藥物敏感性試驗(yàn)方法

2023/1/141藥物敏感性試驗(yàn)方法

(AntimicrobialSusceptibilityTest)

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室楊啟文2023/1/142何時需進(jìn)行細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)？

當(dāng)一細(xì)菌是需要抗微生物藥治療的某感染過程的病原菌，而其敏感性不能從細(xì)菌的種屬特性可靠地推知時，就需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 當(dāng)病原菌被認(rèn)為是屬于對常用抗生素能產(chǎn)生耐藥的菌種時，更需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。2023/1/143何時不需進(jìn)行細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)？若感染的性質(zhì)不清楚、標(biāo)本含數(shù)種混合生長的菌或正常菌群，而且這些菌與正在治療的感染關(guān)系很小時，通常不必作藥敏試驗(yàn)，因?yàn)槠鋵?shí)驗(yàn)結(jié)果可能有誤導(dǎo)作用。若感染是由公認(rèn)的對高效藥物敏感的微生物引起，就很少需要作藥敏試驗(yàn)。2023/1/144SelectiveReportingEachlaboratoryshoulddecidewhichagentsinthetablestoreportroutinely(GroupA)andwhichmightbereportedonlyselectively(fromGroupB),inconsultationwiththeinfectiousdiseasepractitionersandthepharmacy,aswellasthepharmacyandtherapeuticsandinfectioncontrolcommitteesofthemedicalstaffofthehospital.

CLCIM100-s152023/1/145菌－－藥敏方法

測試菌藥敏方法普通需氧菌和兼性厭氧菌紙片擴(kuò)散法(M2-A8)苛養(yǎng)菌瓊脂稀釋法

厭氧菌稀釋法

(M7-A6)宏量(2ml)

肉湯稀釋法微量(0.1ml)2023/1/146可選用的抗生素B－內(nèi)酰胺類（青霉素類、B-內(nèi)酰胺/B-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥、頭孢類、碳青酶烯類、單環(huán)B-內(nèi)酰胺類）糖肽類（主要針對G+菌）氨基糖苷類大環(huán)內(nèi)酯類（G+菌或苛養(yǎng)的G-菌）四環(huán)素類喹諾酮類磺胺類和甲氧芐啶單一藥物類（氯霉素、克林霉素、利福平、呋喃妥因）2023/1/1472023/1/148A組：常規(guī)首選藥敏試驗(yàn)組合B組：包括一些臨床上重要的，特別是針對醫(yī)院內(nèi)感染的藥物。在下列情況時可以選擇性報(bào)告：(1)對A組同類抗生素耐藥時(2)特定的標(biāo)本來源（如三代頭孢對腦脊液中的腸道桿菌，TMP/SMZ對泌尿道中的分離菌株）（3)多種細(xì)菌感染（4)多部位感染（5)對A組藥過敏、耐受或無效的病例（6)為流行病學(xué)調(diào)查目的向感染控制組報(bào)告。C組：包括某些醫(yī)院需要測試的替代性或補(bǔ)充性抗生素（由于該地區(qū)存在對某些首選藥物耐藥的菌株）。U(Urine)組：僅用于尿道中分離細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)，其他部位的感染不用此組藥物進(jìn)行試驗(yàn)。O(Other)組：可能有臨床使用指征，但在美國不作為常規(guī)測試和報(bào)告。Inv(Investigational)組：目前正在進(jìn)行抗菌活性評估，還未被FDA批準(zhǔn)。2023/1/149試驗(yàn)原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測試藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。－紙片擴(kuò)散法AST2023/1/1410－紙片擴(kuò)散法AST2023/1/1411－紙片擴(kuò)散法AST試劑Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基抗生素藥片接種物（細(xì)菌懸液）2023/1/1412－紙片擴(kuò)散法ASTMH平皿的標(biāo)化（1）厚度4mm（2）pH7.2－7.4（pH過低，氨基糖苷類與大環(huán)內(nèi)脂類失活，青霉素類活性增強(qiáng)）（3）濕度（4）胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶（TMP/SMZ-ATCC29212,抑菌圈≥20mm）（5）二價陽離子含量：影響氨基糖苷類對綠膿桿菌、四環(huán)素對所有細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。過低，活性增強(qiáng)；過高，活性減弱）（6）某些苛養(yǎng)菌，需要在MH瓊脂中添加其他物質(zhì)或使用其他培養(yǎng)基（7）若當(dāng)天不使用，儲存于2-8°C，七天內(nèi)使用。2023/1/1413－紙片擴(kuò)散法AST抗生素藥片（1）－14°C以下冷凍至使用前。B－內(nèi)酰胺類應(yīng)密封包裝并冷凍，某些不穩(wěn)定的藥物（如亞胺培南、頭孢克羅、克拉維酸復(fù)合藥）應(yīng)冷凍保存直至使用。（2）裝有紙片的容器應(yīng)于使用前1-2小時移出冰箱，平衡至室溫才能打開。以防止紙片上冷凝水產(chǎn)生。（3）當(dāng)指示劑變色時，應(yīng)更換干燥劑以防止過于潮濕。2023/1/1414－紙片擴(kuò)散法AST接種物的標(biāo)化（1）接種物制備：生長法（肉湯增菌）直接菌落懸滴法（檢測苛養(yǎng)菌的推薦方法）（2）0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫龋▽τ诖蠖鄶?shù)細(xì)菌：1-2×108CFU/ml)

0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁苤苽洌?/p>

0.5ml0.048mol/L的BaCl2＋99.5ml0.18mol/L的H2SO42023/1/1415－紙片擴(kuò)散法AST操作步驟制備接種物（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┙臃N（15分鐘內(nèi)接種，涂抹均勻）在接種好的瓊脂平板上貼加紙片

孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35°C空氣孵育）

苛養(yǎng)菌5％CO2孵育判度結(jié)果和解釋結(jié)果2023/1/1416－紙片擴(kuò)散法AST判讀結(jié)果將游標(biāo)卡尺置于反轉(zhuǎn)的平板的背面，測量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應(yīng)距離一個黑色不反光的背景數(shù)英寸，并用反射光照明。如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基，則應(yīng)在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測量抑菌圈。如果被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應(yīng)孵育24小時，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內(nèi)有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長。2023/1/1417－紙片擴(kuò)散法AST判讀結(jié)果如果在透明的抑菌圈內(nèi)有任何的單個菌落，則應(yīng)進(jìn)行二次培養(yǎng)，重新鑒定和重新試驗(yàn)。對于變形桿菌屬，在本該十分明顯的抑菌圈內(nèi)的薄紗樣蔓延生長應(yīng)該忽略。對于TMP/SMZ，培養(yǎng)基內(nèi)的藥物拮抗劑可能使細(xì)菌能微弱地生長，應(yīng)忽略微弱生長（生長菌膜的20％或更少），并且應(yīng)測量更為明顯的邊緣來決定抑菌圈的直徑。用加血培養(yǎng)基測試鏈球菌時，應(yīng)測量生長受抑制的區(qū)域，而不是溶血受抑制的區(qū)域。2023/1/1418－紙片擴(kuò)散法AST解釋結(jié)果抑菌圈大小的解釋參閱CLSI/NCCLS文件M100-S15，結(jié)果應(yīng)報(bào)告細(xì)菌對被測藥物敏感、中介或耐藥。敏感－－該菌株所致感染可以用推薦用于此型感染及病原菌的抗生素劑量、進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委?，除非存在禁忌癥。中介－－藥物在生理濃集的部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和

B－內(nèi)酰胺類）或者可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療（如B－內(nèi)酰胺類）。耐藥－－測試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗生素濃度所抑制，臨床治療無效。2023/1/1419北京協(xié)和醫(yī)院2004年1221株eco對TZP的抑菌圈直徑分布2023/1/1420北京協(xié)和醫(yī)院2004年518株aba對IMP的抑菌圈直徑分布2023/1/1421－紙片擴(kuò)散法AST質(zhì)控目的：監(jiān)測藥敏精密度和準(zhǔn)確度；監(jiān)測試劑質(zhì)量；監(jiān)測操作者水平。質(zhì)控菌：ATCC25922、ATCC27853、ATCC25923等只要平均抑菌圈直徑?jīng)]有發(fā)生由于方法錯誤造成的有意義的改變，質(zhì)控培養(yǎng)物就可以一直用于監(jiān)測試驗(yàn)的精密度和準(zhǔn)確度。如果某意外結(jié)果提示該菌株的內(nèi)在敏感性發(fā)生改變，就應(yīng)該換用此質(zhì)控株的新培養(yǎng)物。2023/1/1422－瓊脂稀釋法AST

紙片法稀釋法

經(jīng)濟(jì)、常規(guī)應(yīng)用有定量、較準(zhǔn)確報(bào)告統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)最低抑菌濃度（MIC）只能檢測需氧菌操作復(fù)雜及兼性厭氧菌。不是連續(xù)濃度梯度極易受實(shí)驗(yàn)室條任何細(xì)菌污染都會件影響。影響結(jié)果

2023/1/1423－瓊脂稀釋法AST

請?jiān)O(shè)計(jì)瓊脂稀釋法試驗(yàn)，獲得美羅培南對80株測試大腸桿菌的MIC值。

Q:2023/1/1424－瓊脂稀釋法AST主要材料：MH瓊脂美羅培南藥粉（純度91％）點(diǎn)種器2023/1/1425－瓊脂稀釋法AST

準(zhǔn)備對倍稀釋的藥液準(zhǔn)備菌液制備含抗生素的瓊脂平皿點(diǎn)種菌液

孵育

讀MIC值

2023/1/1426－瓊脂稀釋法AST抗生素用量計(jì)算W=母液濃度×母液體積/藥物純度

=(256ug/ml×25倍)×4ml/0.91母液濃度依各個試驗(yàn)具體情況而定2023/1/1427－瓊脂稀釋法AST對倍稀釋藥液藥物的溶解液和稀釋液參照CLSI/NCCLSM100-S15文件用滅菌蒸餾水稀釋至最低濃度為0.004×25ug/ml(一般比質(zhì)控范圍低限低一個稀釋度）質(zhì)控范圍：ATCC259220.008-0.06ATCC278530.25-12023/1/1428－瓊脂稀釋法AST2023/1/1429－瓊脂稀釋法AST制備含抗生素平皿將1ml抗生素液與24mlMH瓊脂混勻，待其凝固。注意： 瓊脂不可過熱藥液和瓊脂要充分混勻若檢測鏈球菌的敏感性，則推薦MH瓊脂在被高壓滅菌并冷卻后，以無菌手續(xù)加入5％(v/v)脫纖維羊血或馬血并檢測pH。2023/1/1430－瓊脂稀釋法AST菌液的準(zhǔn)備新鮮菌落

0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?08CFU/ml）

1：10稀釋（10