第四章 基因工程概論

第四章基因工程概論

目的了解基因工程的概念及研究的內(nèi)容

內(nèi)容基因工程的概念、基本步驟、載體-宿主系統(tǒng)、工具酶與基因工程、目的基因的制備、分子克隆建立和目的基因表達(dá)重點(diǎn)工具酶與基因工程、目的基因的制備

難點(diǎn)分子克隆的建立和目的基因的表達(dá)學(xué)時(shí)3第一節(jié)、基因工程的概念

一、基因工程的概念

基因工程也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。它是一項(xiàng)將生物的某個(gè)基因通過基因載體運(yùn)送到另—種生物的活性細(xì)胞中，并使之無性繁殖(稱之為“克隆”)和行使正常功能(稱之為“表達(dá)”)，從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)技術(shù)。—股說來，基因工程是專指用生物化學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體系統(tǒng)的DNA結(jié)合成—個(gè)復(fù)制子。這樣形成的雜合分子可以在復(fù)制子所在的宿主生物或細(xì)胞中復(fù)制，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，無性繁殖使之成為克隆。然后直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子自轉(zhuǎn)化子分離后再導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物。二、基因工程的基本步驟

基因工程的基本內(nèi)容是有目的地對(duì)遺傳物質(zhì)功能單位進(jìn)行綜合，創(chuàng)造有價(jià)值的生物分子或新的動(dòng)物、植物或微生物品系?；蚬こ痰幕静襟E主要有包括：①

目的基因的制取；②

基因載體的選擇與構(gòu)建；③

目的基因與載體DNA的拼接；④

重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選和無性繁殖(克隆)⑤

外源基因的表達(dá)和產(chǎn)物的分離純化。

第二節(jié)載體-宿主系統(tǒng)

理想的基因工程載體一般至少有以下幾點(diǎn)要求：①能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，而且最好要有較高的自主復(fù)制能力。②容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高越好。③容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這要求載體DNA有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。④容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來，這才便于重組操作。⑤有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞、或攜帶著外來的核酸序列進(jìn)入宿主細(xì)胞都能容易被辨認(rèn)和分離出來。常用的載體有質(zhì)粒，噬菌體和病毒等。一、質(zhì)粒載體

質(zhì)粒是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。質(zhì)粒特點(diǎn)①是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA，可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。②能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)粒可隨宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。③質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。質(zhì)粒分類按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制型質(zhì)粒和松弛控制型質(zhì)粒嚴(yán)緊控制型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；松弛控制型質(zhì)粒，其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。二、噬菌體載體

噬菌體是感染細(xì)菌的一類病毒，有的噬菌體基因組較大，如λ噬菌和T噬菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬菌體等。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。λ噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組是長(zhǎng)約49kb的線性雙鏈DNA分子，組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測(cè)出。λ噬菌體感染時(shí)，通過尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。DNA進(jìn)入大腸桿菌后以其兩端12bp的互補(bǔ)單鏈粘末端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以兩種不同的方式繁殖：①溶菌性方式：在營(yíng)養(yǎng)充足，條件適合細(xì)菌繁殖時(shí)，利用宿主菌中的酶類和原料，λDNA上基因可按調(diào)控的順序表達(dá)合成構(gòu)成噬菌體頭、尾和尾絲所需的各種蛋白質(zhì)，λDNA經(jīng)多次復(fù)制合成許多子代λDNA，于是裝配成許多子代的λ噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的λ噬菌體。②溶原性方式：進(jìn)入細(xì)菌的λDNA可整合入細(xì)菌的染色質(zhì)DNA中，隨細(xì)菌染色體DNA復(fù)制，傳給細(xì)菌后代，這個(gè)穩(wěn)定潛伏在細(xì)菌染色質(zhì)DNA中的λDNA稱為原噬菌體，含有原噬菌體的細(xì)菌稱為溶源菌。λDNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿主DNA中切出，進(jìn)入溶菌性方式的繁殖。λ噬菌體整個(gè)基因組，可分為三個(gè)部分，①左臂：從A到J長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長(zhǎng)約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長(zhǎng)所需的序列。③右臂：長(zhǎng)約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來說，中段是非必需的。

三、動(dòng)物病毒載體質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等第三節(jié)工具酶與基因工程

基因工程的操作．是分子水平上的操作，它是依賴一些重要的酶(如限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶、聚合酶等等)作為工具央對(duì)基因進(jìn)行人工切割和拼接等操作，所以把這些酶稱為工具酶。一、限制性核酸內(nèi)切酶的概念

核酸酶可分為兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶核酸外切酶是從核酸的一端開始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來；核酸內(nèi)切酶則從核酸鏈中間水解3’，5’磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。很多細(xì)菌和細(xì)胞中都能識(shí)別外來的核酸并將其分解，1962年發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)榧?xì)菌中含有特異的核酸內(nèi)切酶,能識(shí)別特定的核酸序列而將核酸切斷;同時(shí)又伴隨有特定的核酸修飾酶,最常見的是甲基化酶,能使細(xì)胞自身核酸特定的序列上堿基甲基化,從而避免受內(nèi)切酶水解,外來核酸沒有這種特異的甲基化修飾,就會(huì)被細(xì)胞的核酸酶所水解.這樣細(xì)胞就構(gòu)成了限制一修飾體系,其功能就是保護(hù)自身的DNA,分解外來的DNA,以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定,這就是限制性核酸內(nèi)切酶名稱中“限制”二字概念的由來。二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名按酶的來源的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語(yǔ)表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。三、限制性核酸內(nèi)切酶的分類按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系，切斷核酸的情況不同，分為三類：Ⅰ類限制性核酸內(nèi)切酶

Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶

Ⅲ類限制性核酸內(nèi)切酶四、限制性核酸內(nèi)切酶的作用大部分限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，切斷的雙鏈DNA都產(chǎn)生5’磷酸基和3’羥基末端。不同限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割的特異性不同，結(jié)果有三種不同的情況：1.產(chǎn)生3’突出粘性末端2.產(chǎn)生5’突出的粘性末端：3.產(chǎn)生平末端第四節(jié)目的基因的制備基因工程主要是通過人工的方法，分離、改造、擴(kuò)增并表達(dá)生物的特定基因，從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價(jià)值的基因產(chǎn)物。通常我們把插入在載體內(nèi)的那個(gè)特定的片段基因稱為“外源基因”，而將那些已被或者準(zhǔn)備要被分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段，稱為“目的基因”。隨著生物化學(xué)、分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包括基因工程技術(shù)本身的進(jìn)步，如今已有很多基因被分離出來。目前主要應(yīng)用化學(xué)合成法、物理化學(xué)法(加密度梯度離心法、單鏈酶法、分子雜交法)、鳥槍無性繁殖法、酶促合成(逆轉(zhuǎn)錄)法等。一、鳥槍法這是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法或酶化學(xué)方法將生物細(xì)胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，獲得無性繁殖的基因文庫(kù)，再結(jié)合篩選方法，從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。這種方法也就是應(yīng)用基因工程技術(shù)分離目的基因，其持點(diǎn)是繞過直接分離出基因的難關(guān)、在基因組DNA文庫(kù)中篩選出目的基因?？梢哉f這是利用“溜散彈射擊”原理去‘命中”某個(gè)基因。由于目的基因在整個(gè)基因組中太少太小，在相當(dāng)程度上還得靠“碰運(yùn)氣”，所以人們稱這個(gè)方法為”鳥槍法”或“散彈槍”實(shí)驗(yàn)法。二、物理化學(xué)法1．物理化學(xué)法分離基因的基本原理從幾個(gè)方面來利用核酸DNA雙螺旋之間存在著減基G和C配對(duì)、A和T配對(duì)的這一特性，以達(dá)到從生物基因組分離目的基因的目的。2．物理化學(xué)法分由基因的主要方法物理化學(xué)法分離基因目前主要有：①密度梯度離心法，②單鏈酶法．③分了雜交法密度梯度離心法：堿基G-C配對(duì)的雙鏈DNA片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術(shù)可使切割適當(dāng)片段的不同DNA按密度大小分布開來。進(jìn)而通過與某種放射性標(biāo)記的mRNA雜交來檢驗(yàn)，分離相應(yīng)的基因。單鏈酶法：

堿基G-C配對(duì)之間有三個(gè)氫鍵，A-T配對(duì)之間有二個(gè)氫鍵，G-C配對(duì)比A-T配對(duì)的穩(wěn)定性高。當(dāng)用加熱或其他變性試劑處理DNA時(shí)，雙鏈上A-T配對(duì)較多的部位先變成單鏈。應(yīng)用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，再經(jīng)氯化艷超速離心，獲得無單鏈切口的DNA。分子雜交法：?jiǎn)捂淒NA與其互補(bǔ)的序列總有“配對(duì)成雙”的傾向，這就是分子雜交的原理。利用分子雜交的基本原理(如DNA：DNA配對(duì)或者DNA：RNA配對(duì))既可以分離又可以鑒別某一基因。三、化學(xué)合成基因如果已知某種基因的核苷酸系列，或者根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列，仔細(xì)選擇密碼子，可以推導(dǎo)出該多肽編碼基因的核苷酸序列，就可以將核苷酸或寡核苷酸片段，一個(gè)一個(gè)地或一片段一片段地縮合起來，成為一個(gè)一個(gè)基因的核苷酸片段。為了保證定向合成，需要將一個(gè)分子的5`末端與另一個(gè)分子的3`末端封閉保護(hù)。這種封閉可用磷酸化等方法，必要時(shí)可以酸或堿解除封閉。四、酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法即利用逆轉(zhuǎn)錄酶由mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的方法。主要用于合成分于量較大而又不知其序列的基因。這種方法是以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的DNA，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合后轉(zhuǎn)入受體菌，擴(kuò)增為cDNA文庫(kù)。然后，采用適當(dāng)?shù)姆椒◤腸DNA文庫(kù)巾篩選出目的基同。五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(PCR)(polymerasechainreaction)

如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從基因組DNA或cDNA中獲得目的基因，可不必要經(jīng)過復(fù)雜的DNA文庫(kù)構(gòu)建過程。PCR是70年代中期創(chuàng)立的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)也可以當(dāng)作一項(xiàng)極其重要的酶促合成DNA技術(shù)，PCR又稱為無細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，它可將極微量的靶DNA持異地?cái)U(kuò)增上百萬倍。PCR反應(yīng)系統(tǒng)包括含有目的基因或序列的DNA模板，對(duì)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，一對(duì)脫氧寡核苷酸引物、DNA合成所需要的4種脫氧核苷三磷酸以及保證聚合酶催化反應(yīng)的Mg2+及緩沖液等。人工合成引物的序列設(shè)計(jì)是PCR成功的關(guān)鍵，一般兩條引物的序列反應(yīng)分別與欲獲得的雙鏈DNA兩條鏈3’端的序列互補(bǔ)。先升高溫度使模板DNA變性、雙鏈分開；再降低溫度退火使引物與模板DNA配對(duì)互補(bǔ)結(jié)合；然后升溫到聚合酶反應(yīng)適宜的溫度，此時(shí)在聚合酶催化下，從引物3’羥基端開始，與模板DNA上的堿基配對(duì)逐個(gè)加上核苷酸，合成新的DNA鏈。其后再按高溫變性、低溫退火、適溫合成三步反復(fù)循環(huán)，新合成的DNA在下一循環(huán)中又作為模板使用.

第五節(jié)分子克隆的建立和目的基因的表達(dá)一、目的基因與載體的連接將目的基因或序列插入載體，主要靠DNA連接酶和雙鏈DNA粘末端單鏈序列互補(bǔ)結(jié)合的配合使用。有以下主要的方式。1、粘性末端連接目的基因兩端有與載體上相同的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，則同一限制酶切開產(chǎn)生的粘末端，在降低溫度退火時(shí)，能重新互補(bǔ)結(jié)合，在DNA連接酶催化下，目的基因就與載體DNA鏈相連接。不同的限制性內(nèi)切酶切，如果產(chǎn)生的DNA的粘末端相同，也同樣可用此法連接。如果在連接的兩個(gè)DNA片段沒有能互補(bǔ)的粘性末端，可用末湍核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氨單核苷酸添加DNA的3’末端.

2、平末端連接

T4DNA連接酶也能催化限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生DNA平末端的連接。如果目的序列和載體上沒有相同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可供利用，用不同的限制性內(nèi)切酶切割后的粘性末端不能互補(bǔ)結(jié)合，則可用適當(dāng)?shù)拿笇NA突出的末端削平或補(bǔ)齊成平末端，再用T4DNA連接酶連接，但平末端連接要比粘性末端連接的效率低得多。

二、基因序列導(dǎo)入細(xì)胞目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì)胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。1、轉(zhuǎn)化由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。但DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4℃轉(zhuǎn)入42℃作短時(shí)間處理，質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌；用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔轉(zhuǎn)化法。2、感染噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染。用經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖。感染的效率很高，但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。3、轉(zhuǎn)染重組的噬菌體DNA也可象質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2，電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱為轉(zhuǎn)染。三、目的基因序列克隆的篩選與鑒定目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導(dǎo)入細(xì)胞的效率都不是百分之百的，因而最后生長(zhǎng)繁殖出來的細(xì)胞并不同都帶有目的序列。一般一個(gè)載體只攜帶某一段外源DNA，一個(gè)細(xì)胞只接受一個(gè)重組DNA分子。最后培養(yǎng)出來的細(xì)胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體。將目的重組體篩選出來就等于獲得了目的序列的克隆，所以篩選是基因克隆的重要步驟。在構(gòu)建載體，選擇宿主細(xì)胞、設(shè)計(jì)分子克隆方案時(shí)都必須仔細(xì)考慮篩選的問題。

1、根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選

最常見的載體攜帶的標(biāo)志是抗藥性標(biāo)志，

2、核酸雜交法利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)的菌落復(fù)印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標(biāo)記，結(jié)合了放射性核酸探針的菌落集團(tuán)可用放射性自顯影法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標(biāo)記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。

3、PCR法

PCR技術(shù)的出現(xiàn)給克隆的篩選增加了一個(gè)新手段。如果已知目的序列的長(zhǎng)度和兩端的序列，則可以設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以轉(zhuǎn)化細(xì)胞所得的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化細(xì)胞就可能含有目的的序列。4、免疫學(xué)方法利用特定抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異性結(jié)合的作用進(jìn)行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)指示含有目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因而要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后能夠表達(dá)出其編碼產(chǎn)物?？贵w可用特定的酶常用過氧化物酶、堿性磷酸酶等標(biāo)記，結(jié)合酶標(biāo)抗體處，酶可催化特定的底物分解而呈現(xiàn)顏色，從而指示出含有目的的基因的細(xì)胞集落位置。免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于從大量轉(zhuǎn)化細(xì)胞集合體中篩選很少幾個(gè)含目的基因的細(xì)胞克隆。5、DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析這是在上述篩選后的進(jìn)一步分析。目的序列插入載體會(huì)使載體DNA限制性酶圖譜發(fā)生變化，例如一個(gè)長(zhǎng)600bp的目的序列利用它兩端的EooR