實驗一質粒的提取和鑒定

實驗一質粒的提取和鑒定第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日分子生物學從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質基礎的學科。研究細胞成分的物理、化學的性質和變化以及這些性質和變化與生命現(xiàn)象的關系，如遺傳信息的傳遞，基因的結構、復制、轉錄、翻譯、表達調控和表達產物的生理功能，以及細胞信號的轉導等。第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日基因工程第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日移液器和EP管第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日質粒質粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，獨立于染色體之外的、能自主復制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸物質。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。F質粒(又稱F因子或性質粒)、R質粒(抗藥性因子)和Col質粒(產大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。

能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質粒大多數是經過改造或人工構建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術中重要的工具。第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日分類：單拷貝質粒；多拷貝質粒；緊密控制型；松弛控制型；第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日質粒DNA的提取方法堿裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法；概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理。第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日基本思路培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離質粒DNA(有時還要求純化質粒DNA，根據實驗所需)電泳檢測；第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日堿裂解法的基本原理十二烷基磺酸鈉(SDS)可使細胞膜裂解。經SDS處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開。當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日實驗步驟1、將含有質粒的DNA細菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。取1.5mlLB培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數分鐘，使液體流盡。3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振蕩）。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次，以混勻內容物（千萬不要振蕩），冰浴2分鐘。5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中5-10分鐘，4℃下12000g離心5-10分鐘。6、上清液（450uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積的飽和酚（1:1），充分顛倒混勻，4℃下12000g離心10分鐘。第十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日7、將水相（400uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積酚/氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心10min。8、將水相（350uL）移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。8、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入0.5ml

70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g離心5-10分鐘。9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、將沉淀溶于10μlTE緩沖液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，儲于-20℃冰箱中。第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/L

EDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱溶液I：重懸細菌；葡萄糖：比重大，使細菌不易沉淀；Tris－HCl：緩沖體系；EDTA：螯合金屬離子；第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日溶液Ⅱ0.2mol/L

NaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1％SDS溶液II——破膜，變性基因組DNA和蛋白質；SDS——破膜作用，變性蛋白質；NaOH——破膜，變性基因組DNA；第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日溶液Ⅲ5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。溶液III——中和溶液，復性質粒DNA；第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日酚/氯仿（1:1）酚——變性蛋白質；氯仿——萃取溶液中的酚；分為兩層，上層為水層，下層為酚氯仿混合液。吸取時不要震蕩。第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日乙醇無水乙醇（2倍體積）——沉淀質粒DNA；70%乙醇——洗滌質粒DNA沉淀，除去沉淀中的鹽分；第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日電泳

Electrophoresis

第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日

一、定義

電泳—帶電粒子在直流電場中向著電性相反電極移動的現(xiàn)象。電泳分析技術—利用電泳現(xiàn)象進行物質分離的技術。第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日二、電泳分析技術發(fā)展概況1809年發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年Tiselius自由界面電泳1948年Wieland濾紙電泳1980年

毛細管電泳

(capiliaryelectrophoresis)第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日三、電泳分析技術的分類1.根據被分離樣品的量多少分析電泳制備電泳2.根據電泳電壓的高低常壓電泳0～500V

高壓電泳500～3000V3.根據電泳中是否使用支持物自由電泳—不使用支持物，在溶液中進行。區(qū)帶電泳—使用支持物第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日4.按支持物的物理性狀不同濾紙及其他纖維薄膜電泳，如醋酸纖維素、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳粉末電泳，纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳絲狀電泳，如尼龍絲、人造絲電泳第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日5.按支持物的裝置形式不同平板式電泳垂直板式電泳垂直柱式電泳第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日6.根據電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)連續(xù)pH電泳—指電泳過程中pH保持不變；不連續(xù)pH電泳—指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段也有不同的pH；第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日電泳技術的特點:凡是帶電物質均可應用某一電泳技術進行分離,并可進行定性或定量分析;樣品用量極少;設備簡單;可在常溫進行;操作簡便省時;分辨率高.第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日四、電泳的基本原理一個分子，如能解離或能吸附帶電質點，在電場中便會向正極或負極移動。

第二十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日移動速度——以蛋白質分子為例:F=EQ（Q：有效電荷;E：電位梯度）F’=6rv（F’：摩擦阻力;v：在介質粘度η中半徑為r的顆粒的移動速度）F=F’EQ=6rv

EQv=————6r

第二十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日

遷移率（Mobility)——帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。

VQM==E6r

第二十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日五、影響電泳速度的因素1.電場強度（E）E↑→電流↑→熱效應→支持介質上的水分蒸發(fā)→樣品的熱變性

E↓→電泳速度慢→延長電泳時間→樣品擴散→區(qū)帶模糊不清→分辨率下降2.帶點顆粒的半徑

r↑→阻力↑→電泳速度變慢3.支持物介質——吸附作用；電滲作用；分子篩作用緩沖液

離子強度（I）：I↑→緩沖能力越大→緩沖液所載的分電流增加，而樣品所載的電流相應減少→電泳速度減慢

pH：pH值決定了化合物解離的程度，也決定了質點所帶的凈電荷。第三十頁，共三十三頁，2022年，8月28日電泳在一定電場強度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型(相對分子質量不同的DNA片段泳動速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的DNA，也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。第三十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠從瓊脂中除去帶電