細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件

動物細(xì)胞生物學(xué)

實驗技術(shù)動物細(xì)胞生物學(xué)

實驗技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基本實驗室操作第三節(jié)細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)主要內(nèi)容（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品（三）細(xì)胞培養(yǎng)液（四）細(xì)胞的原代、繼代培養(yǎng)（五）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（六）細(xì)胞污染主要內(nèi)容（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品（（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件1營養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境

溫度:

37℃

O2

CO2:

5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

pH:

7.2-7.4

滲透壓

濕度3無污染4無毒（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件1營養(yǎng)需要（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品：無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品：無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，1．超凈工作臺(Hood):A.水平流超凈工作臺(Horizontalairflow)B.垂直流超凈工作臺(Lateralairflow)1．超凈工作臺(Hood):A.水平流超凈工作臺(Ho水平流超凈工作臺背送風(fēng)，但病毒是不實用的，容易對人有害水平流超凈工作臺垂直流超凈工作臺垂直流超凈工作臺細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件超凈工作臺的清潔維護：保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾，即試驗完畢后，將所有的用品收藏起來，工作臺上只留有酒精燈及橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實驗結(jié)束后應(yīng)先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測工作臺濾器過濾的效率。超凈工作臺的清潔維護：保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾整個接種操作應(yīng)在近火焰處進行，且動作要迅速

正

確

錯

誤整個接種操作應(yīng)在近火焰處進行，且動作要迅速

正確接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染正

確

錯

誤接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染正確接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正

確

錯

誤接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正確瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯

誤瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正確2，CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，100%濕度，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。2，CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，100%濕濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠3．消毒設(shè)備：

A.高壓消毒鍋（Autoclave）：110oC，15lb，20分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9lb，10分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。

B.干熱消毒箱：150-200oC，2-3小時。

適合于玻璃器皿、金屬器械等。C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動物皮毛

等，酒精濃度為75－95％。

D.Co60：放射性同位素3．消毒設(shè)備：A.高壓消毒鍋（Autoclave）：高壓消毒鍋高壓消毒鍋

D.濾膜過濾：正壓過濾:

負(fù)壓過濾：

濾膜孔徑為0.22μm，為延長濾膜壽命可同時添加0.45μm和1.2μm濾膜。D.濾膜過濾：正壓過濾:負(fù)壓過濾：濾膜濾器濾膜濾器兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）4.蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：

1）用三蒸水，通過去離子純水系統(tǒng)，電阻需達(dá)到170萬歐姆以上。

2）專門的去離子水系統(tǒng)5.倒置相差顯微鏡：需用相差鏡頭和濾光片，集光器的選擇應(yīng)與接物鏡的放大倍數(shù)一致。4.蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：純水系統(tǒng)

純水系統(tǒng)倒置相差顯微鏡1，物鏡朝上2，工作距離大3，相差干涉倒置相差顯微鏡5，培養(yǎng)器皿5，培養(yǎng)器皿培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶5，恒溫水浴箱，血清滅活，細(xì)胞解凍5，恒溫水浴箱，血清滅活，細(xì)胞解凍6，移液管6，移液管細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件7，低速離心機7，低速離心機（三）細(xì)胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys5A、M199、F12等（三）細(xì)胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、Na2CO3,丙酮酸鈉、抗生素等Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要的量進行分裝，避免反復(fù)凍融，血清保存要放置－20℃Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考

選擇培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)液?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細(xì)胞株時咨詢。

其它實驗室慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細(xì)胞。

用多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIMV培養(yǎng)基（SFM）。培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考選擇血清使用注意事項血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。熱滅活（heat-inactivation）是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之補體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沉淀物顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)血清使用注意事項血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于補體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細(xì)胞溶解（抗體包裹細(xì)胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關(guān)系統(tǒng)。補體系統(tǒng)主要的功能是通過在病原體表面的作用，破壞其細(xì)胞膜或者“調(diào)理”病原體表面供巨噬細(xì)胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應(yīng)。加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

補體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細(xì)胞溶解（抗體包裹細(xì)胞溶解）的不凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因為會阻塞過濾膜。

顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。

血清沉淀物

凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(l谷氨酰胺脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

谷氨酰胺脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參谷氨酰胺配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM谷氨酰胺配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至10酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示橙色表示中性pH黃色代表酸性pH紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用，為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示細(xì)胞消化液由組織中分離細(xì)胞和細(xì)胞傳代常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨或混合使用細(xì)胞消化液由組織中分離細(xì)胞和細(xì)胞傳代常用的有胰蛋白酶和乙二胺胰蛋白酶溶液主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散消化細(xì)胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長胰蛋白酶溶液（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消全量換液和半量換液換液時機的選擇：細(xì)胞換液培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞換液細(xì)胞傳代1.原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株2.細(xì)胞系傳代以得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)3.接觸抑制4.營養(yǎng)枯竭將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細(xì)胞傳代1.原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株消化法傳代培養(yǎng)步驟消化法傳代培養(yǎng)步驟(五)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇冷凍保存要點冷凍過程要緩慢：緩凍速溶4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃更簡單的方法：脫脂棉包裹，直接放-20度過夜，第二天可放液氮凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：5x106－2x107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液5%或10％DMSO＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液(五)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇冷凍保存要點冷凍細(xì)胞注意事項凍存液配制

:現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物凍存液體積：要小，0.5-1ml凍存細(xì)胞數(shù)：與正常傳代細(xì)胞數(shù)目要相當(dāng)，避免復(fù)蘇后細(xì)胞傳代比例發(fā)生變化凍存速度：降溫緩慢4C，10－30min-20C，1--2h-80C，1hour–

過夜

-196C，1--2year完善記錄：凍存細(xì)胞名稱，凍存日期，凍存人，存放位置，其它特殊信息等冷凍細(xì)胞注意事項凍存液配制:現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物細(xì)胞凍存管，做好標(biāo)記細(xì)胞凍存管，做好標(biāo)記細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件細(xì)胞復(fù)蘇速融凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全培養(yǎng)液中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞復(fù)蘇速融解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全培養(yǎng)液中直接（六）細(xì)胞污染細(xì)菌污染真菌污染細(xì)菌和真菌的清除支原體污染支原體的清除（六）細(xì)胞污染細(xì)菌污染細(xì)菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

細(xì)菌污染細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作白色念珠菌（倒置顯微鏡下）

中間長梭型的是正在分裂的念珠菌白色念珠菌（倒置顯微鏡下）中間長梭型的是正在分裂的念珠菌細(xì)菌和真菌的清除使用抗生素抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍藥物沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。細(xì)菌和真菌的清除使用抗生素95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）精氨酸支原體（M.arginini）豬鼻支原體（M.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）危害：世界性問題，平均發(fā)生率達(dá)到11%能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá)不能通過可視法對其進行檢測對細(xì)胞的生長率影響較小，不易引起注意污染來源：操作環(huán)境不良操作人員的疏失實驗器具不潔等已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染95％以上是以下四種支原體：支原體污染熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養(yǎng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法支原體污染檢測熒光染色法支原體污染檢測細(xì)胞營養(yǎng)液常常仍清亮但變黃,細(xì)胞生長變緩，部分細(xì)胞發(fā)生脫落等等，細(xì)胞間隙可見鋪滿細(xì)沙樣小點。支原體污染表現(xiàn)熒光染料Hoechst33258染色法檢測支原體細(xì)胞營養(yǎng)液常常仍清亮但變黃,細(xì)胞生長變緩，部分細(xì)胞發(fā)生脫落等

支原體的清除

支原體清除劑MRA（Mycoplasma

Removal

Agent）處理法每4天換一次液，連續(xù)處理15天清洗純化法細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌原理：由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生，所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限.如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。

藥物輔助高溫處理法先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。支原體特異性血清法用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。

支原體的清除支原體清除劑MRA（Mycoplasma

共培養(yǎng)通常是一類細(xì)胞需要另一種細(xì)胞提供營養(yǎng)或者物理支持小鼠胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)通常是一類細(xì)胞需要另一種細(xì)胞提供營養(yǎng)或者物理支持小鼠胚細(xì)胞運輸

1.保存在干冰或液氮中運輸；

2.培養(yǎng)在瓶中:當(dāng)細(xì)胞生長至50％匯合，瓶中

充滿培液，瓶口封緊，運輸途中培養(yǎng)瓶最好呈直立狀。細(xì)胞帶至培養(yǎng)室后，在確保無污染的情況下立即開封，用酒精消毒瓶口和瓶身，吸出多余的培養(yǎng)液后將培養(yǎng)瓶平躺在培養(yǎng)箱內(nèi)。吸出的培液置于無菌容器中,可用于同一種細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞運輸1.保存在干冰或液氮中運輸；血清的作用

1.血清中含有許多營養(yǎng)物質(zhì)如：蛋白、激素、生長因子、細(xì)胞因子、維生素等；

2.血清是很好的緩沖系統(tǒng)；

3．含有轉(zhuǎn)運蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白等；

4．含有貼壁因子或粘附蛋白如纖粘連蛋白、胎球蛋白等可以幫助細(xì)胞貼壁；

5．對于重金屬有解毒的作用。

血清的作用

1.血清中含有許多營養(yǎng)物質(zhì)如：蛋白、激素血清的缺點1.血清成分復(fù)雜，不利于從培液中提取產(chǎn)物；2.有些物質(zhì)能干擾實驗結(jié)果，如受體和C3片段的檢測；難以研究各種因子作用的機制;3.血清能促使成纖維細(xì)胞過量生長，故對上皮細(xì)胞培養(yǎng)不利;4.每批血清中成分不同，可以影響實驗的結(jié)果，包括貼壁率等；5.易污染支原體。

血清的缺點1.血清成分復(fù)雜，不利于從培液中提取產(chǎn)物；無血清培養(yǎng)的優(yōu)點1．便于研究激素、生長因子、細(xì)胞因子、維生素等對細(xì)胞生長和分泌功能的作用及其作用機理包括信號通路等。2．作為選擇性培養(yǎng)基，便于從原代培養(yǎng)細(xì)胞中選擇目的細(xì)胞類型和較純的上皮細(xì)胞。3.消除不同批號引起實驗結(jié)果的不一致。5．基因工程和細(xì)胞工程產(chǎn)物的后處理簡單。6．用于追蹤腫瘤細(xì)胞的擴散。7.細(xì)胞工程臨床治療中降低免疫排斥。無血清培養(yǎng)的優(yōu)點1．便于研究激素、生長因子、細(xì)胞因子、維生素使用無血清培養(yǎng)的注意事項

1．pH緩沖系統(tǒng)不如含血清者佳，培液中加HEPES、細(xì)胞培養(yǎng)在CO2

培養(yǎng)箱中。

2．細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后需加入血清、BSA或大豆胰蛋白酶抑制劑。

3．細(xì)胞的凍存液中一般可添加血清。使用無血清培養(yǎng)的注意事項1．pH緩沖系統(tǒng)不如含血清者佳，培使用無血清培養(yǎng)的注意事項

5．進行藥物篩選實驗時，用藥量比含血清者低十倍左右。

6．根據(jù)各種細(xì)胞不同要求添加貼壁因子和生長因子，也可以將細(xì)胞先培養(yǎng)在含血清的培養(yǎng)液中，待細(xì)胞貼壁后換成無血清培養(yǎng)液；或?qū)⒊上档募?xì)胞培養(yǎng)在不斷降低血清濃度的培養(yǎng)液中(每傳5次降低一次血清濃度10％→5％→1％→0.1％)。使用無血清培養(yǎng)的注意事項

5．進行藥物篩選實驗時，用藥動物細(xì)胞生物學(xué)

實驗技術(shù)動物細(xì)胞生物學(xué)

實驗技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基本實驗室操作第三節(jié)細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)主要內(nèi)容（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品（三）細(xì)胞培養(yǎng)液（四）細(xì)胞的原代、繼代培養(yǎng)（五）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（六）細(xì)胞污染主要內(nèi)容（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品（（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件1營養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境

溫度:

37℃

O2

CO2:

5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

pH:

7.2-7.4

滲透壓

濕度3無污染4無毒（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件1營養(yǎng)需要（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品：無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品：無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，1．超凈工作臺(Hood):A.水平流超凈工作臺(Horizontalairflow)B.垂直流超凈工作臺(Lateralairflow)1．超凈工作臺(Hood):A.水平流超凈工作臺(Ho水平流超凈工作臺背送風(fēng)，但病毒是不實用的，容易對人有害水平流超凈工作臺垂直流超凈工作臺垂直流超凈工作臺細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件超凈工作臺的清潔維護：保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾，即試驗完畢后，將所有的用品收藏起來，工作臺上只留有酒精燈及橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實驗結(jié)束后應(yīng)先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測工作臺濾器過濾的效率。超凈工作臺的清潔維護：保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾整個接種操作應(yīng)在近火焰處進行，且動作要迅速

正

確

錯

誤整個接種操作應(yīng)在近火焰處進行，且動作要迅速

正確接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染正

確

錯

誤接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染正確接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正

確

錯

誤接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正確瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯

誤瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正確2，CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，100%濕度，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。2，CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，100%濕濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠3．消毒設(shè)備：

A.高壓消毒鍋（Autoclave）：110oC，15lb，20分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9lb，10分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。

B.干熱消毒箱：150-200oC，2-3小時。

適合于玻璃器皿、金屬器械等。C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動物皮毛

等，酒精濃度為75－95％。

D.Co60：放射性同位素3．消毒設(shè)備：A.高壓消毒鍋（Autoclave）：高壓消毒鍋高壓消毒鍋

D.濾膜過濾：正壓過濾:

負(fù)壓過濾：

濾膜孔徑為0.22μm，為延長濾膜壽命可同時添加0.45μm和1.2μm濾膜。D.濾膜過濾：正壓過濾:負(fù)壓過濾：濾膜濾器濾膜濾器兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）4.蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：

1）用三蒸水，通過去離子純水系統(tǒng)，電阻需達(dá)到170萬歐姆以上。

2）專門的去離子水系統(tǒng)5.倒置相差顯微鏡：需用相差鏡頭和濾光片，集光器的選擇應(yīng)與接物鏡的放大倍數(shù)一致。4.蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：純水系統(tǒng)

純水系統(tǒng)倒置相差顯微鏡1，物鏡朝上2，工作距離大3，相差干涉倒置相差顯微鏡5，培養(yǎng)器皿5，培養(yǎng)器皿培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶5，恒溫水浴箱，血清滅活，細(xì)胞解凍5，恒溫水浴箱，血清滅活，細(xì)胞解凍6，移液管6，移液管細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件7，低速離心機7，低速離心機（三）細(xì)胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys5A、M199、F12等（三）細(xì)胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、Na2CO3,丙酮酸鈉、抗生素等Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要的量進行分裝，避免反復(fù)凍融，血清保存要放置－20℃Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考

選擇培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)液?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細(xì)胞株時咨詢。

其它實驗室慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細(xì)胞。

用多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIMV培養(yǎng)基（SFM）。培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考選擇血清使用注意事項血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。熱滅活（heat-inactivation）是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之補體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沉淀物顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)血清使用注意事項血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于補體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細(xì)胞溶解（抗體包裹細(xì)胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關(guān)系統(tǒng)。補體系統(tǒng)主要的功能是通過在病原體表面的作用，破壞其細(xì)胞膜或者“調(diào)理”病原體表面供巨噬細(xì)胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應(yīng)。加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

補體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細(xì)胞溶解（抗體包裹細(xì)胞溶解）的不凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因為會阻塞過濾膜。

顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。

血清沉淀物

凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(l谷氨酰胺脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

谷氨酰胺脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參谷氨酰胺配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM谷氨酰胺配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至10酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示橙色表示中性pH黃色代表酸性pH紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用，為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示細(xì)胞消化液由組織中分離細(xì)胞和細(xì)胞傳代常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨或混合使用細(xì)胞消化液由組織中分離細(xì)胞和細(xì)胞傳代常用的有胰蛋白酶和乙二胺胰蛋白酶溶液主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散消化細(xì)胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長胰蛋白酶溶液（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消全量換液和半量換液換液時機的選擇：細(xì)胞換液培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞換液細(xì)胞傳代1.原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株2.細(xì)胞系傳代以得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)3.接觸抑制4.營養(yǎng)枯竭將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細(xì)胞傳代1.原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株消化法傳代培養(yǎng)步驟消化法傳代培養(yǎng)步驟(五)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇冷凍保存要點冷凍過程要緩慢：緩凍速溶4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃更簡單的方法：脫脂棉包裹，直接放-20度過夜，第二天可放液氮凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：5x106－2x107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液5%或10％DMSO＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液(五)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇冷凍保存要點冷凍細(xì)胞注意事項凍存液配制

:現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物凍存液體積：要小，0.5-1ml凍存細(xì)胞數(shù)：與正常傳代細(xì)胞數(shù)目要相當(dāng)，避免復(fù)蘇后細(xì)胞傳代比例發(fā)生變化凍存速度：降溫緩慢4C，10－30min-20C，1--2h-80C，1hour–

過夜

-196C，1--2year完善記錄：凍存細(xì)胞名稱，凍存日期，凍存人，存放位置，其它特殊信息等冷凍細(xì)胞注意事項凍存液配制:現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物細(xì)胞凍存管，做好標(biāo)記細(xì)胞凍存管，做好標(biāo)記細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)(二)課件細(xì)胞復(fù)蘇速融凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全培養(yǎng)液中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞復(fù)蘇速融解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全培養(yǎng)液中直接（六）細(xì)胞污染細(xì)菌污染真菌污染細(xì)菌和真菌的清除支原體污染支原體的清除（六）細(xì)胞污染細(xì)菌污染細(xì)菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

細(xì)菌污染細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作白色念珠菌（倒置顯微鏡下）

中間長梭型的是正在分裂的念珠菌白色念珠菌（倒置顯微鏡下）中間長梭型的是正在分裂的念珠菌細(xì)菌和真菌的清除使用抗生素抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍藥物沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。細(xì)菌和真菌的清除使用抗生素95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）精氨酸支原體（M.arginini）豬鼻支原體（M.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）危害：世界性問題，平均發(fā)生率達(dá)到11%能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá)不能通過可視法對其進行檢測對細(xì)胞的生長率影響較小，不易引起注意污染來源：操作環(huán)境不良操作人員的疏失實驗器具不潔等已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染95％以上是以下四種支原體：支原體污染熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養(yǎng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法支原體污染檢測熒光染色法支原體污染檢測細(xì)胞營養(yǎng)液