基因工程李立家小題目及復(fù)習(xí)資料

基因工程試題與答案標(biāo)記（探針）（已知一個(gè)克隆在質(zhì)粒載體上的500bpDNA外源片段，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)并用3種標(biāo)記方法方案來(lái)對(duì)這個(gè)外源片段進(jìn)行標(biāo)記。帶有能檢測(cè)的標(biāo)記物的DNA或RNA叫探針。使DNA或RNA帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物的過(guò)程叫探針標(biāo)記。1）切口平移標(biāo)記:控制DNaseI的濃度，就可以在雙鏈DNA分子的一條鏈的有限位置上打開(kāi)切口，形成3-OH末端（這條鏈即成為引物）。DNA聚合酶I把一個(gè)帶有標(biāo)記物的dNTP就加在這引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性將切除5-單核苷酸，同時(shí)依次添加新的核苷酸到3一側(cè)，其結(jié)果使切口沿著DNA平移，這就叫切口平移（Nicktranslation）2）隨機(jī)引物標(biāo)記:能與任何DNA配對(duì)互補(bǔ)的一小段DNA序列叫隨機(jī)引物。DNA聚合酶klenow大片段能在隨機(jī)引物的引導(dǎo)下以帶有標(biāo)記物的dNTP為原料合成新的與模板DNA互補(bǔ)的探針。3）PCR標(biāo)記:針對(duì)目的片段，設(shè)計(jì)好引物，以標(biāo)記號(hào)的dNTP為原料合成新的與模板DNA互補(bǔ)的探針4）末端核苷酸轉(zhuǎn)移法:P32和多核苷酸激酶在5'端標(biāo)記DNA或RNA。先用堿性磷酸酶處理去除DNA5'的磷酸基團(tuán)，多核苷酸激酶用于對(duì)缺乏5'-磷酸的DNA或合成接頭進(jìn)行磷酸化,同時(shí)可對(duì)末端進(jìn)行標(biāo)記。補(bǔ)充：1）常用的標(biāo)記物包括：P32的同位素標(biāo)記；熒光探針標(biāo)記的dNTP；生物素；地高辛2）應(yīng)用：定性（是否轉(zhuǎn)入該基因）；定量（含量的高低）；定位；成分（配對(duì)的程度、是否同源）PCR技術(shù)（試述PCR技術(shù)的基本原理，如果想通過(guò)PCR技術(shù)從一個(gè)生物基因組中擴(kuò)增個(gè)約500bp的基因片段，再和載體連接克隆，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，請(qǐng)描述其克隆過(guò)程（包括檢測(cè)）。）（1）PCR的概念：又稱為聚合酶鏈反應(yīng)，能在體外特異快速擴(kuò)增DNA片段。組成：DNA單鏈模板、引物和DNA聚合酶（包括緩沖液）（2）PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。雙鏈DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，隨即退火使引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，之后在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行子鏈的延伸。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，在很短的時(shí)間內(nèi)特異性的快速擴(kuò)增DNA片段。（3） 克隆過(guò)程：A、 設(shè)計(jì)合適的引物，大小在15-25個(gè)核苷酸之間，兩個(gè)引物與模板的結(jié)合點(diǎn)之間要包含需擴(kuò)增的片段的序列，而且引物中要含有合適的酶切位點(diǎn)。B、根據(jù)引物和目標(biāo)片段的性質(zhì)，設(shè)定各步驟反應(yīng)的溫度和時(shí)間進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增目標(biāo)片段。C、 用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并回收目標(biāo)片段。D、用相同的（或者能夠得到相同末端的）限制性內(nèi)切酶對(duì) PCR獲得的目標(biāo)片段和選擇的載體進(jìn)行酶切，之后將片段和切開(kāi)的載體放置在同一EP管中，加入T4連接酶進(jìn)行連接。E、 用普通鈣轉(zhuǎn)或者電轉(zhuǎn)的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。F、 根據(jù)載體含有的性質(zhì)，選擇合適的篩選標(biāo)記選出轉(zhuǎn)入載體的菌株。G、若基因片段無(wú)明顯篩選標(biāo)記， 則可通過(guò)將提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、 菌落PCR或者DNA探針雜交的方法檢測(cè)載體上是否含有目標(biāo)片段，排除空載體的干擾。（4）PCR技術(shù)的應(yīng)用A、 基因組DNAPCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆B、 基因組的RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析，randomamplifiedpolymorphicDNA）標(biāo)記分析。使用隨機(jī)的短核苷酸引物，在低的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所呈顯的帶型，反映著用作擴(kuò)增模板的DNA分子的總體結(jié)構(gòu)特征。C、 臨床診斷和法醫(yī)鑒定。如男女性別鑒定，病毒性感染病的診斷，對(duì)單根毛發(fā)或單個(gè)精子作遺傳學(xué)鑒定等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性問(wèn)題正面觀點(diǎn)：（1）轉(zhuǎn)基因工程是不可阻擋的.基因工程將影響當(dāng)代重大的環(huán)境問(wèn)題:人口過(guò)剩/污染/生物多樣性急劇減退等等.保護(hù)土壤/水/能源成為發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的目標(biāo)。（2） 轉(zhuǎn)基因食品的功效:改良植物的食用品質(zhì)；增加果蔬貯藏、保鮮性能；生產(chǎn)特殊食品——食品疫苗。（3）迄今為止并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品危害人體健康和環(huán)境的確切證據(jù)。 如果轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)得不到社會(huì)支持，這一研究將被扼殺。反面觀點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因的潛在危害：轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物安全性評(píng)價(jià)主要集中在環(huán)境安全性，食品安全性以與對(duì)人動(dòng)物健康的影響三方面。環(huán)境安全性分析包括：（1）生存競(jìng)爭(zhēng)性：轉(zhuǎn)基因植物在生存競(jìng)爭(zhēng)方面具有的優(yōu)勢(shì)可能導(dǎo)致生物多樣性的減少，影響了生物多樣性；（2）生殖隔離距離:基因不可控制的水平轉(zhuǎn)移的可能性；與近緣野生種的可交配性：外源基因是否會(huì)漂流擴(kuò)散至親緣野生種中，從而破壞自然生態(tài)平衡；（3）對(duì)非靶生物的影響：轉(zhuǎn)基因植物花粉通過(guò)風(fēng)，雨，鳥(niǎo)，昆蟲，真菌，細(xì)菌以至整個(gè)生物鏈傳播使外源基因逃逸，從而造成基因污染。（4）病毒發(fā)生異緣重組或異緣包裝的可能性：自然界中存在著植物病毒之間的異緣重組。（5）對(duì)農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境的影響，生態(tài)平衡.如產(chǎn)生超級(jí)雜草的可能性；種植抗蟲轉(zhuǎn)基因作物后可能使害蟲產(chǎn)生免疫并遺傳、從而產(chǎn)生更加難以消滅的“超級(jí)害蟲”；食品安全性：（1）轉(zhuǎn)基因毒性.如英國(guó)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯會(huì)減弱老鼠免疫系統(tǒng)功能，美國(guó)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米會(huì)危害蝴蝶幼蟲與其相關(guān)生態(tài)環(huán)境；（2）人的毒理反應(yīng)或過(guò)敏反應(yīng).大腸桿菌細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，痕量的內(nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。（3）實(shí)質(zhì)等同性的原則，即某一種生物技術(shù)產(chǎn)品或其成分能夠與市場(chǎng)上現(xiàn)有的對(duì)應(yīng)產(chǎn)品進(jìn)行比較。如果一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品能夠與現(xiàn)存的一種產(chǎn)品進(jìn)行比較，并且發(fā)現(xiàn)具有實(shí)質(zhì)同等性，便能用現(xiàn)產(chǎn)品安全性同種方法對(duì)待它。轉(zhuǎn)基因植物所引入的蛋白對(duì)人體可能是異性蛋白質(zhì)，在部分人中可能發(fā)生食物過(guò)敏，特別是幼兒和某些過(guò)敏體質(zhì)的人。對(duì)人動(dòng)物健康的影響：轉(zhuǎn)入傳統(tǒng)食品或作物中的基因可能來(lái)自各種物種，有些是人們不能或者極少食用的，是否會(huì)對(duì)人體造成危害；轉(zhuǎn)基因植物食品中的新基因會(huì)不會(huì)傳遞給人畜的腸道微生物，插入表達(dá)，然后危害健康。動(dòng)物：1.外源基因在動(dòng)物基因組中的隨機(jī)整合，可能會(huì)引起宿主細(xì)胞基因的插入突變、缺失突變與宿主基因的擴(kuò)增重排和移位，也可能激活正常狀態(tài)下處于關(guān)閉狀態(tài)的基因，從而導(dǎo)致動(dòng)物表型的改變甚至造成動(dòng)物不育或死亡；插入的外源基因是否會(huì)影響宿主動(dòng)物自身的基因表達(dá)與表達(dá)水平；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是否可能會(huì)把外源基因傳遞給生活在其周圍的其它種群與環(huán)境，造成基因污染；在病毒等致病基因的轉(zhuǎn)基因研究中，不可避免地會(huì)產(chǎn)生一些有害的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，是否可能因?yàn)槭褂棉D(zhuǎn)基因動(dòng)物制品而將一些動(dòng)物性疾病傳遞給人類。未知的.總的來(lái)說(shuō)：就目前而言，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類有害，但同時(shí)也缺乏證據(jù)證明它的無(wú)害性，因此產(chǎn)生了一些爭(zhēng)論。如何區(qū)分重組DNA和空載體自連：（一）檢測(cè)方法（1）雙抗性篩選：具有四環(huán)素和氨芐青霉素兩種抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記， 一種抗性標(biāo)記用來(lái)正選擇轉(zhuǎn)化子，另一種通過(guò)插入失活而可以鑒定重組子。Ori位于Amp+和tet+這兩個(gè)基因之間，在四環(huán)素平板上出現(xiàn)的菌落一定是獲得了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，在此基礎(chǔ)上，如果四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素敏感，則說(shuō)明在載體中有外源片段的插入而使氨芐青霉素抗性失活，即重組子；若對(duì)氨芐青霉素有抗性，則此轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒是空載體。（2）抗生素插入失活法：如BamHI可以從四環(huán)素位點(diǎn)切開(kāi)，使該基因不能表達(dá)，但仍能表達(dá)氨芐抗性基因，對(duì)四環(huán)素是敏感的。篩選重組pBR322按照以下方法進(jìn)行，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)于氨芐培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以生長(zhǎng)形成克隆，影印到四環(huán)素培養(yǎng)基上，不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落可能就是目的克隆。（3）限制性內(nèi)切酶法：外源片段通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)插入到載體上，因此，可以通過(guò)這些限制性酶酶切重組質(zhì)粒，電泳分析插入片段長(zhǎng)度是否正確。 （抗生素+酶切檢測(cè)+測(cè)序）（4）藍(lán)白斑篩選：多克隆位點(diǎn)存在于編碼B-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，與pUC載體一起使用的宿主菌攜帶編碼B-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。通過(guò)a互補(bǔ)機(jī)制，兩個(gè)片段在體內(nèi)相互彌補(bǔ)，產(chǎn)生一個(gè)有活性的B-半乳糖苷酶。以X-gal作為指示劑。若通過(guò)插入外源DNA到多克隆位點(diǎn)中而打斷了B-半乳糖苷酶的部分基因，不能產(chǎn)生有活性的B -半乳糖苷酶，X-gal不會(huì)反應(yīng)，重組子菌落為白色，而自連空載體轉(zhuǎn)化的菌落則是藍(lán)色的。（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過(guò)PCR的方法進(jìn)行鑒定（6）菌落原位雜交：把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后溶菌，變性并固定DNA，最后用標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的菌落或噬菌斑。（7） 測(cè)序法：若通過(guò)前面這些方法鑒定之后還是有疑慮，不知道是否陽(yáng)性者確為真陽(yáng)性而不是空載體自連，可以將其送到生物公司進(jìn)行測(cè)序以最終確定之。（8） 基因產(chǎn)物檢測(cè)法：如果使用的是表達(dá)載體，那么就可以通過(guò)鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆。（二）避免方法：（1）.堿性磷酸酶處理載體在DNA重組實(shí)驗(yàn)中，用堿性磷酸酶對(duì)載體DNA的5'末端除磷，可以防止載體自連，提高重組率（2） ?噬菌體包裝蛋白包裝下限的限制： 選用入噬菌體或者柯氏載體，含有cos位點(diǎn)，包裝35~51kb的片段，空載體片段太小，不會(huì)被包裝（3）.利用某些基因（改基因存在時(shí)質(zhì)粒不能在一定的菌株中存在 ,而此被基因?yàn)橥庠碊NA取代時(shí)則能存在）等預(yù)防措施.質(zhì)粒載體vs噬菌體載體：?jiǎn)渭円允删w為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體:裝載量大,能獲得單鏈DNA,轉(zhuǎn)染效率高;操作較難,DNA不穩(wěn)定單純以質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體:有天然的抗性選擇標(biāo)記,操作容易（宜于分離和純化）,較穩(wěn)定;裝載量小,轉(zhuǎn)化效率較低（一）優(yōu)缺點(diǎn)比較載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)質(zhì)粒載體1.分子量非常小2?具有較咼的拷貝數(shù)3?易分離4.易改造1.不穩(wěn)定：分離不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易丟失噬困體載體1?具有質(zhì)粒性質(zhì)，便于外源DNA的克隆與重組子的篩選有利于提高裝載量較穩(wěn)定，重組至宿主基因組轉(zhuǎn)化效率咼噬菌體可能會(huì)變化而恢復(fù)毒性對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有害等；宿主范圍窄（二）異同點(diǎn)比較相同點(diǎn)：1、 復(fù)制子：一段具有特殊結(jié)構(gòu)的DNA序列，載體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)才能使與它結(jié)合的外源基因在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制繁殖。2、 選擇性標(biāo)記：一般情況下，所要擴(kuò)增的基因不便于選擇，所以作為載體要求具有選擇標(biāo)記。易于識(shí)別和篩選，如抗藥性、顯色表型反應(yīng)等；3、 限制性酶切位點(diǎn)：具有一個(gè)或者幾個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，便于外源基因的插入；4、載體的大小適當(dāng)，可以插入一段較大的外源 DNA,又不影響本身的復(fù)制；5、 均有適當(dāng)?shù)目截悢?shù)，既有利于載體的制備，還要使外源基因大量表達(dá)；6、 載體的安全性：要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移不同點(diǎn)：1、質(zhì)粒載體多為雙鏈共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，而噬菌體的核酸一般為雙鏈線性DNA分子，也有雙鏈環(huán)形DNA、單鏈線性DNA、單鏈環(huán)形DNA與單鏈REN等多種形式。2、質(zhì)粒多能獨(dú)立于染色體之外自主復(fù)制， 而噬菌體的DNA整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為一個(gè)組成部分。3、 質(zhì)粒常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌生存有利的基因，包含抗生素抗性基因等，而噬菌體基因一般不具有抗性基因。4、噬菌體載體的結(jié)構(gòu)要比質(zhì)粒復(fù)雜， 噬菌體作為基因克隆載體在克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)具有天然的優(yōu)勢(shì)，他們感染細(xì)胞比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞更為有效，所以噬菌體的克隆產(chǎn)量通常要高一些。如何在大腸桿菌中高效表達(dá)外源基因：涉與三個(gè)方面：（1）強(qiáng)化蛋白質(zhì)的生物合成（重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)錄水平和翻譯速率） ；（2）抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)物降解；（3）恢復(fù)維持蛋白質(zhì)特異性空間結(jié)構(gòu)。（一）．強(qiáng)化蛋白質(zhì)的生物合成1） 啟動(dòng)子：影響表達(dá)效率的主要因素之一是啟動(dòng)子的強(qiáng)度。高水平表達(dá)的最佳啟動(dòng)子必須具備的條件：（1）它必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠使克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10％-30％；（2）這種啟動(dòng)子應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。2）終止子：有效的轉(zhuǎn)錄終止子的必要性：（1）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，所需時(shí)間就多，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；（2）轉(zhuǎn)錄通讀進(jìn)入質(zhì)粒功能區(qū)，可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制和其他生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；（3）轉(zhuǎn)錄終止子能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定從而大大提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平；（4）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)影響翻譯效率。3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的結(jié)構(gòu)要素：外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌mRNA的翻譯起始效率主要由其5'端的結(jié)構(gòu)序列所決定，即核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）,它包括4個(gè)結(jié)構(gòu)要素：（1）起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列UAAGGAGG,即Shine-Dalgarno（SD）序列；（2）起始密碼子AUG；SD與起始密碼子之間的距離與堿基組成；基因編碼區(qū)5'端若干密碼子的堿基序列，至少這一序列不能與 mRNA的5'端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。4)密碼子由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有不同程度的差異性，因此，外源基因尤其是哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)：(1)，采用外源基因全合成的方法，按照大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子；(2)對(duì)于那些含有不和諧密碼子種類單一，出現(xiàn)頻率較高而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。5)質(zhì)?？截悢?shù)可以通過(guò)構(gòu)建高拷貝載體增加質(zhì)粒拷貝數(shù)以增加基因的劑量。質(zhì)粒的穩(wěn)定性對(duì)工程菌株高效表達(dá)產(chǎn)物非常重要。在寄主細(xì)胞快速生長(zhǎng)期間質(zhì)粒易于丟失，出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞。減少質(zhì)粒丟失的措施：(1)保持抗生素的選擇壓力；(2)在載體中保留或連接質(zhì)粒分配功能區(qū)bar；(3)避免質(zhì)粒多體的形成；(4)將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制軌道。對(duì)于分子量較小的蛋白或多肽可采用將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因克隆在高拷貝載體上表達(dá)的策略。二)．抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)物降解1)包涵體異源蛋白的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成包涵體，包涵體是由一群不溶性蛋白質(zhì)聚集在一起形成的晶體結(jié)構(gòu)物，被膜包裹或無(wú)膜裸露。大腸桿菌形成的包涵體大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中。以包涵體形式表達(dá)異源蛋白的優(yōu)點(diǎn)：（1）易于分離；（2）蛋白質(zhì)受到保護(hù)而免受胞內(nèi)蛋白酶的降解；（3）蛋白質(zhì)沒(méi)有生物活性，對(duì)寄主細(xì)胞沒(méi)有影響。2）分泌型異源蛋白的表達(dá)這種蛋白質(zhì)分泌定位于細(xì)胞周質(zhì)，或分泌到胞外培養(yǎng)基中。優(yōu)點(diǎn):（1）易于純化，因?yàn)橹苜|(zhì)和胞外的蛋白質(zhì)種類較少；（2）蛋白酶活性較低，蛋白質(zhì)較穩(wěn)定；（3） N端甲硫氨酸殘基被切除。3）融合型異源蛋白的表達(dá)將外源基因和受體菌自身蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，作為一個(gè)閱讀框架進(jìn)行表達(dá)，這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：（1）位于融合蛋白的N端受體菌自身蛋白質(zhì)可使蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定性增加，阻止包涵體地形成；（2）分離純化程序簡(jiǎn)單；（3）表達(dá)效率高。在構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，所選用地受體菌基因通常是高效表達(dá)的三）．恢復(fù)維持蛋白質(zhì)特異性空間結(jié)構(gòu)將表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)在體外加工使其擁有正確的空間構(gòu)象。例如（1）在生產(chǎn)胰島素時(shí)，或者分別表達(dá)A/B鏈，在體外進(jìn)行二硫鍵連接；或者（2）表達(dá)前胰島素蛋白，在體外進(jìn)行酶切。植物轉(zhuǎn)基因兩種方法的比較：（一）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法：一種載體介導(dǎo)法，是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)感染受體植物將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的技術(shù)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的優(yōu)點(diǎn):1.轉(zhuǎn)化效率高能夠插入非重排的外緣DNA長(zhǎng)片斷外緣轉(zhuǎn)化DNA主要以單拷貝或是低拷貝形式插入不需要特殊的專用設(shè)備缺點(diǎn):轉(zhuǎn)化的寄主范圍有限,特別是對(duì)許多單子葉植物不適用，主要適用于雙子葉系統(tǒng)外源的轉(zhuǎn)基因只能以T-DNA插入的方式被導(dǎo)入寄主細(xì)胞（二）基因槍法：也稱微粒轟擊法，是一種快速有效的植物DNA轉(zhuǎn)移系統(tǒng)之一。其基本原理是利用帶有外源DNA的金粉或鎢粉微粒經(jīng)過(guò)放電或機(jī)械加速后對(duì)細(xì)胞射擊。生物彈擊法的優(yōu)點(diǎn):1.基因轉(zhuǎn)移不受物種界限的約束2.可適用于不同的轉(zhuǎn)化樣品,如根,鏡,葉培養(yǎng)細(xì)胞愈傷組織,甚至種子等很有可能用于培育轉(zhuǎn)基因的禾谷類作物缺點(diǎn):1.需要復(fù)雜的專用設(shè)備2.外源轉(zhuǎn)化DNA重排頻率高,并經(jīng)常以多拷貝形式插入試述動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法并比較它們的優(yōu)缺點(diǎn)：1） 逆轉(zhuǎn)錄病毒法逆轉(zhuǎn)錄病毒法是將外源目的基因和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組，再使之包裝成為高滴度病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的。攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA依靠逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶與其末端特異性核苷酸序列可以整合到宿主染色體上，經(jīng)過(guò)雜交篩選即可獲得含有目的基因的動(dòng)

100%)100%)缺點(diǎn)：病毒載體可能從整合位點(diǎn)上脫洛，恢復(fù)病毒特性，對(duì)佰主細(xì)胞的功能造成影響，甚至使動(dòng)物死亡LTRTLTRTEag~polenvLTR逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建技術(shù)路線gagpolenv+LTRAtrE+外源基因缺失病毒蛋白和調(diào)控區(qū)D17細(xì)胞引入病毒蛋白編碼區(qū)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建技術(shù)路線gagpolenv+LTRAtrE+外源基因缺失病毒蛋白和調(diào)控區(qū)D17細(xì)胞引入病毒蛋白編碼區(qū)插入外源基因感染目的細(xì)2）體細(xì)胞核移植法將外源目的基因?qū)肽軅鞔囵B(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞（包括動(dòng)物成體體細(xì)胞、胎體成纖維細(xì)胞等）,以這些動(dòng)物體細(xì)胞為核供體，通過(guò)顯微操作或電融合使核供體與相應(yīng)的核受體（去核的原核胚或成熟的卵母細(xì)胞）不經(jīng)過(guò)有性繁殖過(guò)程，在體外直接進(jìn)行重組融合，對(duì)重組的胚進(jìn)行胚胎移植，進(jìn)而得到帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)點(diǎn)：（1）基因轉(zhuǎn)移效率高，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代數(shù)目也迅速擴(kuò)增，所需動(dòng)物數(shù)大幅度減少,比顯微注射法所需動(dòng)物數(shù)減少2.5倍；（2） 在胚胎移植之前，它就篩選陽(yáng)性細(xì)胞作為核供體，這樣核移植產(chǎn)生的胚胎為陽(yáng)性，最終產(chǎn)生的后代個(gè)體100%為轉(zhuǎn)基因個(gè)體；（3） 可以預(yù)先選擇雄性或雌性性別克隆，從而預(yù)定胚胎和后代的性別；可以實(shí)現(xiàn)大片段基因的轉(zhuǎn)移。顯微注射法在顯微操作儀下用極細(xì)的微吸管將在體外構(gòu)建的外源目的基因注射到處于原核時(shí)期的受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖過(guò)程中通過(guò)DNA的復(fù)制而整合到動(dòng)物基因組中，再通過(guò)胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體的子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，進(jìn)而得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。缺點(diǎn)：(1)外源基因整合的效率低(尤其是大家畜)；(2)不能控制轉(zhuǎn)基因的整合位點(diǎn)；(3)整合的拷貝數(shù)未知；一個(gè)轉(zhuǎn)基因可形成幾個(gè)基因型或顯型的品系；顯微操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、技術(shù)性強(qiáng);胚胎高死亡率與大型農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物原核的定位困難。胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell ,ES)是從哺乳動(dòng)物早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (innercellmass，ICM)中分離出來(lái)的一種二倍體細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)并保持全能分化的潛能，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下可形成胚系集落。將外源目的基因轉(zhuǎn)移到 ES細(xì)胞中，外源基因整合到ES細(xì)胞的基因組中，把ES細(xì)胞移入胚泡期的胚胎，再把這樣的胚胎移植到假孕的代孕子宮內(nèi)發(fā)育，產(chǎn)生出嵌合體動(dòng)物，進(jìn)一步獲得生殖系攜帶外源基因的純合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。5)精子載體法它是直接用精子作為外源DNA的載體，精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)時(shí)，外源DNA可直接進(jìn)入精子頭部，通過(guò)受精將外源基因引入動(dòng)物細(xì)胞中。優(yōu)點(diǎn)：(1)胞質(zhì)內(nèi)顯微注射使用的微注射針大，能處理較大的DNA片段，如酵母或哺乳動(dòng)物人工染色體；2）對(duì)大型農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物如牛、豬等而言，其合子是不透明的，原核不易見(jiàn)，原核顯微注射較為困難，應(yīng)用該法可克服此缺陷；（3）不同物種中，精子可以保存并且能支持完全發(fā)育；（4）將精子與幾種不同外源目的基因共注射，可通過(guò)單次注射獲得同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的胚胎?？傮w看來(lái)，仍不是十分理想，效率較低。原核注射法是最常用和獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最多的經(jīng)典方法；反轉(zhuǎn)錄病毒載體法在禽類基因轉(zhuǎn)移上應(yīng)用較多，效果較好；經(jīng)膜處理精子胞漿微注射法結(jié)合了原核微注射和精子載體法各自的長(zhǎng)處；ES細(xì)胞介導(dǎo)法是和基因定位整合相結(jié)合的方法，可以克服外源基因隨機(jī)整合所帶來(lái)的一些弊端，而且可在體外條件下對(duì)外源基因的表達(dá)進(jìn)行篩選。southernblot 的原理與應(yīng)用（談?wù)労怂犭s交的基本原理，并舉例說(shuō)明Southernblot在基因工程中的應(yīng)用。）1）核酸分子雜交的原理：堿基的互補(bǔ)配對(duì)，雙鏈DNA在一定條件下能夠變性和復(fù)性。Southern雜交技術(shù)由E.Southern于1975年發(fā)明，它現(xiàn)在是基因分離和鑒定中不可缺少的一個(gè)重要手段。待分析的基因組DNA或其它DNA首先用一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶消化，消化后的DNA片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳按照分子量的大小進(jìn)行分離，凝膠經(jīng)堿變性處理，將DNA分子變性成單鏈，經(jīng)毛細(xì)管作用或物理方法將凝膠中的單鏈DNA分子從膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上（一般使用的是尼龍膜和纖維素膜）。然后用標(biāo)記的DNA或RNA探針對(duì)附著于膜上的DNA進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，與探針有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通過(guò)特定的檢測(cè)方法如放射自顯影或顯色而顯示。Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于很多原因,其中包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以與探針與目的DNA之間的配對(duì)情況等。2）SouthernBlot應(yīng)用：（1）可用來(lái)檢測(cè)基因序列的同源性，可以分析轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的轉(zhuǎn)基因在基因組上出現(xiàn)的情況，可以確定外源基因在植物中的組織結(jié)構(gòu)，外源DNA整合的位置與拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)基因植株F1世代外源基因的穩(wěn)定性等（2）遺傳病診斷，DNA圖譜分析，檢測(cè)樣品中的DNA與其含量，PCR產(chǎn)物分析等；繪制物理圖，同源性、重組、變異的研究（3）基因工程中的應(yīng)用：可以精確的檢驗(yàn)出微量DNA分子，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中目標(biāo)DNA的含量以與檢驗(yàn)出轉(zhuǎn)基因是否成功等等。老師的舉例：通過(guò)對(duì)小麥的異源多倍體進(jìn)行southernblot，判斷對(duì)probe對(duì)應(yīng)的DNA進(jìn)行物理定位。3）如何判斷轉(zhuǎn)移是否完全：轉(zhuǎn)移DNA以后將膠重新染色,看是否還有DNA在膠上.片斷太大,轉(zhuǎn)移時(shí)毛細(xì)管作用失敗即溶液不是通過(guò)膠上移等如果想通過(guò)PCR技術(shù)從一個(gè)生物基因組中擴(kuò)增一個(gè)約500bp的基因片段，再和載體連接克隆，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，請(qǐng)描述其克隆過(guò)程（包括檢測(cè)）。1）先從該生物的基因組中獲得目的片段，利用特異的限制性核酸內(nèi)切酶消化基因組，并凝膠電泳分離得到目的片段2） 針對(duì)該目的片段設(shè)計(jì)特異的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增并富集該片段3） 電泳檢測(cè)PCR結(jié)果4）將目的片段連接到相關(guān)載體上5）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中，并在含有氨芐青霉素的固體 LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，加入少量X-gal涂布于培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)后篩選出白色菌落6）篩選：抗生素抗性篩選（單抗性/雙抗性）、菌落PCR+雙酶切+測(cè)序/藍(lán)白斑/菌落原位雜交/雙抗性篩選比較在大腸桿菌、植物和動(dòng)物個(gè)體中表達(dá)真核生物基因時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌優(yōu)缺點(diǎn)：大腸桿菌優(yōu)點(diǎn):（1）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生理生化和遺傳背景知識(shí)，尤其是其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制有了清楚的了解；（2）易于大規(guī)模培養(yǎng)，成本低廉；（3）經(jīng)過(guò)了遺傳改造，已發(fā)展為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，擁有各種不同的菌株和載體系列。缺點(diǎn)（表達(dá)真核基因的障礙）:（1）真核基因具有內(nèi)含子，所以只能用其 cDNA；（2）許多真核生物基因僅在大腸桿菌中合成無(wú)特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈；（3）許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)受翻譯后的加工修飾，而大腸桿菌缺乏蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)；（4）大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶易降解外來(lái)的真核生物基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子；（5）大腸桿菌細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，痕量的內(nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。植物優(yōu)點(diǎn)：1）生物發(fā)酵系統(tǒng)不能對(duì)真核蛋白質(zhì)疫苗進(jìn)行正確的翻譯后加工，而植物與動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后加工2）細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中常產(chǎn)生一些不溶性聚合物，其要重新溶解并折疊成天然蛋白質(zhì)則需要很高的成本，且發(fā)酵需要龐大設(shè)備投資，動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，常用動(dòng)物病毒作為載體導(dǎo)入外源基因，在生產(chǎn)過(guò)程中也可能污染動(dòng)物病毒。植物作為反應(yīng)器則不會(huì)污染動(dòng)物病毒，而且可以在大田大規(guī)模種植，成本低廉。3）易于大面積種植，成本低，收割、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏和加工過(guò)程和傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)無(wú)異；具有天然的蛋白存儲(chǔ)器官，無(wú)需冷連系統(tǒng)設(shè)備進(jìn)行儲(chǔ)藏運(yùn)輸，故易于長(zhǎng)距離運(yùn)輸和普與推廣。4）轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可通過(guò)植物雜交的方法進(jìn)行基因重組而達(dá)到在植物體內(nèi)積累多基因的目的5） 在生產(chǎn)疫苗方面：A.生產(chǎn)的疫苗或其他功能蛋白，可供人直接服用或飼喂動(dòng)物，不需要分離提純。這樣可節(jié)約許多儀器設(shè)備，降低生產(chǎn)成本，使用方便。 B.提供營(yíng)養(yǎng)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的口服疫苗，不僅提供了疫苗，而且提供了營(yíng)養(yǎng)。 C.粘膜免疫是病毒性腹瀉的免疫保護(hù)機(jī)制，但在啟動(dòng)粘膜免疫方面尚屬難題。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是可以啟動(dòng)粘膜免疫的有效途徑。6）可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因增加植物代謝途徑產(chǎn)生的有用的次生代謝產(chǎn)物缺點(diǎn)：1） 生物安全性：例如轉(zhuǎn)基因植物中的除草劑基因轉(zhuǎn)移到野生種中可能產(chǎn)生超級(jí)雜草，抗病毒基因逃逸到其他微生物中可能產(chǎn)生超級(jí)病毒，目標(biāo)生物體對(duì)藥物產(chǎn)生抗性，轉(zhuǎn)基因與其產(chǎn)物在環(huán)境中的殘留。再如，人們食用的某些帶有