分子生物學(xué)第四章

第四章DNA復(fù)制DNA的復(fù)制（replication）是指以原來的DNA分子為模板合成出相同的DNA分子的過程。遺傳信息通過親代DNA分子的復(fù)制傳遞給子代。DNA復(fù)制在保持生物物種遺傳的穩(wěn)定性方面起著重要的作用。DNA復(fù)制和細(xì)胞周期的關(guān)系：DNA復(fù)制是細(xì)胞周期的決定因素，DNA復(fù)制完成以前，細(xì)胞不會(huì)發(fā)生分裂。DNA復(fù)制的完成是細(xì)胞分裂的觸發(fā)點(diǎn)，復(fù)制后的基因組被平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。細(xì)胞周期調(diào)控基因控制DNA的復(fù)制并觸發(fā)細(xì)胞分裂。第一節(jié)復(fù)制概況半保留復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)、方向和方式DNA聚合酶和DNA聚合反應(yīng)復(fù)制的基本過程復(fù)制的半不連續(xù)性一、半保留復(fù)制理論上，DNA的復(fù)制可以采取半保留復(fù)制、全保留復(fù)制和混合復(fù)制（散布式）三種方式。半保留復(fù)制機(jī)制的證明—Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)1958年，MatthewMeselson和FranklinStahl設(shè)計(jì)了一個(gè)很巧妙的實(shí)驗(yàn)，證明了DNA復(fù)制采取半保留復(fù)制機(jī)制。

兩個(gè)子代DNA分子通過細(xì)胞分裂平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中。由于每個(gè)子代細(xì)胞中只有一半的遺傳物質(zhì)是來自親代細(xì)胞，而另一半是新合成的，這種復(fù)制方式被稱為半保留復(fù)制（semiconservativereplication）。15Nlabelingexperiment15Nlabeling:growcellsin??CollectDNA:growcellsin??Separation:method??Resultinterpretation15NlabeledDNAunlabeledDNASemi-conservativemechanism半保留復(fù)制是雙鏈DNA普遍采用的復(fù)制機(jī)制。即使是單鏈DNA分子，在其復(fù)制過程中也要先形成雙鏈的復(fù)制形式。半保留復(fù)制機(jī)制說明了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。半保留復(fù)制作為一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種細(xì)胞組分的參與。同時(shí)為保持遺傳的穩(wěn)定性，要有高度的忠實(shí)性。如:M13phage由于特異單鏈結(jié)合蛋白的作用,只大量合成(+)鏈二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)、方向和方式

DNA復(fù)制的起點(diǎn)

原核生物DNA的復(fù)制是在DNA分子的特定位點(diǎn)開始的，這一位點(diǎn)稱為復(fù)制起點(diǎn)，常用ori來表示。

原核生物的染色體只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從起點(diǎn)開始，進(jìn)行到終點(diǎn)結(jié)束，完成整個(gè)染色體DNA分子的復(fù)制。OriCinE.colichromosomalDNA復(fù)制子（replicon）

復(fù)制子是基因組中能夠獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位。每個(gè)復(fù)制子都有控制復(fù)制開始的復(fù)制起點(diǎn)（origin）以及終止復(fù)制的終點(diǎn)（terminus）。任何起點(diǎn)和終點(diǎn)之間的序列都作為復(fù)制子的一部分參與復(fù)制。

在一個(gè)細(xì)胞周期中，每個(gè)復(fù)制子只啟動(dòng)一次。

原核生物只有一個(gè)復(fù)制子。噬菌體、病毒的DNA也是單復(fù)制子。參與復(fù)制的DNA分子上有兩個(gè)區(qū)域，未復(fù)制的區(qū)域由親代DNA組成，已復(fù)制的區(qū)域由兩條子代鏈組成。復(fù)制正在發(fā)生的位點(diǎn)叫做復(fù)制叉（replicationfork）或生長點(diǎn)（growingpoint）。ReplicatedDNAisseenasareplicationeyeflankedbynonreplicatedDNA.Originscanbemappedbyautoradiographyandelectrophoresis

AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.將一段來自起點(diǎn)的DNA序列與缺失起點(diǎn)的DNA分子克隆到一起，如果來自起點(diǎn)的DNA片段包括一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)所必須具備的序列，它將支持與其連接的任何DNA序列的復(fù)制。由此可以鑒定起點(diǎn)的DNA序列。細(xì)菌、酵母以及葉綠體、線粒體的DNA復(fù)制起點(diǎn)現(xiàn)均已經(jīng)被克隆，其核酸序列也被確定了，它們的共同特點(diǎn)是富含A-T序列。

真核生物DNA的復(fù)制也是從特定的位點(diǎn)開始的，以雙向延伸的方式進(jìn)行，直到終點(diǎn)為止。真核生物DNA的復(fù)制是從多個(gè)位點(diǎn)開始的，所以真核生物的DNA分子上有多個(gè)復(fù)制單位同時(shí)進(jìn)行DNA的復(fù)制。

真核生物的多個(gè)復(fù)制子（replicon）DNA復(fù)制的方向復(fù)制可單向進(jìn)行，也可以雙向進(jìn)行，這取決于在起點(diǎn)有一個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉。Repliconsmaybeunidirectionalorbidirectional,dependingonwhetheroneortworeplicationforksareformedattheorigin.DNA復(fù)制的方向復(fù)制可單向進(jìn)行，也可以雙向進(jìn)行，這取決于在起點(diǎn)有一個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉。Differentdensitiesofradioactivelabelingcanbeusedtodistinguishunidirectionalandbidirectionalreplication.DNA復(fù)制的方式大多數(shù)生物體內(nèi)DNA的復(fù)制都以雙向等速方式進(jìn)行。但枯草桿菌兩個(gè)復(fù)制叉的移動(dòng)是不對(duì)稱的。質(zhì)粒ColEI的復(fù)制完全是單向進(jìn)行的。大多數(shù)生物體內(nèi)的DNA復(fù)制都以對(duì)稱方式進(jìn)行，即DNA分子的兩條鏈同時(shí)復(fù)制。但也有在一定時(shí)期內(nèi)DNA只復(fù)制一條鏈的情況。例如線粒體的D－環(huán)復(fù)制和一些細(xì)菌噬菌體的滾環(huán)復(fù)制方式。D環(huán)復(fù)制原核生物在一個(gè)復(fù)制結(jié)束前,后代復(fù)制已開始

三、DNA聚合酶與DNA聚合反應(yīng)DNA的復(fù)制是由DNA聚合酶（DNApolymerase）負(fù)責(zé)完成的，它具有按照模板的指令在模板鏈上催化新DNA鏈合成的活性。DNA聚合酶是一種模板指導(dǎo)的聚合酶，產(chǎn)物DNA與模板的堿基組成相同。說明在DNA聚合酶的作用下，DNA的兩條鏈都能復(fù)制。

在適量DNA和鎂離子存在下，DNA聚合酶催化4種脫氧核糖核苷酸合成DNA，每次在DNA的3’-OH末端加入一個(gè)核苷酸使DNA鏈由5’向3’方向延長，同時(shí)釋放無機(jī)焦磷酸。四、復(fù)制的基本過程DNA的復(fù)制包括起始、延伸和終止三個(gè)步驟。復(fù)制調(diào)控主要發(fā)生在起始階段，復(fù)制子增殖依賴于起始過程起點(diǎn)處發(fā)生的相互作用。一般復(fù)制開始后，就會(huì)進(jìn)行到底，直到整個(gè)基因組都復(fù)制完畢。五、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性當(dāng)復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)，在兩個(gè)暴露的親鏈上都要進(jìn)行子鏈的合成。但是DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模宜幸阎腄NA聚合酶的合成方向都是5’3’，即新生鏈的方向只能是5’3’。

半不連續(xù)復(fù)制SynthesisofOkazakifragmentsrequirespriming,extension,removalofRNA,gapfilling,andnickligation

第二節(jié)DNA的復(fù)制體系一、復(fù)制體系的鑒定人們一般通過突變體表型的變化來考察基因的功能，如果某個(gè)基因突變導(dǎo)致細(xì)胞DNA不能復(fù)制，就可以說這個(gè)基因與DNA復(fù)制有關(guān)。利用大腸桿菌的溫度敏感突變體已經(jīng)鑒定了一系列的dna基因座。對(duì)參與DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和鑒定的方法有三種：純化、突變、重建。體外互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)是鑒定復(fù)制體系組分的重要手段。二、DNA聚合酶（包括DNA復(fù)制酶及參與復(fù)制的附屬反應(yīng)或損傷DNA的修復(fù)合成）

1大腸桿菌的DNA聚合酶

大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了三種DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。DNA聚合酶Ⅰ參與損傷DNA的修復(fù)，并在半保留復(fù)制中起切除RNA引物的作用。DNA聚合酶Ⅱ也參與修復(fù)。DNA聚合酶Ⅲ是一個(gè)多亞基的蛋白質(zhì)，是合成DNA新鏈的主要復(fù)制酶。DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ是第一個(gè)被鑒定的DNA聚合酶，它是由polA基因編碼的103kDa的單鏈多肽。當(dāng)?shù)孜锖湍０宕嬖跁r(shí)，DNA聚合酶Ⅰ可使脫氧核糖核苷酸依次加到具有3’－OH末端的多核苷酸鏈上。它的催化需要引物鏈（DNA或RNA）的存在。DNA聚合酶Ⅰ是一個(gè)多功能酶，它可以催化以下的反應(yīng)：1、DNA鏈沿5’→3’方向的延長（DNA聚合酶活性）。2、從3’端水解DNA鏈（3’→5’外切核酸酶活性）。3、從5’端水解DNA鏈（5’→3’外切核酸酶活性）。

用蛋白水解酶將DNA聚合酶Ⅰ作有限水解，可得到分子量為68kDa和36kDa的兩個(gè)片段。大片段（68kDa，也叫Klenow片段）在體外可以催化合成反應(yīng)。Klenow片段C端的2/3片段具有聚合酶活性，而N端的1/3片段具有3’→5’外切核酸酶活性。兩個(gè)活性位點(diǎn)的距離為3nm，表明堿基的加入和去除功能在空間上是分開的。DNAPolymeraseI的缺口平移作用體外的切刻移位（nicktranslation）是實(shí)現(xiàn)在DNA分子上引入放射性標(biāo)記核苷酸的重要技術(shù)。

小片段（35KDa）有5’→3’外切核酸酶活性，可以切除少量的核苷酸。該酶片段在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起重要作用。DNA的半不連續(xù)合成中，崗崎片段5’端RNA引物的切除可能也依賴于該外切酶活性。小片段的外切酶活性和大片段的聚合校對(duì)功能協(xié)同作用，使DNA聚合酶Ⅰ具有從切口處起始復(fù)制的獨(dú)特功能。在雙鏈DNA的磷酸二酯鍵斷裂（nick）處，DNA聚合酶Ⅰ可延伸3’末端，合成新的DNA片段后，置換雙螺旋中已有的同源鏈（切口移位）。DNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶Ⅱ是一條分子量為120,000的多肽鏈。這個(gè)酶的活性很低，只有DNA聚合酶Ⅰ的5％。DNA聚合酶Ⅱ也以4種脫氧核糖核苷酸為底物，從5’-3’方向合成DNA。DNA聚合酶Ⅱ具有3’-5’外切核酸酶活性，但無5’-3’外切酶活性。DNA聚合酶Ⅱ在DNA的修復(fù)中起一定作用。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ是真正負(fù)責(zé)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)合成DNA的復(fù)制酶。DNA聚合酶Ⅲ是多亞基組成的蛋白質(zhì)。DNA聚合酶Ⅲ全酶由α、β、γ、δ、ε、θ、τ、δ’、χ和ψ10種不同的亞基組成。DNA聚合酶Ⅲ至少含有3種重要的酶活性。即5’3’DNA聚合酶活性、3’5’外切核酸酶活性和依賴DNA的ATP酶活性。DNA聚合酶Ⅲ不具有5’3’外切核酸酶活性。DNA聚合酶Ⅲ全酶在細(xì)胞中的含量很少，在每個(gè)細(xì)胞中只有10－20個(gè)拷貝的全酶（holoenzyme）。DNA聚合酶Ⅲ含有以下4個(gè)不同的功能組分：1）核心聚合酶（corepolymerase）核心聚合酶由α、ε、θ三種亞基組成。α亞基具有5’-3’方向合成DNA的催化活性。ε亞基具有3’-5’外切核酸酶的校對(duì)功能，控制復(fù)制的忠實(shí)性。ε亞基與α亞基形成一個(gè)緊密的1：1復(fù)合物，協(xié)同發(fā)揮作用。θ亞基促進(jìn)ε亞基的作用。2）β二聚體

β亞基是以二聚體的形式存在的。β二聚體是環(huán)狀的，環(huán)繞著DNA并在DNA上自由滑動(dòng)，構(gòu)成一個(gè)滑動(dòng)鉗?；瑒?dòng)鉗可以把全酶束縛在模板DNA上，從而保證高度的進(jìn)行性。鉗的存在對(duì)于大腸桿菌的高效復(fù)制是十分必要的。POLIII,bsubunitTheβsubunitofDNApolymeraseIIIholoenzymeconsistsofaheadtotaildimer(thetwosubunitsareshowninredandorange)thatformsaringcompletelysurroundingaDNAduplex(showninthecenter).SlidingDNAclampsarefoundacrossallorganismandshareasimilarstructure3）γ復(fù)合物γ復(fù)合物含有5種不同的亞基，形成一種化學(xué)計(jì)量為γ2δ1δ’1χ1ψ1的結(jié)構(gòu)。γ復(fù)合物是β滑動(dòng)鉗的載體，它可以幫助β滑動(dòng)鉗結(jié)合到DNA上，也可從DNA上卸載β滑動(dòng)鉗。γ復(fù)合物有依賴DNA的ATP酶活性。β二聚體自己并不能組裝到DNA上，它是通過γ復(fù)合物與ATP協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上的。γ復(fù)合物是一個(gè)不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，它們相對(duì)兩個(gè)核心聚合酶不對(duì)稱分布使全酶具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致在全酶上兩個(gè)核心聚合酶功能上的不對(duì)稱性。兩個(gè)聚合酶功能上的不對(duì)稱性使DNA兩條鏈合成表現(xiàn)出不同的性質(zhì)。4）τ二聚體

連接蛋白（τ2）可結(jié)合兩個(gè)核心酶分子和一個(gè)γ復(fù)合物。τ亞基是一個(gè)依賴于DNA的ATP酶，τ二聚體可結(jié)合兩個(gè)核心酶，每個(gè)τ亞基結(jié)合一個(gè)核心酶。在一個(gè)分子結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)聚合酶表明復(fù)制性的聚合酶成對(duì)起作用，協(xié)同復(fù)制雙螺旋DNA的兩條鏈。DNA聚合酶Ⅲ全酶的功能是復(fù)制大腸桿菌的染色體。DNA聚合酶Ⅲ與DNA聚合酶Ⅰ的不同之處：(1)DNA聚合酶Ⅲ具有多亞基的結(jié)構(gòu)。(2)聚合反應(yīng)需要ATP的存在。(3)反應(yīng)有很高的速度和高度的進(jìn)行性。ThecompositionoftheDNAPolIIIholoenzyme

2DNA復(fù)制的忠實(shí)性復(fù)制過程的忠實(shí)性是保證生物體遺傳信息準(zhǔn)確傳遞的一個(gè)必要條件，它取決于堿基配對(duì)的專一性。DNA聚合酶可以通過兩種方式提高互補(bǔ)堿基選擇的專一性。第一，通過專一性識(shí)別使即將加入的堿基與模板的堿基嚴(yán)格互補(bǔ)，這種方式用來控制合成前的錯(cuò)誤。第二，當(dāng)發(fā)現(xiàn)存在著錯(cuò)配堿基時(shí)，可切除新加入的堿基，這種方式叫校對(duì)控制。兩種方式既可單獨(dú)起作用，也可共同起作用。復(fù)制過程中堿基配對(duì)受雙重核對(duì)作用控制：聚合酶的選擇作用和3’5’外切核酸酶的校正（proofreading）作用。不同的聚合酶以不同的方式處理聚合與校對(duì)的關(guān)系。DNA聚合酶在復(fù)制過程中造成的錯(cuò)誤除了不正確配對(duì)造成的核苷酸取代外，還包括由于插入或缺失額外的核苷酸造成的框架移位。

3其他生物的聚合酶噬菌體也編碼DNA聚合酶，它們是T4、T5、T7、SPIO1。這些酶都有5’-3’合成酶活性和3’-5’外切校正活性。

真核生物中發(fā)現(xiàn)了5種不同的DNA聚合酶，分別為α、β、γ、δ、ε。α、β、δ、ε位于細(xì)胞核中，而γ是線粒體酶。ExonucleasedomaintemplatephageT7DNApolymerase晶體結(jié)構(gòu)

4DNA聚合酶的引物DNA聚合酶的一個(gè)共同特征是它們只能催化脫氧核糖核苷酸加到已有核酸鏈的游離3’－OH上，而不能從游離核苷酸起始DNA鏈的合成。DNA聚合酶需要引物來提供3’－OH末端，然后在其上加入核苷酸來延伸DNA鏈。通常細(xì)胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通過DNA聚合酶延伸RNA鏈的3’－OH。

5DNA聚合酶催化的分子機(jī)制來源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶甚至RNA聚合酶的聚合酶區(qū)域都有一個(gè)類似手指、手掌和拇指的基本結(jié)構(gòu)，存在相似的折疊結(jié)構(gòu)。通過晶體結(jié)構(gòu)和模型研究發(fā)現(xiàn)，

手指區(qū)域可與未復(fù)制的單鏈模板相互作用，同時(shí)手指區(qū)域的一部分也參與結(jié)合進(jìn)入底物dNTP。

拇指亞區(qū)可與模板－引物DNA雙螺旋相互作用。聚合酶通過保守的氨基酸殘基與引物模板復(fù)合物相互作用使引物的3’末端定位在手掌和手指的會(huì)合點(diǎn)，并與dNTP相對(duì)。Sideview:PolymeraseactivesiteTopviewwithtemplate-primer:PolymerasesiteAndproofreadingsiteDNAPolresembleahandthatgripstheprimer-templatejunction

SchematicdrawingT7DNApolExonucleasedomaintemplatephageT7DNApolymerase晶體結(jié)構(gòu)DNApol的聚合和校對(duì)

研究還發(fā)現(xiàn)，dNTP的進(jìn)入伴隨著兩個(gè)Mg2＋離子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反應(yīng)的雙金屬離子機(jī)制（twometal-ionmechanism)。核苷酸的摻入是受模板指導(dǎo)的，所以DNA聚合酶在每個(gè)催化循環(huán)中都要改變它的核苷酸底物專一性。錯(cuò)誤核苷酸的摻入可引發(fā)DNA聚合酶從DNA合成到校正的轉(zhuǎn)變。三、DNA連接酶

DNA聚合酶只能催化多核苷酸鏈的延長反應(yīng)，不能使鏈與鏈之間連接。

DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5’－磷酸基和3’－羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應(yīng)需要供給能量。大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD作為能量來源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶以ATP作為能量來源。

四、螺旋酶在DNA復(fù)制、修復(fù)、重組以及接合過程中，DNA兩條互補(bǔ)鏈必須部分分開以形成單鏈DNA中間體，即解旋。該過程是由DNA螺旋酶催化完成的。DNA螺旋酶(helicase)是DNA復(fù)制、重組、修復(fù)過程中關(guān)鍵的發(fā)動(dòng)蛋白。螺旋酶具有依賴DNA的ATPase活性，可把ATP水解產(chǎn)生的自由能轉(zhuǎn)化為解旋DNA并使螺旋酶本身沿DNA鏈移動(dòng)的機(jī)械能。DNA螺旋酶都以寡聚體的形式發(fā)揮功能，通常是二聚體或六聚體。每一個(gè)亞基具有一個(gè)潛在的DNA結(jié)合位點(diǎn)，從而每個(gè)螺旋酶分子具有多個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)，這是螺旋酶實(shí)現(xiàn)催化功能的關(guān)鍵。盡管RNA聚合酶也可熔解DNA雙螺旋，但復(fù)制叉是由復(fù)制性的DNA螺旋酶的作用下形成的。

五、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制過程中，DNA雙螺旋的解旋使復(fù)制叉前面產(chǎn)生正超螺旋，將妨礙復(fù)制叉的前進(jìn)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶則可以使超螺旋分子松弛。大腸桿菌中起主要作用的是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，它能夠產(chǎn)生負(fù)超螺旋以抵消復(fù)制叉移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋，防止正超螺旋的積累，使DNA片段以負(fù)超螺旋的形式存在。II型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制

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