基因工程的基本操作程序新XXXX

1、結合圖，判斷下列有關基因工程的工具酶功能的敘述，正確的是()。A．切斷a處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶B．連接a處的酶為DNA聚合酶C．切斷b處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶D．切斷c處的為限制性核酸內(nèi)切酶cADNA連接酶解旋酶DNA水解酶1.2基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達載體的構建三、將目的基因?qū)胧荏w細胞四、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結構基因2、獲取方法：1、目的基因:1）從基因文庫中獲取目的基因1）從基因文庫中獲取目的基因：⑴基因文庫:

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)⑵分類：①基因組文庫:包含了一種生物所有的基因的基因文庫。構建方法：限制酶切法②部分基因文庫（如cDNA文庫):包含了一種生物的一部分基因的基因文庫。構建方法：逆轉(zhuǎn)錄法限制酶切法（鳥槍法或散彈射擊法）

用限制酶切斷成許多片段某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫中獲取目的基因限制酶與運載體連接導入基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接導入部分基因文庫（cDNA文庫）外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG一個典型的原核細胞基因結構示意圖非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)TCCAGTAGGTCAAGATCTmRNA多肽鏈與RNA聚合酶結合位點外顯子內(nèi)含子12345編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄mRNA前體加工成熟mRNA翻譯肽鏈一個典型的真核細胞基因結構示意圖一、目的基基因的獲取取主要是編碼碼蛋白質(zhì)的的結構基因2、獲取方方法：1、目的基基因:1）從基因因文庫中獲獲取目的基基因2）利用PCR技術術擴增目的的基因2、利用PCR技術擴增增目的基因因①概念：：聚合酶鏈式式反應，在生物體體外復制特特定DNA片段的核核酸合成技技術。可以以獲得大量量的目的基基因。③條件：_______________________、_______________、___________(做啟動子子)、___________.②原理：：__________DNA復復制模板DNA四種脫氧氧核苷酸酸一對引物物熱穩(wěn)定DNA聚聚合酶利用PCR技術術擴增循環(huán)變性退火延伸⑤方式：：以_____方方式擴增增，即____（n為為擴增循循環(huán)的次數(shù)數(shù)）指數(shù)2n利用PCR技術術擴增目目的基因因④過程：使目的基因因的片段在在短時間間內(nèi)成百百萬倍地地擴增⑥結果：：①：加熱熱至90～95℃，使使DNA解旋；；②：冷卻卻到55～60℃，2個引物物分別與與DNA單鏈結結合；③：加熱熱至70～75℃，熱熱穩(wěn)定DNA聚聚合酶開開始互補補鏈的合合成。氫鍵斷裂與體內(nèi)DNA復復制的區(qū)區(qū)別：①：不需需要解旋旋酶；②：需加加入引物物（前提：：已知目目的基因因的核苷苷酸序列列，以便便合成引引物）③：需熱熱穩(wěn)定DNA聚聚合酶(Taq酶酶)；與體內(nèi)DNA復復制的相相同點：：(1)模模板：均均需要脫脫氧核苷苷酸雙鏈鏈作為模模板(2)原原料：均均為四種種脫氧核核苷酸(3)酶酶：均需需DNA聚合酶酶(4)引引物：都都需要引引物，使DNA聚合酶酶從引物物的3′′端開始始連接脫脫氧核苷苷酸一、目的的基因的的獲取主要是編編碼蛋白白質(zhì)的結構基因因2、獲取取方法：：1、目的的基因:3）化學學方法人人工合成成——DNA合合成儀1）從基基因文庫庫中獲取取目的基基因2）利用用PCR技術擴擴增目的的基因3、人人工合成成法在基因較較小，核核苷酸序序列已知知的前提下，可以利利用DNA合成成儀人工工合成蛋白質(zhì)的的氨基酸酸序列mRNA的核苷苷酸序列列基因的核苷酸酸序列目的基因化學合成推測推測思考：化學法合成的的目的基因含含內(nèi)含子、啟動動子和終止子子嗎？二.基因表達達載體的構建建1、載體構建目的：2、基因表達達載體的組成成啟動子+目的的基因+終止止子+標記基基因-----------核心（P11）同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。使目的基因在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，表達載體啟動子：終止子：①位置:首端②本質(zhì):DNA③功能:有與RNA聚聚合酶結合的位點點，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄①位置:尾端②本質(zhì):能終止轉(zhuǎn)錄3、基因表達達載體的構建建過程特別提醒該過程把三種種工具(兩種種工具酶、一一種載體)全全用上了，是是最核心、最關關鍵的一步，在體體外進行。思考：如果用同一種種限制性內(nèi)切切酶，處理質(zhì)質(zhì)粒和目的基基因，并將產(chǎn)產(chǎn)物放在一起起用連接酶連連接它們，最最后可以產(chǎn)生生多少種環(huán)狀狀的DNA分分子？你認為它們是是怎么組成的的？三、將目的基基因?qū)胧荏w體細胞2、將目的基基因?qū)胧荏w體細胞的原理理：借鑒細菌或病毒侵侵染細胞的途徑。1、常用的受受體細胞：動物、植物、、微生物。（1）.將目目的基因?qū)肴胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法三、將目的基基因?qū)胧荏w體細胞三、將目的基基因?qū)胧荏w體細胞——最常用方法、經(jīng)濟有有效3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進入受體細胞內(nèi)并并在受體細胞胞中維持穩(wěn)定和表表達的過程。4、轉(zhuǎn)化的方方法：1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法⑴適用范圍：雙子葉植物和裸子植物；(2)原理：：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受受體細胞，并并整合到受體體細胞染色體體的DNA上上。三、目的基因因?qū)胧荏w細細胞構建基因表達達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細胞導入穩(wěn)定維持和表表達③過程：（1）.將目目的基因?qū)肴胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法2）基因槍法法3）花粉管通通道法三、將目的基基因?qū)胧荏w體細胞三、將目的基基因?qū)胧荏w體細胞——最常用方法、經(jīng)濟濟有效——單子葉葉植物常用用、準確但但成本高——我國獨獨創(chuàng)、簡便經(jīng)濟3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進入受體細胞內(nèi)內(nèi)并在受體體細胞中維持穩(wěn)定和和表達的過程。4、轉(zhuǎn)化的的方法：（2）.將將目的基因因?qū)雱游镂锛毎?----顯微注射射技術2）將目的的基因?qū)肴雱游锛毎?.方法：：顯微注射技技術2.受體細細胞：受精卵3.程序:目的基因表表達載體提提純?nèi)∪÷眩ㄊ芫眩╋@顯微注射受受精卵新新性狀動動物（1）.將將目的基因因?qū)胫参镂锛毎?）農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化法2）基因槍槍法3）花粉管管通道法三、將目的的基因?qū)肴胧荏w細胞胞三、將目的的基因?qū)肴胧荏w細胞胞（2）.將將目的基因因?qū)雱游镂锛毎?）.將將目的基因因?qū)胛⑸锛毎?----Ca2+處理-----顯微注射射技術——最常用方法、經(jīng)濟濟有效——單子葉葉植物常用用、準確但但成本高——我國獨獨創(chuàng)、簡便經(jīng)濟3、轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進入受體細胞內(nèi)內(nèi)并在受體體細胞中維持穩(wěn)定和和表達的過程。4、轉(zhuǎn)化的的方法：3)將目的的基因?qū)肴胛⑸锛毤毎傥⑸镒魇苁荏w細胞原原因：繁殖快、多多為單細胞胞、遺傳物物質(zhì)相對少少②常用菌：：大腸桿菌③常用法：：Ca2+處理獲得感感受態(tài)細胞胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞吸收DNA表達載體與感受態(tài)細胞混合方法受體細胞其他處理或特點植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法體細胞、受精卵植物組織培養(yǎng)（脫分化和再分化）動物細胞顯微注射法受精卵動物細胞培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植或胚胎分割移植微生物細胞Ca2+處理法（感受態(tài)細胞）原核細胞繁殖快，多為單細胞，遺傳物質(zhì)少（農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的的T-DNA的特點點：即能進進入受體細細胞，又能與受體體細胞的染染色體DNA整合））雙子葉、裸裸子四、目的基基因的檢測測與鑒定導入過程完完成后，全全部受體細細胞都能攝攝入入重組DNA分子嗎嗎？1真正能攝入入重組DNA分子的的受體細胞胞很少。2目的基因進進入受體細細胞后，是是否都能穩(wěn)穩(wěn)定維持和和表達？不一定，需需要檢測四、目的基基因的檢測測與鑒定1、分子水水平檢檢測——2、個體水水平鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基基因生物染染色體的DNA上是否插入入了目的基基因②檢測目的的基因是否否轉(zhuǎn)錄出了了mRNA③檢測目的的基因是否否翻譯成蛋蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、、抗病鑒定定、活性鑒鑒定等DNA分子子雜交DNA-RNA分子子雜交抗原—抗體體雜交轉(zhuǎn)基因生物的DNA含目的基因因的DNA單鏈為探針15N15N14N14N基因探針：：放射性同位位素等標記記的DNA分子方法——DNA分子子雜交技術術變性變性DNA分子子雜交示意意圖用DNA分分子雜交技技術可鑒定定兩個物種種之間的親親緣關系的的遠近。將兩種生物物的DNA分子的單單鏈放在一一起，如果果這兩個單單鏈具有互互補的堿基基序列，那那么，互補補的堿基序序列就會結結合在一起起，形成雜雜合雙鏈區(qū)區(qū)；在沒有有互補堿基基序列的部部位，仍然然是兩條游游離的單鏈鏈。如果雜合部部位多，則則親緣關系系近，反之之則遠。1、鑒定———分子水平的的鑒定變性方法——分子雜交技技術（2）檢測測目的基因因是否轉(zhuǎn)錄錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物物的mRNA14N14N1、鑒定———分子水平的的鑒定提?。?）檢測測目的基因因是否翻譯譯成蛋白質(zhì)質(zhì)方法——抗抗原-抗體體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋蛋白將Bt毒蛋蛋白注射小小鼠體內(nèi)從小鼠血管管抽出血液液分離出抗抗Bt毒素素的抗體抗體蛋白質(zhì)出現(xiàn)雜交帶帶脫分化組織培養(yǎng)2、鑒定———個體水平的的鑒定抗蟲、抗病病接種實驗驗，活性比比較實驗例：用棉鈴鈴飼喂棉鈴鈴蟲，如蟲蟲吃后不出出現(xiàn)中毒癥癥狀，說明明未攝入目目的基因或或攝入目的的基因未表表達。如蟲蟲吃后中毒毒死亡，則則說明攝入入了抗蟲基基因并得到到表達。四、目的基基因的檢測測與鑒定1、分子水水平檢檢測——2、個體水水平鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基基因生物染染色體的DNA上是否插入入了目的基基因②檢測目的的基因是否否轉(zhuǎn)錄出了了mRNA③檢測目的的基因是否否翻譯成蛋蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、、抗病鑒定定、活性鑒鑒定等DNA分子子雜交DNA-RNA分子子雜交抗原—抗體體雜交考法方法過程導入檢測外源基因是否與受體細胞的染色體整合DNA分子雜交用放射性同位素或熒光分子標記的目的基因的單鏈做探針，與轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶。表達檢測是否轉(zhuǎn)錄分子雜交用放射性同位素或熒光分子標記的目的基因的單鏈做探針，與轉(zhuǎn)基因生物細胞中的mRNA雜交，觀察是否出現(xiàn)雜交帶。表達檢測是否翻譯抗原-抗體雜交從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原－抗體雜交，觀察是否出現(xiàn)反應。個體水平檢測比較簡單的方法抗蟲或抗病實驗如，轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀，讓害蟲食用轉(zhuǎn)基因植物的葉片，觀察其是否死亡?；蚬こ痰牡幕静僮髯鞒绦蚰康幕虻牡墨@取基因表達載載體的構建建將目的基因因?qū)胧荏w體細胞目的基因的的檢測與鑒鑒定1、從基因因文庫中獲獲取目的基基因2、利用PCR技術術擴增目的的基因3、化學方方法人工合合成目的基因+啟動動子+終終止子+標記記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化化法、基因因槍法、花花粉管通道道法、顯微注射法法、Ca2+處理法DNA分子子雜交技術術DNA-RNA分子子雜交技術術抗原—抗體體雜交技術術個體水平鑒鑒定分子檢測鞏固練習:1.人們常常選用的細細菌質(zhì)粒分分子往往帶帶有一個抗抗生素抗性性基因,該該抗性基因因的主要作作用是()A.提高受受體細胞在在自然環(huán)境境中的耐藥藥性B.有利于于對目的基基因是否導導入進行檢檢測C.增加質(zhì)質(zhì)粒分子的的分子量D.便于與與外源基因因連接2.在遺傳傳工程技術術中,限制制性內(nèi)切酶酶主要用于于()A.目的基基因的提取取和導入B.目的基基因的提取取和檢測C.目的基基因與載體體的結合和和導入D.目的基基因的提取取與載體結結合BD3.在遺傳傳工程技術術中,下列列何種目的的基因一般般以直接分分離的方法法獲得()A.人的胰胰島素基因因B.蠶的的蠶絲蛋白白基因C.芽孢桿桿菌的抗蟲蟲基因D.菜豆儲儲藏蛋白基基因4.1976年年,美美國的的科學學家首首次將將人的的生長長抑制制素釋釋放因因子的的基因因轉(zhuǎn)移移到大大腸桿桿菌,并獲獲得了了表達達,此此文中中的表表達是是指該該基因因在大大腸桿桿菌()A.能能進行行DNA復復制B.能能傳遞遞給細細菌后后代C.能能合成成生長長抑制制素釋釋放因因子D.能能合成成人的的生長長素CC5.基基因工工程是是在DNA分子子水平平上進進行設設計施施工的的,在在基因因操作作的基基本步步驟中中,不不進行行減基基互補補配對對的步步驟是是()A.人人工合合成目目的基基因B.目目的基基因與與載體體結合合C.將將目的的基因因?qū)肴胧荏w體細胞胞D.目目的基基因的的檢測測和表表達C原核生生物基基因表表達的的調(diào)控控ＲＰＯlacZlacYlacA調(diào)節(jié)基基因因啟動子子操縱基基因因結構基基因因RNA聚合合酶信使RNA轉(zhuǎn)錄錄翻譯譯阻抑物物乳糖轉(zhuǎn)錄錄半乳糖糖苷酶酶酶酶1、下下列四四條DNA