《蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)》教學(xué)課件

《蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！《蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使這種縮合作用可反復(fù)進(jìn)展，形成二肽、三肽、寡肽及多肽；肽鏈中一個(gè)氨基酸單位稱為一個(gè)氨基酸殘基(residue)，一個(gè)氨基酸殘基較游離氨基酸少一個(gè)水分子〔末端除外〕,平均分子量110；肽鏈的大小可用所含氨基酸殘基的總數(shù)表示或相對(duì)分子質(zhì)量表示，大多數(shù)天然多肽含50~200個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量在5,500~220,00之間；這種縮合作用可反復(fù)進(jìn)展，形成二肽、三肽、寡肽及多肽；2.6.2肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?directional)肽鏈的一端有游離氨基，稱氨基末端〔或N末端N-terminal〕，另一端有游離羧基，稱羧基末端〔或C末端C-terminal)；肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“—〞表示肽鍵。如：H2N－絲氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸-COOH寫為：Ser-Leu-Phe（或S-L-F）前述五肽：絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸寫為：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu（或S-G-Y-A-L）H2N--COOH2.6.2肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?directional)肽鏈肽鍵縮合肽鍵縮合2.6.3所有肽鏈的共價(jià)主鏈構(gòu)造都是一樣的肽鏈中的骨架構(gòu)造是由單位重復(fù)連接而成，稱共價(jià)主鏈〔mainchainorbackbone)；HH―N―C―C―OR不同肽鏈的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的排列順序不同；相同的氨基酸組成可形成多種不同的多肽鏈2.6.3所有肽鏈的共價(jià)主鏈構(gòu)造都是一樣的肽鏈中的骨架構(gòu)問(wèn)題1：每種肽鏈都有相同的分子骨架，試分析多肽分子骨架有哪些結(jié)構(gòu)特征？問(wèn)題1：每種肽鏈都有相同的分子骨架，試分析多肽分子骨架有哪些問(wèn)題2：寫出這一肽鏈的結(jié)構(gòu)和名稱,這四種氨基酸還可以組成幾種寡肽？問(wèn)題2：寫出這一肽鏈的結(jié)構(gòu)2.6.4肽鏈末端羧基、末端氨基及側(cè)鏈基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離，表現(xiàn)出重要的理化性質(zhì)在pH1～14范圍內(nèi)，主鏈上肽鍵氨基不發(fā)生解離，游離末端的-COOH和-NH2以及側(cè)鏈R上的基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離；各基團(tuán)解離程度及肽所帶的總電荷取決于所處溶液的pH值；對(duì)于指定的基團(tuán)，其pH＜pKa時(shí)，不發(fā)生酸式解離，pH＞pKa時(shí)，發(fā)生酸式解離，pH=pKa時(shí)，解離與不解離各占一半，由此可確定肽鏈所帶凈電荷.2.6.4肽鏈末端羧基、末端氨基及側(cè)鏈基團(tuán)可發(fā)生不同程度的問(wèn)題3：肽鏈中可解離基團(tuán)的（α-COOH，α-NH2及側(cè)鏈可解離基團(tuán)）pKa與游離氨基酸中對(duì)應(yīng)基團(tuán)的pKa值有何不同？為什么？問(wèn)題4：叢肽鏈的組成與結(jié)構(gòu)分析多肽有哪些主要性質(zhì)？問(wèn)題3：肽鏈中可解離基團(tuán)的（α-COOH，α-NH2及側(cè)鏈肽具有等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值可改變肽的帶電狀況，使肽不帶電荷而處于等電狀態(tài)時(shí)的pH值為肽的等電點(diǎn)肽等電點(diǎn)的差別可不同程度反映其氨基酸組成上的差異；反之亦然。等電狀態(tài)時(shí)，肽在電場(chǎng)中不向任何一方移動(dòng)不同大小的肽片斷可用雙向凝膠電泳進(jìn)行分離肽鏈中的解離基團(tuán)可被滴定，但肽的滴定曲線復(fù)雜短肽以離子晶體存在，具有較高的熔點(diǎn)肽鍵上的基團(tuán)具有相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)活性。肽具有等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值可改變肽的帶電狀況，使肽不帶電荷2.6.5許多短肽具有重要的生物活性

——天然存在的活性肽作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素或神經(jīng)調(diào)節(jié)物；如LHRH-類10肽(蛙的一種神經(jīng)遞質(zhì))，促甲狀腺素釋放因子，腦啡肽，內(nèi)啡肽，強(qiáng)啡肽等作為抗體：短桿菌肽A，短桿菌肽S等；作為激素：胰島素、胰高血糖素、促腎上腺皮質(zhì)激素等；作為防御性毒物：劇毒的鵝膏蕈堿、蛇毒、蛛毒等2.6.5許多短肽具有重要的生物活性

體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽促甲狀腺素釋放激素TRF焦谷氨酸組氨酸脯氨酰胺體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽促甲狀腺素釋放激素TRF焦谷氨酸谷胱甘肽〔glutathione，GSH〕谷氨酸半胱氨酸甘氨酸SHCOO-CH2CH2CCNH3HHOOCNHCHCH2CONHCH2OGSH過(guò)氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSGGSH還原酶NADPH+H+NADP+谷胱甘肽〔glutathione，GSH〕谷氨酸半胱氨酸L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，稱作：aspartameL-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，稱作：aspartame2.7.1多肽與蛋白質(zhì)的概念不完全一樣Thetermproteinbroadlydefinesmoleculescomposedofoneormorepolypeptidechains;Thetermpolypeptideisusedtodefinethechainexceedsseveraldozenaminoacidsinlength(lessthan50aminoacidresidues);Thetermspolypeptideandproteinareusedinterchangeablyindiscussingsinglepolypeptidechain.問(wèn)題5：試簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)的重要生物學(xué)功能？2.7蛋白質(zhì)是由一條或幾條多肽鏈組成的具有特定空間結(jié)構(gòu)和功能的生物大分子2.7.1多肽與蛋白質(zhì)的概念不完全一樣2.7蛋白質(zhì)是由一2.7.2根據(jù)蛋白質(zhì)的組成、或含多肽鏈數(shù)目或形狀可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)展不同的分類單純蛋白質(zhì)(simpleprotein)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)+非蛋白質(zhì)(輔基)(prostheticgroup)(conjugatedprotein)輔基種類很廣，常見(jiàn)的有色素化合物、寡糖、脂類、磷酸、金屬離子甚至核酸根據(jù)組成不同蛋白質(zhì)可分為2.7.2根據(jù)蛋白質(zhì)的組成、或含多肽鏈數(shù)目或形狀可對(duì)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)形狀可分為球狀蛋白與纖維狀蛋白：纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)球狀蛋白質(zhì)(globularprotein)肌動(dòng)蛋白毛發(fā)中的角蛋白蠶絲絲心蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)形狀可分為球狀蛋白與纖維狀蛋白：纖維狀蛋白質(zhì)(fi根據(jù)含多肽鏈數(shù)目可分為單體蛋白和多體蛋白寡聚蛋白(oligomericprotein)或多體蛋白(multimericprotein)單體蛋白(monomericprotein)異型多體蛋白(heteromultimericprotein)同型多體蛋白(homomultimericprotein)寡聚蛋白中的每一個(gè)具三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱亞基(subunit)

根據(jù)含多肽鏈數(shù)目可分為單體蛋白和多體蛋白寡聚蛋白(oligo應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去;2.8.1多數(shù)球狀蛋白質(zhì)溶于水形成膠體溶液蛋白質(zhì)溶膠性質(zhì)：a.質(zhì)點(diǎn)大小在膠體范圍：1～100nm

b.丁達(dá)爾效應(yīng)c.布朗運(yùn)動(dòng)d.不能透過(guò)半透膜2.8根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點(diǎn)可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素，將促使蛋白質(zhì)沉淀析出蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作蛋白質(zhì)處于PI時(shí)，凈電荷為零。溶解度最低不同蛋白質(zhì)

↓等電點(diǎn)不同↓調(diào)節(jié)pH值將蛋白質(zhì)彼此分開(kāi)2.8.2等電點(diǎn)沉淀和pH控制:蛋白質(zhì)處于PI時(shí)，凈電荷為零。溶解度最低2.8.2等電點(diǎn)沉淀隨著鹽濃度的升高，如飽和或半飽和時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，相互聚集而從水溶液中沉淀析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。解釋：大量中性鹽的參加，使水的活度降低，原來(lái)的溶液中的大局部自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子外表的水化層。常用的中性鹽：〔NH4)2SO4特點(diǎn)：保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象——蛋白質(zhì)別離、提純常用方法。2.8.3加入大量中性鹽可使蛋白質(zhì)沉淀析出低濃度時(shí)，中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶原因：蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，且與水分子相互作用加強(qiáng)；隨著鹽濃度的升高，如飽和或半飽和時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，相2.8.4有機(jī)溶劑分級(jí)分離法：作用原理：

①有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個(gè)相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)的表面可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。②有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體形成并沉淀。2.8.4有機(jī)溶劑分級(jí)分離法：作用原理：

①有機(jī)溶劑的加入2.8.5離子交換層析原理：樣品中各蛋白質(zhì)組分的凈電荷、分子大小不同，與固定相間的作用力不同而被分離洗脫方法：改變洗脫劑的鹽濃度、PH值依次洗脫結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來(lái)分離效果與溶液中的離子強(qiáng)度、pH有關(guān)常用固定相：離子化纖維素――羧甲基纖維素（CM），二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素

優(yōu)點(diǎn)：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，及較大的表面積，大分子可以自由通過(guò)

交換容量大,洗脫條件溫和,回收率高。離子化葡聚糖――交聯(lián)葡聚糖作基質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：交換容量比離子交換纖維素大3－4倍。2.8.5離子交換層析原理：樣品中各蛋白質(zhì)組分的凈電荷、分Cation-exchangecolumnpH=5.0時(shí)，基質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白組分帶不同電荷逐漸提高洗脫液的pH值，各組分以此被洗脫下來(lái)問(wèn)：洗脫順序？Cation-pH=5.0時(shí)，基質(zhì)帶負(fù)電荷逐漸提高洗脫液的p即分子排阻層析（也稱凝膠過(guò)濾層析，分子篩層析）2.8.6凝膠過(guò)濾：原理：凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外。隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。不同分子大小路徑不同洗脫：大分子--先洗脫出來(lái)小分子--后洗脫出來(lái)即分子排阻層析（也稱凝膠過(guò)濾層析，分子篩層析）2.8.6凝《蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)》教學(xué)課件2.8.7親和層析基礎(chǔ)：基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合）蛋白質(zhì)樣品加入到連有配基的基質(zhì)中（固定相）↓目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合，吸附在瓊質(zhì)糖顆粒上

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其它蛋白質(zhì)先被洗脫下來(lái)結(jié)合在基質(zhì)上的蛋白可用由配體溶液洗脫2.8.7親和層析基礎(chǔ)：基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（AffinitychromatographyAffinity對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一pH時(shí)，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，這一pH稱蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷，電場(chǎng)中移向正極pH＜pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷，電場(chǎng)中移向負(fù)極pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)不帶靜電荷，電場(chǎng)中不移動(dòng)。2.8.8利用蛋白質(zhì)的帶電性可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)在(PAGE)介質(zhì)中電泳時(shí)，其遷移率對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一pH時(shí)，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量巰基乙醇SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：則電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量(q/r），而與電荷和分子形狀無(wú)關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量巰基乙醇SDS聚丙烯酰胺①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過(guò)蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時(shí)均以同樣的電荷/分子質(zhì)量比向正極移動(dòng)。②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長(zhǎng)橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長(zhǎng)軸長(zhǎng)度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。③可用來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)的分子量①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過(guò)蛋白質(zhì)區(qū)帶電泳：外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH處，形成區(qū)帶。區(qū)帶電泳：外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法：凱氏定氮法：紫外吸收法雙縮脲法：Folin-酚試劑法（Lowry法）：考馬斯亮藍(lán)法（現(xiàn)最常用的方法）：膠體金法：帶負(fù)電的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍(lán)色，靈敏度最高測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法：蛋白質(zhì)具有多個(gè)構(gòu)造層次：一級(jí)構(gòu)造——二級(jí)構(gòu)造、三級(jí)構(gòu)造、四級(jí)構(gòu)造——生物功能蛋白質(zhì)的一級(jí)構(gòu)造指多肽鏈中氨基酸的排列順序——也稱共價(jià)構(gòu)造。共價(jià)肽鍵是一級(jí)構(gòu)造的唯一連接方式多肽鏈一級(jí)構(gòu)造決定著蛋白質(zhì)的高級(jí)構(gòu)造和功能2.9蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定——即蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸序列的測(cè)定高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)具有多個(gè)構(gòu)造層次：2.9蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定——即蛋測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈；測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成；分析多肽鏈的N末端和C末端〔方法很多〕斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵；多肽鏈斷裂成肽段；測(cè)定各個(gè)多肽段的氨基酸順序；確定肽段在多肽鏈中的次序；確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量Mr很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，如：滲透壓、擴(kuò)散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過(guò)濾、凝膠電泳等，測(cè)定末端氨基酸數(shù)xX÷(m/Mr)=n(蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目)〔m為樣品質(zhì)量〕變性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高濃度鹽溶液如有二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過(guò)氧乙酸處理凝膠過(guò)濾或電泳分離不同肽鏈蛋白質(zhì)中多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)中多肽鏈數(shù)目的確定測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量Mr變性：8mol/L尿素或6mol/LHC多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分氨基酸組成分析酸水解：堿水解：甲基磺酸水解：優(yōu)點(diǎn)：不破壞色氨酸，經(jīng)堿中和后可直接上機(jī)自動(dòng)分析缺點(diǎn)：不能有碳水化合物存在中和點(diǎn)不易掌握計(jì)算出各種氨基酸分子比多肽鏈分子量確定氨基酸組成氨基酸組成分析酸水解：確定氨基酸組成末端氨基酸分析N末端氨基酸分析丹黃酰氯法(DNS)：優(yōu)點(diǎn)：可直接層析或電泳別離，熒光檢測(cè)定性定量；靈敏度高(較二硝基氟苯法高100倍)二硝基氟苯(DNFBorFDNB)法氨肽酶法末端氨基酸分析N末端氨基酸分析多肽—OC—CH—NH2+R+HCI弱堿性+DNS-氨基酸酸水解游離氨基酸有機(jī)溶劑萃取溶于水定量

+定性確定N末端氨基酸確定肽鏈數(shù)目多肽—OC—CH—NH—RDNS-氨基酸多肽—OC—CH—NH2+R+HCI弱堿性+將肽鏈裂解成小片斷要求：斷裂點(diǎn)較少，專一性較強(qiáng)、產(chǎn)率高酶裂解法：常用的酶：胰蛋白酶：僅斷裂Lys、Arg羧基形成的肽鍵〔但〕糜蛋白酶：位點(diǎn)：Tyr、Phe、Trp羧基肽鍵胃蛋白酶：位點(diǎn)：兩種疏水性氨基酸形成的肽鍵嗜熱菌蛋白酶：專一性較差金黃色葡萄球菌蛋白酶〔Glu蛋白酶〕：梭狀芽孢桿菌蛋白酶〔Arg蛋白酶〕：化學(xué)裂解法：溴化氰法：專一性斷裂蛋氨酸羧基形成的肽鍵將肽鏈裂解成小片斷要求：斷裂點(diǎn)較少，專一性較強(qiáng)、可得到合適大小的肽片斷可得到合適大小的肽片斷Cyanogenbromide(溴化氰法〕Cyanogenbromide(溴化氰法〕肽段氨基酸序列的測(cè)定Edman降解法：一次可連續(xù)測(cè)定60~70個(gè)氨基酸；程序復(fù)雜，工作量大；酶降解法：質(zhì)譜法：肽段氨基酸序列的測(cè)定Edman降解法：一次可連續(xù)測(cè)定60~7Edman降解法測(cè)定N-末端氨基酸EdmanreagentPTC-多肽少一個(gè)N-末端氨基酸的肽鏈層析色譜鑒定重復(fù)①②③與DNS法聯(lián)合①②③Edman降解法測(cè)定N-末端氨基酸Edmanreagen肽片斷在多肽鏈中排列次序確實(shí)定(見(jiàn)p179)肽片斷在多肽鏈中排列次序確實(shí)定(見(jiàn)p179)多肽鏈中二硫鍵位置確實(shí)定多肽鏈中二硫鍵位置確實(shí)定多肽鏈氨基酸系列的直接測(cè)定：最初于1954年由英國(guó)劍橋大學(xué)的Sanger實(shí)驗(yàn)室建立；現(xiàn)主要由編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序推導(dǎo).蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)生物醫(yī)學(xué)基金會(huì)的PIR(ProteinInformationResourceorProteinIdentificationResource);美國(guó)政府的GenBank(GeneSequenceDataBank)歐洲的EMBL(EuropeanMolecularBiologyLaboratoryDataBank)〔歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)〕可從“AltasofProteinSequenceandStructure〞(蛋白質(zhì)序列和構(gòu)造圖冊(cè)〕中查找多肽鏈氨基酸系列的直接測(cè)定：最初于1954年由英國(guó)劍橋大學(xué)的同源蛋白質(zhì)：生物體內(nèi)行使一樣或相似功能的蛋白質(zhì)。如脊椎動(dòng)物的氧運(yùn)載蛋白，真核生物線粒體中的電子傳遞蛋白等均為同源蛋白。系列同源性(sequencehomology)：同源蛋白的氨基酸序列具有明顯的相似性，即具有系列同源性。具有幾乎一樣的肽鏈長(zhǎng)度；在許多對(duì)應(yīng)位置具有一樣的不變殘基；氨基酸殘基差異數(shù)與物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近成正比可以同源氨基酸差異數(shù)反響物種親緣關(guān)系——蛋白質(zhì)的一構(gòu)造是其形成特定三級(jí)構(gòu)造和行使特定功能的根底2.10同源蛋白具有序列同源性(sequencehomology)同源蛋白質(zhì)：生物體內(nèi)行使一樣或相似功能的蛋白質(zhì)。如脊椎動(dòng)物的高鐵血紅蛋白α-鏈和β-鏈肌紅蛋白高鐵血紅蛋白α-鏈和β-鏈肌紅蛋白AncestralcytochromecandHumancytochromecAncestralcytochromecandHumCytc系統(tǒng)樹Cytc系統(tǒng)樹《蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！《蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使這種縮合作用可反復(fù)進(jìn)展，形成二肽、三肽、寡肽及多肽；肽鏈中一個(gè)氨基酸單位稱為一個(gè)氨基酸殘基(residue)，一個(gè)氨基酸殘基較游離氨基酸少一個(gè)水分子〔末端除外〕,平均分子量110；肽鏈的大小可用所含氨基酸殘基的總數(shù)表示或相對(duì)分子質(zhì)量表示，大多數(shù)天然多肽含50~200個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量在5,500~220,00之間；這種縮合作用可反復(fù)進(jìn)展，形成二肽、三肽、寡肽及多肽；2.6.2肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?directional)肽鏈的一端有游離氨基，稱氨基末端〔或N末端N-terminal〕，另一端有游離羧基，稱羧基末端〔或C末端C-terminal)；肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“—〞表示肽鍵。如：H2N－絲氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸-COOH寫為：Ser-Leu-Phe（或S-L-F）前述五肽：絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸寫為：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu（或S-G-Y-A-L）H2N--COOH2.6.2肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?directional)肽鏈肽鍵縮合肽鍵縮合2.6.3所有肽鏈的共價(jià)主鏈構(gòu)造都是一樣的肽鏈中的骨架構(gòu)造是由單位重復(fù)連接而成，稱共價(jià)主鏈〔mainchainorbackbone)；HH―N―C―C―OR不同肽鏈的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的排列順序不同；相同的氨基酸組成可形成多種不同的多肽鏈2.6.3所有肽鏈的共價(jià)主鏈構(gòu)造都是一樣的肽鏈中的骨架構(gòu)問(wèn)題1：每種肽鏈都有相同的分子骨架，試分析多肽分子骨架有哪些結(jié)構(gòu)特征？問(wèn)題1：每種肽鏈都有相同的分子骨架，試分析多肽分子骨架有哪些問(wèn)題2：寫出這一肽鏈的結(jié)構(gòu)和名稱,這四種氨基酸還可以組成幾種寡肽？問(wèn)題2：寫出這一肽鏈的結(jié)構(gòu)2.6.4肽鏈末端羧基、末端氨基及側(cè)鏈基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離，表現(xiàn)出重要的理化性質(zhì)在pH1～14范圍內(nèi)，主鏈上肽鍵氨基不發(fā)生解離，游離末端的-COOH和-NH2以及側(cè)鏈R上的基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離；各基團(tuán)解離程度及肽所帶的總電荷取決于所處溶液的pH值；對(duì)于指定的基團(tuán)，其pH＜pKa時(shí)，不發(fā)生酸式解離，pH＞pKa時(shí)，發(fā)生酸式解離，pH=pKa時(shí)，解離與不解離各占一半，由此可確定肽鏈所帶凈電荷.2.6.4肽鏈末端羧基、末端氨基及側(cè)鏈基團(tuán)可發(fā)生不同程度的問(wèn)題3：肽鏈中可解離基團(tuán)的（α-COOH，α-NH2及側(cè)鏈可解離基團(tuán)）pKa與游離氨基酸中對(duì)應(yīng)基團(tuán)的pKa值有何不同？為什么？問(wèn)題4：叢肽鏈的組成與結(jié)構(gòu)分析多肽有哪些主要性質(zhì)？問(wèn)題3：肽鏈中可解離基團(tuán)的（α-COOH，α-NH2及側(cè)鏈肽具有等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值可改變肽的帶電狀況，使肽不帶電荷而處于等電狀態(tài)時(shí)的pH值為肽的等電點(diǎn)肽等電點(diǎn)的差別可不同程度反映其氨基酸組成上的差異；反之亦然。等電狀態(tài)時(shí)，肽在電場(chǎng)中不向任何一方移動(dòng)不同大小的肽片斷可用雙向凝膠電泳進(jìn)行分離肽鏈中的解離基團(tuán)可被滴定，但肽的滴定曲線復(fù)雜短肽以離子晶體存在，具有較高的熔點(diǎn)肽鍵上的基團(tuán)具有相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)活性。肽具有等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值可改變肽的帶電狀況，使肽不帶電荷2.6.5許多短肽具有重要的生物活性

——天然存在的活性肽作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素或神經(jīng)調(diào)節(jié)物；如LHRH-類10肽(蛙的一種神經(jīng)遞質(zhì))，促甲狀腺素釋放因子，腦啡肽，內(nèi)啡肽，強(qiáng)啡肽等作為抗體：短桿菌肽A，短桿菌肽S等；作為激素：胰島素、胰高血糖素、促腎上腺皮質(zhì)激素等；作為防御性毒物：劇毒的鵝膏蕈堿、蛇毒、蛛毒等2.6.5許多短肽具有重要的生物活性

體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽促甲狀腺素釋放激素TRF焦谷氨酸組氨酸脯氨酰胺體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽促甲狀腺素釋放激素TRF焦谷氨酸谷胱甘肽〔glutathione，GSH〕谷氨酸半胱氨酸甘氨酸SHCOO-CH2CH2CCNH3HHOOCNHCHCH2CONHCH2OGSH過(guò)氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSGGSH還原酶NADPH+H+NADP+谷胱甘肽〔glutathione，GSH〕谷氨酸半胱氨酸L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，稱作：aspartameL-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，稱作：aspartame2.7.1多肽與蛋白質(zhì)的概念不完全一樣Thetermproteinbroadlydefinesmoleculescomposedofoneormorepolypeptidechains;Thetermpolypeptideisusedtodefinethechainexceedsseveraldozenaminoacidsinlength(lessthan50aminoacidresidues);Thetermspolypeptideandproteinareusedinterchangeablyindiscussingsinglepolypeptidechain.問(wèn)題5：試簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)的重要生物學(xué)功能？2.7蛋白質(zhì)是由一條或幾條多肽鏈組成的具有特定空間結(jié)構(gòu)和功能的生物大分子2.7.1多肽與蛋白質(zhì)的概念不完全一樣2.7蛋白質(zhì)是由一2.7.2根據(jù)蛋白質(zhì)的組成、或含多肽鏈數(shù)目或形狀可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)展不同的分類單純蛋白質(zhì)(simpleprotein)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)+非蛋白質(zhì)(輔基)(prostheticgroup)(conjugatedprotein)輔基種類很廣，常見(jiàn)的有色素化合物、寡糖、脂類、磷酸、金屬離子甚至核酸根據(jù)組成不同蛋白質(zhì)可分為2.7.2根據(jù)蛋白質(zhì)的組成、或含多肽鏈數(shù)目或形狀可對(duì)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)形狀可分為球狀蛋白與纖維狀蛋白：纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)球狀蛋白質(zhì)(globularprotein)肌動(dòng)蛋白毛發(fā)中的角蛋白蠶絲絲心蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)形狀可分為球狀蛋白與纖維狀蛋白：纖維狀蛋白質(zhì)(fi根據(jù)含多肽鏈數(shù)目可分為單體蛋白和多體蛋白寡聚蛋白(oligomericprotein)或多體蛋白(multimericprotein)單體蛋白(monomericprotein)異型多體蛋白(heteromultimericprotein)同型多體蛋白(homomultimericprotein)寡聚蛋白中的每一個(gè)具三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱亞基(subunit)

根據(jù)含多肽鏈數(shù)目可分為單體蛋白和多體蛋白寡聚蛋白(oligo應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去;2.8.1多數(shù)球狀蛋白質(zhì)溶于水形成膠體溶液蛋白質(zhì)溶膠性質(zhì)：a.質(zhì)點(diǎn)大小在膠體范圍：1～100nm

b.丁達(dá)爾效應(yīng)c.布朗運(yùn)動(dòng)d.不能透過(guò)半透膜2.8根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點(diǎn)可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素，將促使蛋白質(zhì)沉淀析出蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作蛋白質(zhì)處于PI時(shí)，凈電荷為零。溶解度最低不同蛋白質(zhì)

↓等電點(diǎn)不同↓調(diào)節(jié)pH值將蛋白質(zhì)彼此分開(kāi)2.8.2等電點(diǎn)沉淀和pH控制:蛋白質(zhì)處于PI時(shí)，凈電荷為零。溶解度最低2.8.2等電點(diǎn)沉淀隨著鹽濃度的升高，如飽和或半飽和時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，相互聚集而從水溶液中沉淀析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。解釋：大量中性鹽的參加，使水的活度降低，原來(lái)的溶液中的大局部自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子外表的水化層。常用的中性鹽：〔NH4)2SO4特點(diǎn)：保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象——蛋白質(zhì)別離、提純常用方法。2.8.3加入大量中性鹽可使蛋白質(zhì)沉淀析出低濃度時(shí)，中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶原因：蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，且與水分子相互作用加強(qiáng)；隨著鹽濃度的升高，如飽和或半飽和時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，相2.8.4有機(jī)溶劑分級(jí)分離法：作用原理：

①有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個(gè)相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)的表面可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。②有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體形成并沉淀。2.8.4有機(jī)溶劑分級(jí)分離法：作用原理：

①有機(jī)溶劑的加入2.8.5離子交換層析原理：樣品中各蛋白質(zhì)組分的凈電荷、分子大小不同，與固定相間的作用力不同而被分離洗脫方法：改變洗脫劑的鹽濃度、PH值依次洗脫結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來(lái)分離效果與溶液中的離子強(qiáng)度、pH有關(guān)常用固定相：離子化纖維素――羧甲基纖維素（CM），二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素

優(yōu)點(diǎn)：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，及較大的表面積，大分子可以自由通過(guò)

交換容量大,洗脫條件溫和,回收率高。離子化葡聚糖――交聯(lián)葡聚糖作基質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：交換容量比離子交換纖維素大3－4倍。2.8.5離子交換層析原理：樣品中各蛋白質(zhì)組分的凈電荷、分Cation-exchangecolumnpH=5.0時(shí)，基質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白組分帶不同電荷逐漸提高洗脫液的pH值，各組分以此被洗脫下來(lái)問(wèn)：洗脫順序？Cation-pH=5.0時(shí)，基質(zhì)帶負(fù)電荷逐漸提高洗脫液的p即分子排阻層析（也稱凝膠過(guò)濾層析，分子篩層析）2.8.6凝膠過(guò)濾：原理：凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外。隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。不同分子大小路徑不同洗脫：大分子--先洗脫出來(lái)小分子--后洗脫出來(lái)即分子排阻層析（也稱凝膠過(guò)濾層析，分子篩層析）2.8.6凝《蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)》教學(xué)課件2.8.7親和層析基礎(chǔ)：基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合）蛋白質(zhì)樣品加入到連有配基的基質(zhì)中（固定相）↓目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合，吸附在瓊質(zhì)糖顆粒上

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其它蛋白質(zhì)先被洗脫下來(lái)結(jié)合在基質(zhì)上的蛋白可用由配體溶液洗脫2.8.7親和層析基礎(chǔ)：基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（AffinitychromatographyAffinity對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一pH時(shí)，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，這一pH稱蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷，電場(chǎng)中移向正極pH＜pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷，電場(chǎng)中移向負(fù)極pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)不帶靜電荷，電場(chǎng)中不移動(dòng)。2.8.8利用蛋白質(zhì)的帶電性可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)在(PAGE)介質(zhì)中電泳時(shí)，其遷移率對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一pH時(shí)，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量巰基乙醇SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：則電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量(q/r），而與電荷和分子形狀無(wú)關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量巰基乙醇SDS聚丙烯酰胺①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過(guò)蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時(shí)均以同樣的電荷/分子質(zhì)量比向正極移動(dòng)。②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長(zhǎng)橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長(zhǎng)軸長(zhǎng)度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。③可用來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)的分子量①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過(guò)蛋白質(zhì)區(qū)帶電泳：外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH處，形成區(qū)帶。區(qū)帶電泳：外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法：凱氏定氮法：紫外吸收法雙縮脲法：Folin-酚試劑法（Lowry法）：考馬斯亮藍(lán)法（現(xiàn)最常用的方法）：膠體金法：帶負(fù)電的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍(lán)色，靈敏度最高測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法：蛋白質(zhì)具有多個(gè)構(gòu)造層次：一級(jí)構(gòu)造——二級(jí)構(gòu)造、三級(jí)構(gòu)造、四級(jí)構(gòu)造——生物功能蛋白質(zhì)的一級(jí)構(gòu)造指多肽鏈中氨基酸的排列順序——也稱共價(jià)構(gòu)造。共價(jià)肽鍵是一級(jí)構(gòu)造的唯一連接方式多肽鏈一級(jí)構(gòu)造決定著蛋白質(zhì)的高級(jí)構(gòu)造和功能2.9蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定——即蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸序列的測(cè)定高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)具有多個(gè)構(gòu)造層次：2.9蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定——即蛋測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈；測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成；分析多肽鏈的N末端和C末端〔方法很多〕斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵；多肽鏈斷裂成肽段；測(cè)定各個(gè)多肽段的氨基酸順序；確定肽段在多肽鏈中的次序；確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量Mr很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，如：滲透壓、擴(kuò)散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過(guò)濾、凝膠電泳等，測(cè)定末端氨基酸數(shù)xX÷(m/Mr)=n(蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目)〔m為樣品質(zhì)量〕變性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高濃度鹽溶液如有二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過(guò)氧乙酸處理凝膠過(guò)濾或電泳分離不同肽鏈蛋白質(zhì)中多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)中多肽鏈數(shù)目的確定測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量Mr變性：8mol/L尿素或6mol/LHC多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分氨基酸組成分析酸水解：堿水解：甲基磺酸水解：優(yōu)點(diǎn)：不破壞色氨酸，經(jīng)堿中和后可直接上機(jī)自動(dòng)分析缺點(diǎn)：不能有碳水化合物存在中和點(diǎn)不易掌握計(jì)算出各種氨基酸分子比多肽鏈分子量確定氨基酸組成氨基酸組成分析酸水解：確定氨基酸組成末端氨基酸分析N末端氨基酸分析丹黃酰氯法(DNS)：優(yōu)點(diǎn)：可直接層析或電泳別離，