型限制性內切核酸酶在DNA上有其特定的識別序列，其酶切位置在識別序列3‘端之外相距約20個堿基對處，可以產(chǎn)生各種類型的單鏈末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。II限制性內切核酸酶在DNA上有其特定的識別序列即，回文結構，通常為4-8bp，在特定識別位點處切割DNA。是基因工程中主要使用的酶類。110I型限制性內切核酸酶有其特定的DNA識別序列，但酶在DNA上限制酶特點：1.識別４-8個相連的核苷酸，以6個多見；3.1.4限制性內切酶的識別序列

BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’NotI5’-GCGGCCGC-3’

3’-CGCCGGCG-5’2.呈回文結構(palindrome)；3.旋轉對稱性；EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

4.切點大多數(shù)在識別順序之內，也有例外。FokI5’-GGATGNN

-3’3’-CCTAC

NN-5’外側，產(chǎn)生3’-端突起5.識別序列嚴格，少數(shù)有變動，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。111限制酶特點：3.1.4限制性內切酶的識別序列BamHI3.1.5限制性內切酶的切割方式內切酶切割后產(chǎn)生的三種末端a)5’突出的粘性末端如,EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’b)3’突出的粘性末端如,PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’c)平末端

如,SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’1123.1.5限制性內切酶的切割方式內切酶切割后產(chǎn)生的三種末端同裂酶:能識別相同序列，切割位點可以相同也可以不同，來源不同的酶。（1）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’3.1.6同列裂酶和同尾酶113同裂酶:能識別相同序列，切割位點可以相同也可以不同，來源不同XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：Asp718I5’-G

GTACC-3’3’-CCATG

G-5’KpnI5’-GGTAC

C-3’3’-C

CATGG-5’114XmaI5’-CCCGGG-3’識別位點相同尾酶(Isocaudamers):識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（2）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。115同尾酶(Isocaudamers):識別的序列不同，5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ

5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A1165’-GATC----3’Sau3A同尾酶的粘性末端互相同裂酶

（Isoschizomers）EnzymeSequenceIsoschizomersAcc65IGGTACCCCATGGAsp718I,KpnIAhaIIITTTAAA

AAATTTDraIBstMAICTGCAGGACGTCPstIEcoRIGAATTCCTTAAGFunIINdeICATATGGTATACFauNDINheIGCTAGCCGATCGAsuNHI,BmtINotIGCGGCCGCCGCCGGCGCciNISmaICCCGGGGGGCCCCfr9I,PspAI,XmaI,XmaCIRestrictionendonucleasesthatrecognizethesamesequenceareisoschizomers.117同裂酶（Isoschizomers）EnzymeSeq同尾酶

（

Isocaudamers

）EnzymeSequenceIsoschizomersBamHI5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’BclI,BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BamHI,BglIIBglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI,BamHIPstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-3’NsiI,5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-3’NsiI5’-ATGCAT-3’3’-TACGTA-5’PstIRestrictionendonucleasesthatrecognizethedifferenttargetsequenceandcutdownthesamesequencesstickyendsareisocaudamers.118同尾酶（Isocaudamers）EnzymeSequ3.1.7限制性內切酶識別序列出現(xiàn)的幾率及酶切片段的估算1193.1.7限制性內切酶識別序列出現(xiàn)的幾率及酶切片段的估DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1.DNA的純度3.1.8

影響限制性內切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量③延長保溫時間④擴大反應體積（>20l）一般采取120DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木?。121大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質粒：2.DNA的甲基化程度對不完全消化具有一定的影響3.DNA的分子結構DNA的分子結構有三種超螺旋結構、線性結構、單鏈開環(huán)結構122對不完全消化具有一定的影響3.DNA的分子結構D是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。123是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045255.酶切消化反應的時間和溫度

124不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少限制性內切酶儲存在含50%的甘油緩沖液中，酶切時甘油的濃度不應超過1/10體積。否則對酶活性有抑制作用。6.反應體積和甘油濃度質粒酶切鑒定通常設定反應體積為10-20μl,質粒酶切大量酶切通常設定反應體積為80-100μl。125限制性內切酶儲存在含50%的甘油緩沖液中，酶切時甘油的濃度不限制性內切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。7.星號（*）活性如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應緩沖液。星號（*）活性126限制性內切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pHEcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時候要特別注意！127EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活?；蛴靡掖汲恋鞤NA。3.1.9限制酶酶切反應的終止幾種常用限制酶識別位點128大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活。3.1.9限制酶酶切129293.2DNA連接酶（Ligase）

DNA連接酶能利用ATP或NAD+提供的能量催化多段DNA片段的3’-OH和5’-P基團之間形成3’，5’-磷酸二酯鍵，把兩個DNA片段連接在一起。OHPOHPHOPHOPPPOHHO連接酶1303.2DNA連接酶（Ligase）DN1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用機制及特點2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi1311.ATP（NAD+)提供激活的AMP。3.2.1作用機4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP1324.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的5.3‘-OH對磷原子作親核攻