胞外蛋白的檢測方法

胞外蛋白的檢測方法周實際201211986馬曉龍201211984徐杭州201211967內容提要胞外蛋白及其分析方法1

分光光度法342熒光光度法結論胞外蛋白(PN)胞外多聚物(EPS)——由細菌分泌、細菌表面物質的脫落、細菌溶解以及對周圍環(huán)境物質的吸附而產生的分布在細胞表面的高分子物質；——微生物聚集體的重要組成部分；——主要組分多糖(PS)和蛋白質(PN)。胞外蛋白對污泥沉降性能的影響PN——提高污泥表面疏水性；降低污泥表面負電性。PN可以改變微生物表面的性質，從而促進微生物細胞凝聚，利于顆粒污泥的形成。胞外蛋白對重金屬離子的吸附胞外聚合物是生物膜中能有效吸附重金屬離子的關鍵成分,胞外聚合物中存在著大量陰離子基團(羧基、羥基、硫酸根等),對不同類型金屬離子表現(xiàn)出強烈的親和性而胞外多糖和胞外蛋白在胞外聚合物中所占比例很大。長春市南湖天然水環(huán)境中生物膜優(yōu)勢菌種胞外蛋白對鎘的吸附特征及其影響因素。結果表明,胞外蛋白對鎘的吸附過程符合Freundlich熱力學等溫方程?？蒲星把豍N的分析方法PN分析步驟：PN的提取PN的分析。PN提取方法：物理、化學方法,及物化綜合法。國內外報道過提取方法有加熱、超聲、離心和加堿、EDTA等。提取PN方法的操作過程：0.22μm微濾膜過濾，去除PN提取液中的細胞與處理后的污泥樣品各40ml20000r/min高速離心，4℃，30min80℃60min冰水浴35W40min1mol/LNaOH調節(jié)pH至1180℃加熱10min10ml2%EDTA4℃，3h透析膜（6000-8000Da）4℃3h高速離心加熱超聲熱堿EDTAPN分析方法：分光光度法、化學發(fā)光法、紫外光度法、免疫分析法、高效液相色譜法、納米粒子法、等離子體共振法、熒光光度法、共振瑞利散射光譜法、過渡金屬羥基碎片法等。目前應用最多的是分光光度法，其次就是熒光光度法。PN的分光光度分析法

定義：分光光度法是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。

光譜曲線：在分光光度計中，將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到不同波長相對應的吸收強度。如以波長（λ）為橫坐標，吸收強度（A）為縱坐標，就可繪出該物質的吸收光譜曲線。

利用該曲線進行物質定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質的方法，稱為紫外分光光度法。同理可以定義可見光分光光度法。它們都以Lambert-Beer定律為基礎。主要方法在現(xiàn)階段常用的有四種方法：（1）雙縮脈法：蛋白質和CuSO4在強堿性溶液中形成紫紅色絡合物，最大吸收峰位于540nm處，吸光度在一定范圍內和蛋白質濃度成正比。該方法操作簡便，重復性較好。（2）勞里(Lowry)法：該法由O.H.Lowry等人于1951年建立，利用Folin（酚）試劑測定，反應產物最大吸收峰于750nm處。該方法線性范圍較寬。（3）4-哇琳甲酸法(BCA)法：在堿性溶液中蛋白質把Cu2+還原為Cu+，Cu+與蛋白質形成紫紅色絡合物，最大吸收峰位于562nm處。該法靈敏度較高，檢出限為0.02g/L，可定量測定0.5g/L的總蛋白質，但受葡萄糖的干擾較大。（4）染料結合法：（該法簡便快速，應用較多）染料分類：酸性三苯甲烷類染料（考馬斯亮藍等）；酸性占噸染料（藻紅）；羥基蒽醌類染料（茜素紅S）變色酸雙偶氮染料（氯磺酚S等）。

考馬斯亮藍法是目前最常用的方法考馬斯亮藍分光光度法

（1）檢測原理：染料考馬斯亮藍

G250和蛋白質之間形成特異性結合，結合后顯藍色，在

590nm左右具有最大吸收峰。通過測定染料藍色離子的量就可以算出蛋白質的量，通?？梢栽?/p>

595nm處測定吸光度獲得。

（2）儀器與試劑：日本島津UV-2201型分光光度計，試劑為考馬斯亮藍

G250。分析純85%磷酸（W/V）和95%乙醇。

（3）標準蛋白溶液的配制：用長春生物制品研究所生產的人血白蛋白,采用凱氏定氮法測定蛋白含量,準確稀釋成50ug/ml的標準蛋白溶液（4）測定方法：取一定體積樣品（含蛋白質15μg左右，蛋白含量較高的樣品可適當稀釋），補加蒸餾水至0.5ml，加入3.0ml染色液,搖勻,于室溫放置3-5min，同時做清水空白試驗，于595nm處測定吸收度,分別為As和A0，計算ΔA=As-A0

通過實驗，驗證了考馬斯亮藍法具有干擾少、簡便、靈敏、準確等優(yōu)點，而且重復性好。PN的熒光光度分析法熒光——當紫外光照射到某些物質上時，這些物質會發(fā)射出不同顏色和不同強度的可見光；而當紫外光停止照射時，這種光也隨之消失，這種光被稱為熒光。熒光光度法——通過測量樣品的熒光強度,來定量測定許多無機物和有機物。特點：（1）靈敏度高，其檢測限可達1O-12

（2）檢測限低,可達ng﹒ml-1

級

（3）線性范圍大

（4）選擇性好，適合測定復雜、微量的環(huán)境樣品PN熒光光度分析法原理：蛋白質的熒光很弱，僅通過測定本身的熒光很難確定蛋白質的各種信息。但將蛋白質進行熒光探針作用后熒光強度可能會急劇增強或減弱，并在一定范圍內與蛋白質含量成正比，據此即可定量分析蛋白質。熒光探針：一、大部分是一些熒光染料：耐爾藍、甲酚藍、吖啶紅、卟啉、耐爾紅等。二、某些納米粒子也可作為熒光探針：其熒光壽命長，光穩(wěn)定性高。半導體納米晶體作為探針，可大大提高分析的靈敏度和選擇性。熒光光度分析法——染料法原理：某些熒光染料在表面活性劑存在下，可自聚為二聚體，這種二聚體不發(fā)熒光或熒光很弱，當加入的蛋白質與體系中二聚體和表面活性劑作用，會使二聚體逐漸解聚導致熒光增強，熒光強度的增強與蛋白質的濃度成正比，據此來測定蛋白質的含量。染料法研究及應用熒光染料吖啶紅作測定蛋白質的生物探針儀器與試劑：RF-510型熒光光度計；牛血清白蛋白溶液：0.2mg·ml-1、吖啶紅(AR)溶液：用去離子水配成1×10-5mol·L-1；十二烷基磺酸鈉溶液(SDS)：2×10-3mol·L-1

；Tris-HCl緩沖溶液：pH7.7；NaCl溶液:：0.1mol·L-1

；新鮮血樣稀釋500倍后待用。試驗方法：在10ml比色管中加入緩沖溶液1ml，NaCl溶液0.3ml，AR溶液2ml，SDS溶液1.5ml和適量的BSA,放置5min后進行觀察。實驗證實熒光法線性范圍寬、靈敏度高、反應速度快、準確度高、抗干擾能力強。陳洪琪等利用陽離子熒光染料吖啶紅與十二烷基磺酸鈉體系檢測牛血清白蛋白，檢出限為0.06mg/L。沈含熙等改用吖啶橙做熒光探針，發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍踪|加入到吖啶橙非熒光二聚體溶液中，體系的熒光明顯增加，測定牛血清白蛋白檢出限為0.08mg/L。染料法注意事項表面活性劑用量：熒光強度隨表面活性劑濃度增加而降低，再增加則升高，熒光強度最低時應為形成二聚體最佳濃度，一般應低于表面活性劑臨界膠束濃度。離子強度：少量鹽的存在影響不大，但量過大由于鹽效應破壞了二聚體形成的環(huán)境，使之與蛋白質的結合減弱，且空白試驗熒光太強，靈敏度降低?？偨Y隨著人類基因組計劃的提前完成，生物分析技術進入基因時代。生物大分子的檢測方法不斷發(fā)展，成為生命科學的前沿領域。生物大分子是近年來生態(tài)學研究的主要對象之一。環(huán)境污染物對生物體的作用最早必然是從個體內分子水平上開始的，然后逐步在細胞、器官、個體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各個水平上反映出來。因此，能反映這種早期作用的生物大分子標記物在環(huán)境監(jiān)測中具有很大的應用值。與其他研究手段相比，生物大分子具有特異性、預警